一种固定化双酶耦合反应生产非天然氨基酸产品的工艺

摘要

本发明公开了一种固定化双酶耦合反应生产非天然氨基酸产品的工艺。以聚乙烯醇、海藻酸钠和卡拉胶为固定化材料，以硼酸‑硼砂‑氯化钙‑碳酸钠体系为交联剂，将具有酰化消旋酶和氨基酰化酶活性的两种基因工程菌按照一定比例混合后共固定化，制备出颗粒状固定化细胞。以乙酰化‑DL‑氨基酸为原料，在生物反应器中双酶耦合反应，高效生产非天然氨基酸系列产品。

说明书

技术领域

本发明涉及一种固定化双酶耦合反应生产非天然氨基酸产品的工艺，属于生物化学中的酶工程技术领域。

背景技术

非天然氨基酸，是众多药物尤其是近十年来众多新药的核心中间体，如左乙拉西坦使用L-2-氨基丁酸，培哚普利使用L-正缬氨酸，氯吡格雷使用L-2-邻氯苯甘氨酸，他塔那非使用D-色氨酸，佐米曲坦使用D-脯氨酸，阿扎那韦、特拉匹韦使用L-2-叔亮氨酸，那格列奈、奥曲肽使用D-苯丙氨酸等。

非天然氨基酸主要的生产手段是利用生物酶技术，利用的酶有氨基酰化酶、青霉素酰化酶、海因酶，脱氢酶，氨基酸氧化酶等。其中氨基酰化酶是主要的方法之一，长期以来用于生产非天然氨基酸。氨基酰化酶有D-氨基酰化酶和L-氨基酰化酶，其中D-氨基酰化酶催化乙酰-D-氨基酸生成D-氨基酸，L-氨基酰化酶催化乙酰-L-氨基酸生成L-氨基酸。在工业上，氨基酰化酶法生产非天然氨基酸的原料为乙酰化-DL-氨基酸，因此转化率只有50%。

专利报道了将酰化消旋酶与氨基酰化酶混合后偶联反应，将DL-乙酰化-DL-氨基酸一步转换为手性氨基酸，转化率达到了100%。该方法的缺点是使用游离细胞法，不便于重复使用，游离细胞容易破碎，产品成本高，产品质量不稳定；如何能够将生物催化剂重复使用、降低催化剂成本是该技术能否工业应用的关键因素，其中固定化酶或者固定化细胞技术是主要的解决途径。

固定化细胞技术作为生物工程新技术，具有成本低、污染小、效率高等优点。目前固定化技术使用的材料有卡拉胶、海藻酸钠、树脂、葡聚糖、聚丙烯酰胺等，固定化细胞材料用于产业化，理论上要求具有以下特点：容易与细胞或者酶快速混合，并快速凝固；尽量低温凝固，以避免酶的活性损失；尽量为颗粒状，便于装入反应器，以及获得较好的反应特性；具有较好的强度硬度等机械性能；具有多孔性，具有良好的传质性能；价格低廉。为了制备具有以上性能的固定化细胞，研究人员通过优化固定化材料和制备工艺、选择优质的交联剂等方式已经推出各类性能不同的固定化细胞。

聚乙烯醇作为一种新型的生物催化剂包埋固定化载体，具有强度 高、化学稳定性好、抗微生物分解性能强、价格低廉等优点，但仍存在以下缺点：1.用于交联聚乙烯醇的溶液酸性较强，会使固定化细胞活性降低；2.具有高粘性，并且与酸反应较慢，会使滴入时间相差不大的两液滴粘连，并附聚成团，不易凝胶成球；3.固定化后酶活保留率低，部分对酸敏感的酶会逐渐失活。

因此研究一种好的复配交联剂体系，已经成为聚乙烯醇为固定化材料酶法生产非天然氨基酸的重要影响因素。

发明内容

为了克服上述缺陷，本发明提供了一种固定化双酶耦合一步法反应生产非天然氨基酸产品的工艺。

其特征在于：以聚乙烯醇、海藻酸钠、卡拉胶的混合物为固定化材料，以硼酸-硼砂-氯化钙-碳酸钠体系为交联剂，将具有氨基酰化酶和酰化消旋酶的基因工程菌混合后共固定化，制备出颗粒状固定化细胞。以乙酰化-DL-氨基酸为原料，在生物反应器中利用双酶耦合反应，一步生产非天然氨基酸系列产品。具体操作工艺如下：

