一种从白贝中提取具有抗氧化和护肝作用的白贝酸性多糖的方法

摘要

本发明公开了一种从白贝中提取具有抗氧化和护肝作用的白贝酸性多糖的方法，以抗氧化或护肝活性为依据，将水提醇沉法和Sevag去蛋白法相结合，首次从白贝中提取得到白贝酸性多糖，本发明中的提取工艺步骤简单，操作条件温和且要求低，对操作设备无腐蚀，环保，且无副产物产生，生产成本低，制得的白贝多糖具有良好的抗氧化和护肝活性，为制备抗氧化/护肝药物或保健品提供了新的选择。

说明书

技术领域

本发明涉及一种贝类多糖的方法，具体涉及一种从白贝中提取具有抗氧化和护肝作用的白贝酸性多糖的方法。

背景技术

白贝（Monetaria> Linnaeus），一种可食用的贝类，广泛存在于我国南海海域。白贝最早记载于《神农本草经》，具有清热明目、利尿退翳等功效，现代科学研究证明，白贝富含多种营养成分，如多糖、蛋白质和微量元素等，其中，多糖具有多方面的保健功能，如抗氧化、抗菌、抗癌等，且白贝的生物功效大多与多糖有关。

目前有关白贝的研究报道并不多见，对白贝多糖及其活性的研究更是较为薄弱。先有的科学研究较多集中于采用酸法、碱法或酶解法从贻贝、泥螺等其它贝类中提取多糖，而酶提取技术因酶的专一性易受到限制，提取的技术条件更为严格，分解提取液中易掺入其它非目的产物，后续需要新增其它分离步骤方能得到高纯度的多糖，酸法和碱法不仅容易对操作设备产生腐蚀，增加生产成本，而且容易破坏白贝多糖活性。

另外，目前对多糖的活性研究主要方法为先提取纯化粗多糖，进一步分离得到各个组分，再进行活性检测；该方法不确定因素较多，活性多糖成分在分离过程中易丢失，且提取分离得到的贝类多糖不一定活性，导致后续各个组分的分离纯化工作没有导向性，存在物力、人力、财力等资源浪费的问题。

基于此，本发明以抗氧化或护肝活性为依据，将水提醇沉法与Sevag去蛋白法相结合，以获得一种具有抗氧化和护肝活性的高纯度白贝多糖（简称MMP）。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种从白贝中提取具有抗氧化和护肝作用的白贝酸性多糖的方法，利用水提醇沉法提取活性多糖，工艺简单，无副产物产生，且生产成本低。

本发明通过以下技术方案实现：

一种从白贝中提取具有抗氧化和护肝作用的白贝酸性多糖的方法，包括以下步骤：

a、鲜活白贝清洗干净，吐沙过夜，去除外壳，取白贝肉，置于烘箱中烘干后粉碎，得白贝肉粉；

b、将步骤a得到的白贝肉粉经无水乙醇脱脂后用沸水提取，过滤，取滤液，反复沸水提取2~3次后，在所得滤液中加入乙醇沉淀，过滤，取沉淀物，用水溶解，冷冻干燥即得白贝粗多糖；

c、取步骤b得到的白贝粗多糖，用去离子水溶解充分后，加入Sevag试剂去蛋白，剧烈震荡，静置，离心去蛋白，取清液，重复去蛋白操作2~3次后，将所得的溶液浓缩；

d、在步骤c得到的浓缩液中加入无水乙醇，震荡，静置后离心，取沉淀物，所得沉淀物置于烘箱烘干，即得白贝酸性多糖。

优选地，步骤a中的烘箱温度为50~60℃。

优选地，步骤b中的沸水提取温度为60~65℃，提取时间为2~4h.

