人胎儿血红蛋白(HbF)胶体金免疫层析快速诊断试条的研制

摘要

背景与目的
　　 产前诊断又称宫内诊断或出生前诊断,是近30年发展起来的一个新领域,是指直接或间接地对孕期胎儿情况进行检测,继而采取一些必要的措施,防止严重遗传病,先天性畸形和智力障碍患儿的出生,提高人口素质。产前诊断是实现优生的重要措施之一。
　　 产前诊断的技术根据取材方法不同,分为创伤性产前诊断与非创伤性产前诊断。就现阶段而言,创伤性产前诊断仍为临床应用最广的诊断方法,包括羊膜腔穿刺、绒毛活检、胎儿脐带血穿刺及胎儿镜检查。其中胎儿脐带血穿刺获取纯胎血具有其他方法无法比拟的优势,为胎儿宫内诊断和治疗提供了更为广阔的发展前途,临床应用广泛。
　　 纯胎血(脐血)在产前诊断、优生学及胎儿生物学研究中具有广泛作用,对胎儿染色体、胎儿血液、免疫及内分泌系统疾病,遗传代谢缺陷和胎儿感染等疾病有诊断价值。但是如果由于各种因为(如胎儿体位、穿刺者技术差异等)导致误穿,使标本出现母血污染或混入其它非脐血成分,则不能进行下一步的各项检测。目前,临床上用于鉴定脐血的方法包括琼脂糖血红蛋白电泳法、Kleihaure染色法及抗碱变性试验。上述方法都需要送往相关专业的实验室使用专用仪器和试剂进行检测,费时费力。因而,能否在穿刺术中快速地对所采集的样本进行脐血鉴定具有重要的现实意义。
　　 血红蛋白是一种结合蛋白,由血红素和珠蛋白构成。血红素由原卟啉与亚铁原子组成,每一个珠蛋白分子有二对肽链,一对是类α珠蛋白链,由141个氨基酸残基构成,有α、ζ两种；另一对是类β链,有β、γ、δ、及ε四种。在人体不同发育阶段,血红蛋白的组成各不相同。胚胎早期先合成ζ链和ε链,形成Hb Gower I(ζ2ε2),同时或稍后合成α链和γ链,形成Hb Gower Ⅱ(α2ε2)和Hb Portland(ζ2γ2)；12周时ζ链和ε链逐渐消失,γ链迅速增加,β链开始合成,血红蛋白以胎儿血红蛋白(fetalhemoglobin,HbF,α2γ2)为主；妊娠末期和出生以后,γ链迅速降低,β链迅速增加,血红蛋白以HbA(α2β2)为主。
　　 脐血管穿刺的最佳时间为:妊娠20～24周,而在这一时期,胎儿血中HbF含量很高,约占血红蛋白总量的90％,HbA仅占5～10％,随后HbA的合成增加,至出生时HbA约占30％,HbF约占70％,HbA2<1％。出生后HbF迅速为HbA所代替,1岁时HbF不超过5％,至2岁后不超过2％。
　　 本研究拟开发一种能在脐血管穿刺术中快速、有效地诊断样品是否为脐血的HbF胶体金免疫层析快速诊断试条。首先,我们对胎儿血红蛋白(HbF)进行纯化,获得高纯度、具有空间表位的胎儿血红蛋白抗原分子,用以制备人胎儿血红蛋白单克隆抗体。筛选、配对建立反应模式,用以制备具有高灵敏度和高精确度的HbF胶体金免疫层析快速诊断试纸条。
　　 设计与方法
　　 本研究包括三部分内容:(1)胎儿血红蛋白的提取、纯化及免疫活性鉴定；(2)抗胎儿血红蛋白单克隆抗体的制备及鉴定；(3)胶体金免疫层析法检测胎儿血红蛋白。
　　 第一,首先采用生理盐水洗涤、四氯化碳萃取得到粗提胎儿血红蛋白,再经sephadexG50凝胶层析柱层析法纯化。采用SDS-PAGE电泳鉴定纯化后胎儿血红蛋白纯度及Western blot鉴定其免疫活性。第二,用四氯化碳萃取法粗提的胎儿血红蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,融合细胞用HAT培养基作选择性培养。用纯化后的胎儿血红蛋白(HbF)作抗原,采用间接ELISA法对融合的杂交瘤克隆进行筛选,对筛选出的阳性克隆及时进行亚克隆,对有意义的细胞株及早冻存。最后采用小鼠腹腔接种法生产阳性杂交瘤细胞株的腹水,一周后收集腹水并对腹水中的单克隆抗体的性质、效价、特异性进行鉴定。第三,采用proteinG亲和层析法和饱和硫酸铵法纯化腹水,利用时间分辨荧光免疫分析法筛选最佳单克隆抗体配伍对,采用双抗体夹心法建立诊断胎儿血红蛋白的GICA法(胶体金免疫层析法,Gold-immunochromatography assay)。