交联剂溶液的配制工艺：

在搅拌容器中加入水，加入一定比例的硼酸，硼砂、氯化钙，碳酸钠，调整pH即得到交联剂溶液。可以根据要求增减部分原料和配比。

细胞共固定化工艺：

取一定量聚乙烯醇加入水溶胀24h，然后加入海藻酸钠和卡拉胶，灭菌锅加热使其充分溶化，趁热搅拌，降温到40～50℃，然后向上述液体中加入预先保温50℃的L-型氨基酰化酶和酰化消旋酶混合菌悬液,搅拌均匀，用注射器吸入，然后滴加到上述硼酸-硼砂-氯化钙-碳酸钠体系的交联剂溶液中，形成一定直径的小球，在交联剂中浸泡3～12h。用生理盐水洗涤，得到L-型氨基酸固定化细胞，用于转化。将上述L-氨基酰化酶更替为D-氨基酰化酶，则制备出D-型氨基酸固定化细胞。

生物催化工艺：

在蒸馏水中加入乙酰化-DL-氨基酸，一般配成0.1-0.2M溶度溶液，用片碱调整PH=7.5，加入上述L-型氨基酸固定化细胞转化，37℃，5-10小时后测定，乙酰化-DL-氨基酸小于0.001%，全部转化（全部转化是指超过99.9%以上的转化，下同）。为L-丙氨酸，经过浓缩以及纯化处理，得到L-氨基酸。

在蒸馏水中加入乙酰化-DL-氨基酸，一般配成0.1-0.2M溶液，用片碱调整PH=7.5，加入上述D-型氨基酸固定化细胞转化，37℃，5-10小时后测定，乙酰化-DL-氨基酸小于0.001%，全部转换为D-氨基酸，经过浓缩以及纯化处理，得到L-氨基酸。

上述固定化材料为聚乙烯醇、海藻酸钠、卡拉胶的混合物，聚乙烯醇材料的浓度为5-15%，优选8-12%。

主料和辅料的重量配比为，聚乙烯醇：海藻酸钠：卡拉胶=100:0.1-0.5:0.2-1.0。

上述交联剂为硼酸-硼砂-氯化钙-碳酸钠体系，交联采取低温交联，交联温度为-10～20℃。

按照上述方法制备的固定化细胞为颗粒状。具有氨基酰化酶和酰化消旋酶活性的菌体按照酶活比例混合后固定化，制备出颗粒状固定化细胞，利用双酶耦合反应，一步生产非天然氨基酸系列产品。

发明有益效果

本发明采用新型聚乙烯醇固定化复配材料，较好地解决了固定化细胞的颗粒度、稳定性以及快速的凝固速度；

本发明采用新型交联剂，近中性环境条件下交联，避免了对酶的破坏。本工艺成功用于固定化氨基酰化酶和酰化消旋酶混合菌体，并通过耦合反应技术，一步生产了非天然氨基酸。

具体实施例

本实施例中使用的分析方法如下：

固定化细胞强度：将固定化小球放入100mL注射器中，施加一定的压力，观察小球的破损情况。

固定化细胞传质度：取数粒固定化小球，放入盛有200mL水的250mL锥形瓶中，加入一滴亚甲基蓝，定时观察颜色渗入固定化小球的情况

固定化细胞溶胀度(%)：取100mL固定化细胞，在0.05M磷酸缓冲液25℃保存24小时，体积的增加量。

固定化细胞酶活保存率：固定化细胞在0.05M磷酸缓冲液，0.1M乙酰-DL-苯丙氨酸浓度下反应5小时后，测定固定化细胞的比活，与初始比活比较，为酶活保存率

固定化细胞颗粒完好率：固定化细胞在0.05M磷酸缓冲液，0.1M乙酰-DL-苯丙氨酸浓度下反应5小时后，剔除破损大于四分之一体积的颗粒后的存留百分比。

成球时间：固定化细胞自注射器滴下，在交联剂溶液中完全硬化的时间。

黏连性：肉眼观察，固定化细胞自注射器滴下，在交联剂溶液中是否互相黏连。

实施例1

(A) 交联剂溶液的配制

在烧瓶中加入800mL水，加入硼酸15克，硼砂15克，混合，然后加入氯化钙10克，碳酸钠50克，测定pH值，用碳酸钠或者硼酸调整pH到7.0，定容到1000mL，混合均匀待用。可以根据要求增减部分原料和配比。