优选地，步骤c中去离子水与白贝粗多糖的体积比为10:1~15:1, 去离子水溶解后的白贝粗多糖与Sevag试剂的物料比为4:1~6:1，剧烈震荡时间为30~40 min，静置时间为10~15min，离心速率为4000~5000 rpm，离心时间为10~15 min。

优选地，步骤d中浓缩液与无水乙醇的体积比为1:8~1:10，震荡时间为30~40 min，静置时间为10~12h，离心速率为4000~5000 rpm，离心时间为10~15 min，烘箱温度为50~60℃。

优选地，白贝酸性多糖中甘露糖、鼠李糖含量大于90%。白贝酸性多糖中，糖单元比大致为甘露糖：鼠李糖=3:1。

优选地，白贝酸性多糖分子量为414.4kDa。

优选地，白贝酸性多糖制成口服制剂或针剂使用。

本发明有如下优点：

1. 本发明采用水提取法，首次从白贝中分离得到白贝多糖活性物质，改变了传统工艺中酸液、碱液或酶解的提取方式，步骤简单，操作条件温和且要求低，对操作设备无腐蚀，环保，且无副产物产生。

2. 本发明首次提出以抗氧化和护肝活性为导向的白贝多糖制备方法，增强目标性，避免活性成分的损失，减少无活性组分的分离，降低了生产成本。

3. 本发明制得的白贝多糖活性组分具有较强的护肝活性，与模型组相比，白贝多糖活性组分对AST和ALT有明显的抑制作用，并得出水溶性白贝多糖是白贝发挥护肝活性的物质基础。

4. 本发明首次开发了白贝抗氧化和护肝活性的新功效，扩展了白贝的新用途，且无明显的副作用。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为各标准单糖鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖的气相色谱图

图2为白贝多糖的气相色谱图

图3位白贝多糖的红外光谱图

图4为白贝多糖的清除超氧阴离子能力图

图5为白贝多糖的清除ABTS自由基能力图。

具体实施方式

为使本领域普通技术人员充分理解本发明的技术方案和有益效果，以下结合附图及具体实施例进一步说明。此处实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

a、鲜活白贝5kg清洗干净，吐沙过夜，去除外壳，取白贝肉，置于50℃烘箱中烘干后粉碎，得白贝肉粉100g；

b、将步骤a得到的100g白贝肉粉与1L无水乙醇脱脂混合后，60℃下，水浴3h，并不断搅拌，脱脂后过滤得滤渣80g；将滤渣用800ml60℃沸水提取2h，过滤，取滤液，所得滤渣反复沸水提取2次后，合并得到的滤液并浓缩，在浓缩液中加入2L无水乙醇沉淀，过滤，取沉淀物，用50ml水溶解，冷冻干燥即得白贝粗多糖34.6g；

c、取步骤b得到的白贝粗多糖，用350ml倍去离子水溶解充分后，加入Sevag试剂（氯仿：丁醇=5:1）去蛋白，剧烈震荡30 min，静置，4000 rpm下离心10min去蛋白，取清液，重复去蛋白操作2次后，将所得的溶液浓缩至100ml；

d、在步骤c得到的浓缩液中加入800ml无水乙醇，震荡30 min，静置10 h后4000 rpm下离心10 min，取沉淀物，所得沉淀物置于60℃烘箱烘干，即得白贝酸性多糖12.4g，硫酸-苯酚法测定总糖含量为91%。

实施例2

a、鲜活白贝5kg清洗干净，吐沙过夜，去除外壳，取白贝肉，置于55℃烘箱中烘干后粉碎，得白贝肉粉100g；

b、将步骤a得到的100g白贝肉粉与1L无水乙醇脱脂混合后，62℃下，水浴3.5h，并不断搅拌，脱脂后过滤得滤渣82g；将滤渣用800ml62℃沸水提取3h，过滤，取滤液，所得滤渣反复沸水提取2次后，合并得到的滤液并浓缩，在浓缩液中加入2L无水乙醇沉淀，过滤，取沉淀物，用50ml水溶解，冷冻干燥即得白贝粗多糖35.2g；

c、取步骤b得到的白贝粗多糖，用450ml倍去离子水溶解充分后，加入100ml Sevag试剂（氯仿：丁醇=5:1）去蛋白，剧烈震荡35 min，静置，4500 rpm下离心15min去蛋白，取清液，重复去蛋白操作2次后，将所得的溶液浓缩至100ml；

d、在步骤c得到的浓缩液中加入900ml无水乙醇，震荡35min，静置11h后4500 rpm下离心15 min，取沉淀物，所得沉淀物置于55℃烘箱烘干，即得白贝酸性多糖13.5g，硫酸-苯酚法测定总糖含量为93.8%。

