一种基于液液萃取‑液相色谱‑串联质谱同时测定植物油脂中黄曲霉毒素和香味剂的方法

摘要

本发明公开了一种基于液液萃取‑液相色谱‑串联质谱同时测定植物油脂中黄曲霉毒素和香味剂的方法，本发明的方法能够同时测定植物油中黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素M1、黄曲霉毒素M2、香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素，样品经乙腈溶剂提取，超声辅助提取，提取溶液经正己烷净化后，在梯度条件下分析，目标分析物在多反应监测模式下以保留时间和离子对信息比较进行定性分析，外标法定量。本方法的优点：所需样品量和试剂量少，分析速度快、灵敏度高、重现性好，能同时实现黄曲霉毒素和常用香味剂的检测，为评价植物油脂样品的质量安全提供了新的检测方法。

说明书

技术领域

本发明涉及了一种同时测定植物油脂中6种黄曲霉毒素黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)、黄曲霉毒素G2(AFG2)、黄曲霉毒素M1(AFM1)和黄曲霉毒素M2(AFM2)；3种香味剂香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的方法，属于面向食品监测技术领域，具体涉及基于液液萃取-液相色谱-串联质谱正离子模式测定方法。

背景技术

食用植物油包括菜籽油、大豆油、玉米油、花生油、橄榄油、芝麻油、葵花籽油等，是日常生活的必需品，人类每天都会以不同的形式摄入一定量的植物油，随着现代生活水平的提高，人们不仅对植物油的质量、营养、品味等方面的要求越来越高，而且针对植物油的食用安全也日益关注。由于农作物种子在存储过程中极易导致黄曲霉毒素产生，鉴于黄曲霉毒素的强致癌性，因此在食用植物油加工过程中是否有黄曲霉毒素残留已引起人们越来越多的关注。此外在品位上，研究表明植物油脂中含有吡嗪类、呋喃类、吡啶类、吡咯类、噻唑类、酚类、酮类和芳香类化合物等天然物质，对植物油的香气贡献很大，我国GB2760-2011《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》明确规定植物油脂中禁止添加任何食用香料，为了避免我国不少商家为了追求最大利益违法添加香料，以至出现“香精大米”和“香精包子”等事件，针对食用植物油开展常用香味剂的检测也逐渐引起人们的重视。

目前，涉及本发明的6种黄曲霉毒素和3种香味剂的检测方法较多，主要包括高效液相色谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱-质谱法、离子色谱法等，其中液相色谱-质谱法因具有高的检测灵敏度日益受到人们的关注。目前针对植物油基质开展6种黄曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2；3种香味剂香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素同时检测的方法在国、内外尚并未见报道。

食用植物油作为最重要的饮食之一，几乎包含在人们的一日三餐中。如果植物油中黄曲霉毒素含量超标或非法添加香味剂，长期食用将会对人体健康产生严重危害，因此建立食用植物油中6种黄曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2；3种香味剂香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的同时检测方法具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的正是基于上述现有技术状况而提供了一种快速、简便、高效，同时测定植物油脂中6种黄曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2；3种香味剂香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的方法。

本发明的技术方案：

一种基于液液萃取-液相色谱-串联质谱同时测定植物油脂中黄曲霉毒素和香味剂的方法，步骤如下：

(1)液液萃取：向待测油脂和空白油脂样品中加入提取溶剂，涡旋震荡、超声和离心，得到上层清液，待净化；

(2)液液分配净化：在上层清液中添加净化熔剂，涡旋振荡，离心后，取下层清液，过微孔滤膜，得待测液和空白基质提取液；

(3)标准溶液配制：首先，将质量比为1的香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素用甲醇溶解并定容，得1.0mg/mL标准储备液，再用乙腈稀释至1.0mg/L混合标准储备液1；

分别配制浓度为0.1mg/L的黄曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1和AFM2标准溶液，为混合标准储备液2；

分别吸取混合标准储备液1和混合标准储备液2，混合；再用空白基质提取液稀释至含香兰素分别为10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、160ng/mL，含黄曲霉毒素AFB1分别为0.1ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL的混合标准系列工作溶液；

(4)定性定量分析：将步骤(2)得到的待测液进入液相色谱-串联质谱仪，采用多反应监测正模式监测，外标法定量；

a)定性分析：利用LC-MS/MS法测定试样和建立标准工作曲线，若待测液中检出的色谱峰的保留时间与相应标准物质色谱峰的保留时间一致，允许偏差小于2.5％；再进一步比较待测样品和标准工作液中浓度接近的各组分定性离子的丰度，偏差不超过表1规定的范围，则判定油脂样品中存在对应的待测样品；