(B) 细胞固定化方法

取10克聚乙烯醇加入90mL水溶胀24h，加入0.2克海藻酸钠和0.2克卡拉胶，灭菌锅加热使其充分溶化，趁热搅拌，降温到40～50℃，然后向上述液体中加入预先保温50℃的氨基酰化酶和酰化消旋酶混合菌悬液取（L-氨基酰化酶酶比活力40umol/g.min，酰化消旋酶酶比活力80umol/g.min）100mL,搅拌均匀。用50 mL的注射器吸入，然后滴加到上述硼酸-硼砂-氯化钙-碳酸钠体系的交联剂溶液中，形成一定直径的小球，在交联剂中浸泡3～12 h。用生理盐水洗涤，得到L-型氨基酸固定化细胞，固定化细胞的比活力为15.5umol/g.min，冰箱保存，用于转化和性能测定。

对上述制备过程以及固定化细胞进一步测定，得到数据如下：固定化颗粒大约3mm，强度较高，成球时间为12小时，传质效果良好，固定化细胞的溶胀度为12%，无黏连性，颗粒完好率95%。固定化细胞酶活保存率91%。

(C) 转化试验方法：

在1L蒸馏水中加入乙酰化-DL-丙氨酸27克，配成0.2M浓度溶液，用片碱调整pH=7.5，加入上述L-型氨基酸固定化细胞50克转化，37℃，10小时后测定，乙酰化-DL-丙氨酸小于0.001%，几乎全部转换为L-丙氨酸，经过浓缩以及纯化处理，得到L-丙氨酸18克。

以DL-乙酰-亮氨酸，DL-乙酰-缬氨酸，DL-乙酰苯丙氨酸，DL-乙酰正亮氨酸为原料，均配备0.2M浓度溶液，用片碱调整pH=7.5，加入上述固定化细胞50克转化，37℃，10小时后测定，乙酰化-DL-氨基酸小于0.001%，全部转换为L-氨基酸。上述原料分别得到L-亮氨酸，L-缬氨酸，L-苯丙氨酸，L-正亮氨酸。

对比实施例1：

取10克聚乙烯醇加入90mL水溶胀24 h，灭菌锅加热使其充分溶化，趁热搅拌，降温到40～50℃，然后加入预先保温50℃的氨基酰化酶和酰化消旋酶混合菌悬液取（L-氨基酰化酶酶比活力40umol/g.min，酰化消旋酶酶比活力80umol/g.min）100mL,搅拌均匀。用50 mL的注射器吸入，然后滴加到硼酸-氯化钙-碳酸钠体系的交联剂溶液(硼酸15g/L，氯化钙10g/L，碳酸钠50g/L)中，形成一定直径的小球，在交联剂中浸泡3～12 h。用生理盐水洗涤，得到L-型氨基酸固定化细胞，测定性能。

分别配置2%，5%，8%，10%, 15%，20%聚乙烯醇浓度重复以上试验，其他条件不变，结果如下：

从实验结果看出，单独聚乙烯醇固定化细胞溶胀率高，成球速度慢，球互相黏连，同时随聚乙烯醇浓度增加，粘度加大，甚至不能够成球。聚乙烯醇浓度以10%合适。

对比实施例2

取10克聚乙烯醇加入90mL水溶胀24 h，加入不同比例海藻酸钠重复试验，其他条件同对比实施例1，结果如下：

实验结果显示：加入海藻酸钠后，小球强度增加，溶胀率降低，容易成球，不黏连，以0.2%最合适。

对比实施例3

取10克聚乙烯醇加入90mL水溶胀24 h，加入不同比例卡拉胶重复试验，其他条件同对比实施例1，结果如下：

实验结果显示：加入卡拉胶后，小球强度增加，溶胀率降低，依然不易成球，但固定化酶回收率提高，以0.5%最合适。

对比实施例4

取10克聚乙烯醇加入90mL水溶胀24 h，海藻酸钠0.2%，加入不同比例卡拉胶重复试验，其他条件同对比实施例1，结果如下：

通过实验比较，优选聚乙烯醇10%，海藻酸钠0.2%，卡拉胶0.5%位最优比例。

对比实施例5

改变交联剂的配比以及加入硼砂，试验条件同对比实施例4，结果如下：

通过比较，优选硼酸15g/L，硼砂15g/L，氯化钙10g/L，碳酸钠50g/L作为最佳交联体系。

实施例2

(A)交联剂溶液的配制

同实施例1

(B)细胞固定化方法

取10克聚乙烯醇加入90mL水溶胀24 h，加入0.2克海藻酸钠和0.2克卡拉胶，灭菌锅加热使其充分溶化，趁热搅拌，降温到40～50℃，然后加入预先保温50℃的D-氨基酰化酶和酰化消旋酶混合菌悬液（D-氨基酰化酶酶比活力30umol/g.min，酰化消旋酶酶比活力98umol/g.min）100mL,搅拌均匀。用50mL的注射器吸入，然后滴加到上述硼酸-硼砂-氯化钙-碳酸钠体系的交联剂溶液中，形成一定直径的小球，在交联剂中浸泡3～12 h。用生理盐水洗涤，得到D-型氨基酸固定化细胞，经过测定，固定化细胞的比活力为12.2umol/g.min，冰箱保存，用于转化。