实施例3

a、鲜活白贝5kg清洗干净，吐沙过夜，去除外壳，取白贝肉，置于60℃烘箱中烘干后粉碎，得白贝肉粉100g；

b、将步骤a得到的100g白贝肉粉与1L无水乙醇脱脂混合后，65℃下，水浴4小时，并不断搅拌，脱脂后过滤得滤渣85g；将滤渣用800ml65℃沸水提取4h，过滤，取滤液，所得滤渣反复沸水提取2次后，合并得到的滤液并浓缩，在浓缩液中加入2L无水乙醇沉淀，过滤，取沉淀物，用50ml水溶解，冷冻干燥即得白贝粗多糖36g；

c、取步骤b得到的白贝粗多糖，用540ml倍去离子水溶解充分后，加入98mlSevag试剂（氯仿：丁醇=5:1）去蛋白，剧烈震荡40min，静置，5000rpm下离心15min去蛋白，取清液，重复去蛋白操作3次后，将所得的溶液浓缩至100ml；

d、在步骤c得到的浓缩液中加入1L无水乙醇，震荡40 min，静置12h后5000 rpm下离心15 min，取沉淀物，所得沉淀物置于50℃烘箱烘干，即得白贝酸性多糖13.8g，硫酸-苯酚法测定总糖含量为92.4%。

对比例1

a、鲜活白贝5kg清洗干净，吐沙过夜，去除外壳，取白贝肉，置于60℃烘箱中烘干后粉碎，得白贝肉粉100g；

b、将步骤a得到的100g白贝肉粉溶解于2L的去离子水中，加入3g 1%木瓜蛋白酶，50℃、pH5.0条件下酶解60min，将水提液置于90℃水浴中10min使酶灭活，冷却至室温，4000 r/min离心10min，取上清液浓缩，加入2L无水乙醇沉淀，过滤，取沉淀物，用50ml水溶解，冷冻干燥即得白贝粗多糖34g；

c、取步骤b得到的白贝粗多糖，用350ml倍去离子水溶解充分后，加入Sevag试剂（氯仿：丁醇=5:1）去蛋白，剧烈震荡30 min，静置，4000 rpm下离心10min去蛋白，取清液，重复去蛋白操作2次后，将所得的溶液浓缩至100ml；

d、在步骤c得到的浓缩液中加入800ml无水乙醇，震荡30 min，静置10 h后4000 rpm下离心10 min，取沉淀物，所得沉淀物置于60℃烘箱烘干，即得白贝酸性多糖12.2g，硫酸-苯酚法测定总糖含量为86.7%。

对比例2

a、鲜活白贝5kg清洗干净，吐沙过夜，去除外壳，取白贝肉，置于60℃烘箱中烘干后粉碎，得白贝肉粉100g；

b、将步骤a得到的100g白贝肉粉溶解于20倍的酒石酸水溶液（pH=3.8），60℃下水浴提取2次，每次3小时，合并提取液，浓缩后加入10倍量无水乙醇溶液静置12h，4000r/min离心10min取沉淀，用50ml水溶解，冷冻干燥即得白贝粗多糖33g；

c、取步骤b得到的白贝粗多糖，用350ml倍去离子水溶解充分后，加入Sevag试剂（氯仿：丁醇=5:1）去蛋白，剧烈震荡30 min，静置，4000 rpm下离心10min去蛋白，取清液，重复去蛋白操作2次后，将所得的溶液浓缩至100ml；

d、在步骤c得到的浓缩液中加入800ml无水乙醇，震荡30 min，静置10 h后4000 rpm下离心10 min，取沉淀物，所得沉淀物置于60℃烘箱烘干，即得白贝酸性多糖12.0g，硫酸-苯酚法测定总糖含量为75.8%。