表1定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差

相对离子丰度＞50％20％-50％10％-20％≦10％允许的最大偏差20％25％30％50％

b)定量分析：利用LC-MS/MS法测定混合标准系列工作溶液，得到相应的标准溶液的色谱峰面积，以混合标准工作液的浓度为横坐标，以色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；再以相同条件测定待测样品，得到待测样品的色谱峰面积，根据标准工作曲线得到待测液中各组分的浓度；待测样品中各待测组分的响应值在标准工作曲线的线性响应范围内，如果含量超出范围，则重新取待测样品分析，然后用乙腈稀释到适当浓度后分析；

⑸结果计算：

计算公式：

式(1)中：

X—油脂样品中待测组分的含量，单位为μg/kg；

c—从标准工作曲线中读出的待测样品中各待测组分的浓度，单位为μg/L；

m—油脂样品称取的质量，单位为g；

V—油脂样品溶液定容体积，单位为mL。

所述的液相色谱-串联质谱法测试条件如下：

所述的LC-MS/MS的色谱条件如下：

色谱柱：Agilent XDB C18反相柱，色谱柱规格4.6×50mm，2.7μm；

流动相：A相：水溶液，含0.1％甲酸，B相：甲醇；

梯度洗脱时间：12min；

梯度洗脱程序：0→0.5min，75％A相；0.5→2min，75％→50％A相；2→6min，50％A相；6→7min，50％→10％A相；7→9min，10％A相；9→12min，10％→75％A相；

流速：0.3mL/min；

进样量：2μL；

色谱柱温度：30℃；

所述的LC-MS/MS的质谱条件如下：

离子源：电喷雾离子源；

扫描方式：正离子扫描；

检测方式：多反应监测；

离子化电压：5500V；

雾化气：50-60psi

辅助气：50-60psi

气帘气压力：35psi；

雾化温度：500-550℃。

定性离子对、定量离子对及其他质谱参数见表2。

表2九种化合物的定性离子对、定量离子对和质谱分析参数

*：定量离子

本发明的有益效果在于，基于液液萃取-液相色谱-串联质谱正离子模式建立的植物油脂中6种黄曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1和AFM2；3种香味剂香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的同时检测方法，样品经水和乙腈进行溶剂提取后，再辅以超声提取，提取液经正己烷液液分配净化后，在梯度条件下进行串联质谱分析，9种化合物的平均回收率在87.4％-94.6％之间，检出限：黄曲霉毒素为0.06μg/kg；香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素为10μg/kg。

本发明具有前处理简单、样品及溶剂使用量少、基质干扰小、分析速度快、灵敏度高和重现性好等优点，此外本发明能同时实现黄曲霉毒素和香味剂的分析检测，大大提高检验的时效性，能适用于大批量样品的快速检测，满足日常检测工作的需要。

附图说明

图1为本发明实施例香兰素的二级质谱图(定性和定量离子选择图)。

图2为本发明实施例甲基香兰素的二级质谱图(定性和定量离子选择图)。

图3为本发明实施例乙基香兰素的二级质谱图(定性和定量离子选择图)。

图4为本发明实施例黄曲霉毒素B1的二级质谱图(定性和定量离子选择图)。

图5为本发明实施例黄曲霉毒素B2的二级质谱图(定性和定量离子选择图)。

图6为本发明实施例黄曲霉毒素G1的二级质谱图(定性和定量离子选择图)。

图7为本发明实施例黄曲霉毒素G2的二级质谱图(定性和定量离子选择图)。

图8为本发明实施例黄曲霉毒素M1的二级质谱图(定性和定量离子选择图)。

图9为本发明实施例黄曲霉毒素M2的二级质谱图(定性和定量离子选择图)。

图10为本发明实施例玉米油中6种黄曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1和AFM2；3种香味剂香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素多反应监测(MRM)色谱图。

图11为本发明实施例玉米油中6种黄曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1和AFM2；3种香味剂香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素选择离子流色谱图。

具体实施方式

为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图及以下实施例进一步阐释本发明的技术方案，但不作为对本发明保护范围的限制。

实施例1

⑴液液萃取：称取1g样品，加入2mL乙腈，涡旋振荡30s，在20-25℃下超声处理10min，超声频率为35Khz，10000r/min离心5min后，取上层清液1mL，待净化。

⑵液液分配净化：在1mL上层清液中添加2mL正己烷，涡旋振荡30s，10000r/min离心1min后，取下层清液，过微孔滤膜，待分析。

⑶标准溶液配制：首先，分别准确称取香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素0.1g(精确至0.0001g)，甲醇溶解并定容至100mL容量瓶中，制成1.0mg/mL标准储备液，用乙腈稀释至1.0mg/L混合标准储备液1。分别吸取适量黄曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1和AFM2标准溶液定容至10mL容量瓶中，制成0.1mg/L混合标准储备液2。其次，分别准确吸取标准储备液1和2适量，用上述步骤中空白基质提取液将其稀释为含香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、160ng/mL；含黄曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1和AFM2 0.1ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL的混合标准系列工作溶液。