(C)转化试验方法：

在1L蒸馏水中加入乙酰化-DL-丙氨酸27克，配成0.2M浓度溶液，用片碱调整pH=7.5，加入上述D-型氨基酸固定化细胞50克转化，37℃，10小时后测定，乙酰化-DL-丙氨酸小于0.001%，全部转换为D-丙氨酸，经过浓缩以及纯化处理，得到D-丙氨酸18克。

以DL-乙酰-亮氨酸，DL-乙酰-缬氨酸，DL-乙酰苯丙氨酸，DL-乙酰正亮氨酸为原料，均配备0.2M浓度溶液，用片碱调整pH=7.5，加入上述固定化细胞50克转化，37℃，10小时后测定，乙酰化-DL-氨基酸小于0.001%，全部转换为D-氨基酸。上述原料分别得到D-亮氨酸，D-缬氨酸，D-苯丙氨酸，D-正亮氨酸。

实施例3

(A) 交联剂溶液的配制

同实施例1

(B)细胞固定化方法

取10克聚乙烯醇加入90mL水溶胀24 h，加入0.2克海藻酸钠和0.2克卡拉胶，灭菌锅加热使其充分溶化，趁热搅拌，降温到40-50度，然后加入预先保温50℃的氨基酰化酶菌悬液取（L-氨基酰化酶酶比活力80umol/g.min）100mL,搅拌均匀。用50 mL的注射器吸入，然后滴加到上述硼酸-硼砂-氯化钙-碳酸钠体系的交联剂溶液中，形成一定直径的小球，在交联剂中浸泡3～12 h。用生理盐水洗涤，得到L-型氨基酸固定化细胞，经过测定，固定化细胞的比活力为36.5umol/g.min，冰箱保存，用于转化。

(C)转化试验方法：

在1L蒸馏水中加入乙酰化-DL-丙氨酸27克，配成0.2M溶度溶液，用片碱调整pH=7.5，加入上述L-型氨基酸固定化细胞50克转化，37℃，10小时后测定，L-丙氨酸转化率50%，经过浓缩以及纯化处理，得到L-丙氨酸6.8克。

以DL-乙酰-亮氨酸，DL-乙酰-缬氨酸，DL-乙酰苯丙氨酸，DL-乙酰正亮氨酸为原料，分别得到L-亮氨酸，L-缬氨酸，L-苯丙氨酸，L-正亮氨酸。原料试验：上述均配成0.2M溶液，用片碱调整pH=7.5，加入上述固定化细胞50克转化，37℃，10小时后测定，乙酰化-DL-氨基酸以50%的转化率转换为L-氨基酸。

实施例4

(A) 交联剂溶液的配制

同实施例1

(B)细胞固定化方法

取10克聚乙烯醇加入90mL水溶胀24 h，加入0.2克海藻酸钠和0.2克卡拉胶，灭菌锅加热使其充分溶化，趁热搅拌，降温到40～50℃，然后加入预先保温50℃的D-氨基酰化酶菌悬液取（D-氨基酰化酶酶比活力65umol/g.min）100mL,搅拌均匀。用50 mL的注射器吸入，然后滴加到上述硼酸-硼砂-氯化钙-碳酸钠体系的交联剂溶液中，形成一定直径的小球，在交联剂中浸泡3～12 h。用生理盐水洗涤，得到D-型氨基酸固定化细胞，经过测定，固定化细胞的比活力为28.5umol/g.min，冰箱保存，用于转化。

(C)转化试验方法：

在1L蒸馏水中加入乙酰化-DL-丙氨酸27克，配成0.2M溶度溶液，用片碱调整PH=7.5，加入上述D-型氨基酸固定化细胞50克转化，37℃，10小时后测定，D-丙氨酸转化率50%，经过浓缩以及纯化处理，得到D-丙氨酸7.0克。

以DL-乙酰-亮氨酸，DL-乙酰-缬氨酸，DL-乙酰苯丙氨酸，DL-乙酰正亮氨酸为原料，分别得到D-亮氨酸，D-缬氨酸，D-苯丙氨酸，D-正亮氨酸。原料试验：上述均配成0.2M溶液，用片碱调整pH=7.5，加入上述固定化细胞50克转化，37℃，10小时后测定，乙酰化-DL-氨基酸以50%的转化率转换为D-氨基酸。