对比例3

a、鲜活白贝5kg清洗干净，吐沙过夜，去除外壳，取白贝肉，置于60℃烘箱中烘干后粉碎，得白贝肉粉100g；

b、将步骤a得到的100g白贝肉粉溶解于20倍的碳酸氢钠水溶液（pH=11.0），60℃下水浴提取2次，每次3小时，合并提取液，浓缩后加入10倍量无水乙醇溶液静置12h，4000r/min离心10min取沉淀，用50ml水溶解，冷冻干燥即得白贝粗多糖33g；

c、取步骤b得到的白贝粗多糖，用350ml倍去离子水溶解充分后，加入Sevag试剂（氯仿：丁醇=5:1）去蛋白，剧烈震荡30 min，静置，4000 rpm下离心10min去蛋白，取清液，重复去蛋白操作2次后，将所得的溶液浓缩至100ml；

d、在步骤c得到的浓缩液中加入800ml无水乙醇，震荡30 min，静置10 h后4000 rpm下离心10 min，取沉淀物，所得沉淀物置于60℃烘箱烘干，即得白贝酸性多糖11.5g，硫酸-苯酚法测定总糖含量为70.4%。

活性多糖的生物功效与抗氧化、护肝活性呈一定的相关性，即总糖含量高，生物活性好。

上述对比例1-3分别为酶、酸、碱提取法，得到的总糖含量均明显低于本发明实施例1-3。原因在于，酶提取法易掺入其它非目的产物，导致总糖含量降低；酸、碱提取法存在糖苷键断裂的可能性，是导致总糖含量降低的原因之一。

性能测定

1、白贝多糖的表征

采用硫酸-苯酚法测定总糖含量、采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量、采用硫酸-间羟联苯法测定糖醛酸含量、采用氯化钡-明胶比色法测定硫酸基含量；结果见表1。由表1可以看出，白贝多糖总糖、蛋白质含量分别为92.4%、2.5%。表明白贝原料经过热水提、醇沉等工艺所得的产品多糖为主要成分。由于白贝多糖属于动物性多糖，含有一定量的糖蛋白，采用Sevag法只能除去游离蛋白质，因而白贝多糖的蛋白质可能是结合的糖蛋白，由糖醛酸、硫酸基含量测定结果可以看出，白贝多糖为酸性多糖。

表1白贝多糖的化学组成（n = 5）

样品总糖(%)硫酸基(%)蛋白质(%)糖醛酸(%)白贝多糖92.4±1.43.0±0.22.5±0.31.2±0.2

2、白贝多糖的气相色谱测定

使用安捷伦7890A气相色谱仪、5%苯甲基硅氧烷毛细管色谱柱（HP-5, 0.25 μm, 30 m× 0.32 mm）、火焰离子检测器（FID）进行分析。操作条件如下：色谱柱升温程序为120℃保持3min，以3℃速度升温至210℃，210℃保持4min。色谱柱流速为1.0mL/min。进样口温度为250℃。检测器温度为280℃。进样体积为5μL。氮气、氢气、空气的流速分别为25 mL/min、30mL/min、400mL/min。同时，各标准单糖鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖相同条件下气相色谱分析。

由图1可知，标准品岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、甘露糖的保留时间分别为26.9min、26.4min、27.3min、35.8min、36.7min、25.8 min、35.2min，由图2可知，本发明样品的气相测定中，出现2个信号极强的色谱峰，保留时间分别为25.7min、35.1min，分别对应于标准品鼠李糖和甘露糖的保留时间，由此可知，本发明中的白贝多糖含有鼠李糖和甘露糖两种糖单元。

3、白贝多糖的红外光谱测定

对白贝多糖采用红外光谱表征，结果见图3。由图3可知，白贝多糖的3328>-1吸收峰为O-H的伸缩振动，2931>-1吸收峰为C-H的伸缩振动及弯曲振动，1644>-1吸收峰为C=O的伸缩振动，1542>-1处吸收为糖醛酸的特征峰，1151>-1吸收峰为S=O的伸缩振动。

4、白贝多糖（MMP）的抗氧化实验

4.1清除超氧阴离子自由基能力的测定

取5mLEP管若干支，设两组对照；每管中分别加入50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)1.5mL，130mM甲硫氨酸溶液0.3mL，750μMNBT溶液0.3mL，20μM EDTA-2Na溶液0.3mL，20μM核黄素溶液0.3mL，各浓度样液0.2mL，双蒸水0.5mL，两组对照管以溶剂(纯水)代替提取液。将反应体系中各试剂混匀后，一组对照管用铝箔包裹完全遮光，另一组对照管及反应管同时置于日光灯下反应30min，反应温度为25°C。反应结束后，迅速将全部EP管用铝箔完全遮光。在560nm下，以遮光对照组作为空白调零管，测定各管的吸光度。