⑷定性定量分析：将待分析液进入液相色谱-串联质谱仪(LC-MS/MS)，采用多反应监测(MRM)模式监测，外标法定量。定性定量分析具体测试条件如下：

LC-MS/MS色谱条件：色谱柱采用Agilent XDB C18反相柱，色谱柱规格为4.6×50mm，2.7μm；流动相为：A相为水溶液(含0.1％甲酸)，B相为甲醇；梯度洗脱程序：0→0.5min，75％A相；0.5→2min，75％→50％A相；2→6min，50％A相；6→7min，50％→10％A相；7→9min，10％A相；9→12min，10％→75％A相。流速为0.3mL/min；进样量为2μL；色谱柱温度为30℃。

LC-MS/MS的质谱条件：离子源为电喷雾离子源；扫描方式为正离子扫描(ESI+)；检测方式为多反应监测(MRM)；离子化电压(IS)为5500V；雾化气(Gas1)为50psi；辅助气(Gas2)为50psi；气帘气压力(CUR)为35psi；雾化温度(TEM)为500℃。

本发明在进行色谱柱的选择时，分别选用了Waters HSS T3柱(2.1mm×100mm，2.5μm)、Agilent poroshell 120EC C18柱(4.6mm×50mm，2.7μm)、Kinretex F5柱(3.0mm×50mm，2.6μm)、Agilent XDB C18柱(4.6mm×50mm，1.8μm)和Agilent SB C18柱(2.1mm×100mm，1.8μm)五种不同柱填料和不同封端色谱柱。结果表明，在本研究中设定的流动相梯度条件下，9种化合物在五种色谱柱上都有很好的色谱保留行为，综合考虑各待测化合物的峰形、响应、分离度及商品价格，最终选取Agilent XDB C18柱(4.6mm×50mm，1.8μm)色谱柱。

本发明在进行流动相的选择时，考察了甲醇/水体系和乙腈/水体系，并在此基础上进行酸性改性剂的比较，在流动相中添加0.1％甲酸、0.2％甲酸、0.1％乙酸、0.2％乙酸。结果表明在水相中选择添加0.1％的甲酸，有机相选择甲醇时，在梯度洗脱条件下，能够实现6种黄曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1和AFM2；3种香味剂香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素最优的基线分离和最优的质谱信号采集。

本发明在提取溶剂的选择时，因所涉及的九种化合物都易溶于甲醇、乙腈等极性有机试剂，故在样品提取过程中首先选用实验室常用的甲醇和乙腈作为提取溶剂。实验结果表明甲醇和乙腈对九种化合物的提取效率都能够达到85％以上，考虑到甲醇对油脂样品中杂质的提取较乙腈显著，为达到较好的净化效果，本发明确定乙腈作为提取溶剂。

此外，研究显示超声有助于乙腈对九种化合物的提取，超声1min、5min、10min、15min、20min和25min，随着超声时间的延长，乙腈对九种化合物的提取回收率增加，时间到达10min以上时，提取回收率未表现出明显的变化，本发明确定超声辅助提取时间为10min。

本发明实施例中，香兰素和甲基香兰素购自TRC加拿大，乙基香兰素购自USP美国，曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1和AFM2购自SUPELCO美国，上述试剂纯度都大于98％。

⑸结果与分析

a)在选定的色谱和质谱条件下，根据所确定的植物油基质测定系列浓度的标准溶液，以目标物的浓度为横坐标(x)，色谱峰的峰面积为纵坐标(y)，进行回归分析，结果见表3，由表3可见，香兰素和乙基香兰素在10-400μg/L范围内，甲基香兰素在10-200μg/L范围内，AFB1和AFG1在0.1-20μg/L范围内，AFB2在0.1-10μg/L范围内，AFG2、AFM1和AFM2在0.1-8μg/L范围内，具有良好的线性，相关系数r＞0.997。根据国际纯粹和应用化学联合会(IUPAC)对检出限的定义，稀释并检测系列混合标准溶液，计算信噪比(S/N)，以S/N＝3为检出限(LOD)，以S/N＝10为定量限(LOQ)。向不含目标物质的空白样品中定量添加混合标准溶液，经处理后进行检测，三种香味剂的LOD为10μg/kg，方法的LOQ为35μg/kg；黄曲霉毒素的LOD为0.06μg/kg，方法的LOQ为0.2μg/kg。

表3植物油基质中6种黄曲霉毒素和3种香味剂的线性方程、相关系数、线性范围(n＝6)、检出限和定量限

b)选取不含6种黄曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1和AFM2；3种香味剂香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的植物油样品，按照三个浓度水平进行添加回收率和精密度试验，每个水平做6个平行，按照方法规定的操作步骤进行测定，考察方法的平均回收率，见表4。结果表明植物油基质加标平均回收率介于87.4％～94.6％，相对标准偏差(RSD)介于1.7％～4.6％，均满足残留分析要求。

表4植物油中9种化合物的加标回收率及精密度(n＝6)