　　 结果与讨论
　　 采用生理盐水洗涤、四氯化碳萃取得到粗提胎儿血红蛋白,再经sephadexG50凝胶层析柱层析法纯化,获得高纯度、具有空间表位的胎儿血红蛋白抗原分子。纯化后的胎儿血红蛋白经SDS-PAGE电泳鉴定纯化蛋白杂带消失,蛋白单体分子量约为16kDa,与胎儿血红蛋白单体相对分子质量16kDa基本一致,纯度为95％,浓度为800μg/ml。同时应用绵羊抗人胎儿血红蛋白抗体(此抗体只与HbF反应,与HbA不反应)对纯化前和纯化后的胎儿血红蛋白进行蛋白质印迹检查,结果显示纯化后的胎儿血红蛋白在约16kDa处呈现出条带,表明纯化后的HbF具有良好的抗原性。
　　 采用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株,获得6株能分泌高效价和高特异性的抗胎儿血红蛋白(HbF)单克隆抗体的杂交瘤细胞株。Westernblot鉴定该单克隆抗体只与胎儿血红蛋白(HbF)反应,不与成人血红蛋白(HbA)反应,具有高度特异性；Ig类与亚类鉴定结果均为IgG1；6株单克隆抗体腹水的ELISA效价为1:8000～1:16000,从而可为胎儿血红蛋白免疫胶体金快速诊断试纸条的研制提供抗体。
　　 采用proteinG亲和层析法和饱和硫酸铵法纯化6株单克隆抗体。采用proteinG亲和层析法纯化后的单克隆抗体经SDS-PAGE电泳鉴定,结果显示杂蛋白消失,获得了较高纯度的抗体,分别在约55kDa和25kDa处出现明显条带,为单克隆抗体的重链和轻链；采用饱和硫酸铵法纯化后的单克隆抗体经SDS-PAGE电泳鉴定,结果显示杂蛋白没有完全消失,但是腹水中主要的杂蛋白(白蛋白,分子量约66kDa)基本去除,分别在约55kDa和25kDa处也出现较明显条带,为单克隆抗体的重链和轻链。纯化后的单克隆抗体利用时间分辨荧光免疫分析法筛选最佳配伍对,建立诊断胎儿血红蛋白的GICA法,结果显示以5G11包被抗体,5C12标记抗体和以5H8为包被抗体,5C12标记抗体为GICA较适合的反应模式。用制备的胶体金免疫层析试纸条对胎儿脐血和母血进行检测,结果显示以5G11为包被抗体,5C12为标记抗体制成的胶体金免疫层析试纸条对胎儿纯脐血(HbF82.6～87.6％)、母胎混合血(HbF78.8～21.9％)、母血以及血清(HbF=0)进行检测。结果显示本研究所研发的试纸条不仅可以用于快速初步判断样本是否符合纯脐血或纯母血,而且可以鉴别出一定混合比例的母胎混合样本,达到了临床上目前采用的血红蛋白电泳鉴定法的鉴别水准,而且简便快速,只要试纸条没有呈现强阳性反应,尤其是出现弱阳性或阴性反应,就说明所取样品一定不是纯脐血,需要当场重新穿刺。
　　 虽然采用的具体实验条件仍有待进一步优化,多项已检测指标亦需要在后续实验中进行长期验证,但本研究目前所获得的初步结果已足以证实以胎儿血红蛋白作为抗原制备单克隆抗体,进而制备胶体金免疫层析快速诊断试纸的方法是切实可行的,并为下一步开发出快速诊断胎血的胶体金免疫层析试纸条奠定了坚实的基础。

目录

文摘

英文文摘

第1章 引言

第2章 胎儿血红蛋白的提取、纯化及免疫活性鉴定

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 结果

2.4 讨论

第3章 抗胎儿血红蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果

3.4 讨论

第4章 胶体金免疫层析法检测胎儿血红蛋白

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 结果

4.4 讨论

本研究的优缺点

展望与下一步研究计划

第5章 全文小结

第6章 参考文献

附录 中英文对照词缩略表

攻读硕士学位期间发表的论文

致谢

统计学证明