注：OD_sample、OD_blank分别是样液与空白样品(以溶剂代替样品提取液)的吸光值。IC₅₀值通过线性回归得到。

试验结果如图4所示，白贝多糖清除超氧阴离子自由基的能力与浓度成正相关，当白贝多糖浓度为4.98mg/mL时，超氧阴离子自由基清除率达到77.19%，但弱于阳性对照Vc，由此可见，白贝多糖清除超氧阴离子自由基的能力与其结构中酸性基团有一定的关系。

4.2 清除ABTS^.+自由基能力的测定

称取48.01mgABTS(7mM)溶于12.5mLRO水，8.27mg过硫酸钾(2.45mM) 溶于12.5mLRO水，二者混匀后于室温条件下避光放置12h；后用磷酸缓冲液溶液(pH7.4，0.05 M)稀释50倍成ABTS工作液。量取不同浓度的样液各0.2mL，后加入3mL的ABTS工作液，充分混匀后，避光放置30min后于734nm处测定吸光度；根据吸光值计算样品对ABTS^.+自由基的清除作用。

注：OD_样品：样液加ABTS工作液；OD_空白：样液加磷酸缓冲液；OD_对照：ABTS工作液加磷酸缓冲液；IC₅₀通过线性回归得到。

试验结果如图5所示，白贝多糖清除ABTS自由基的能力随样品浓度的增大而增强，当白贝多糖浓度为4.98mg/mL时，ABTS自由基清除率达到58.54%，但弱于阳性对照Vc，由此可见，白贝多糖清除ABTS自由基的能力与其多糖组成及结构有一定的关系，如蛋白含量、硫酸基含量等。

5、白贝多糖的护肝实验

5.1 细胞毒性试验

细胞采用：RAW264.7 Cell，分为空白组、阳性组、白贝多糖高浓度组、中浓度组、低浓度组；当细胞存活率≥90%的条件下即判断为无毒性，结果见表2。

表2 细胞毒实验吸光度及存活率

组别N吸光度存活率空白组62.43±0.19100±12.72脂多糖组(1μg/mL)62.59±0.18103.82±5.1样品高(100μg/mL)62.18±0.2399.68±8.23样品中(50μg/mL)62.17±0.1897.77±12.44样品低(20μg/mL)62.23±0.1696.74±9.27

由表2可知，白贝多糖没有表现出细胞毒性，对人体无毒副作用。

5.2 CCl₄引起的小鼠急性肝损伤试验

取60只小鼠随机分成6组，空白组、模型组、阳性对照组、白贝多糖高浓度组、中浓度组及低浓度组各10只。用橄榄油配制CCl₄浓度为1%，按照10mL/Kg体重腹腔注射。灌胃给药1周后，模型组和样品组（高、中、低浓度）小鼠腹腔内注射CCl₄油（0.1%）造模，18h后眼眶取血，分离血清，检测肝功能指标AST级ALT。结果见表3。

表3 白贝多糖急性肝损伤试验

组别NAST(U/L)ALT(U/L)空白组1030.82±2.36**35.16±6.47**模型组10150.34±13.54438.92±69.81对照组(500mg/Kg)1096.86±15.44**254.11±28.79**样品高(1000mg/Kg)1085.51±10.67**194.27±39.24**样品中(750mg/Kg)1089.94±12.53**213.43±28.60**样品低(250mg/Kg)10102.62±9.32**275.38±38.62**

注：与模型组相比*p＜0.05，**p＜0.01。

由表3可知，白贝多糖的三个剂量均能降低AST活力，与模型组相比，具有显著差异（p＜0.01）；同时，白贝多糖的三个剂量均能降低ALT活力，与模型组相比，具有显著差异（p＜0.01）。由此可见，白贝多糖对急性肝损伤有显著的保护作用，具有明显的护肝活性。

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