非天然氨基酸定位的酶生物正交固定化研究

摘要

酶固定化技术在保持酶稳定性、活性可调节、易回收再利用等方面表现突出，其应用前景广阔。传统的共价固定方法需要使用戊二醛和对苯醌等交联剂，且存在酶需要纯化、环境污染大、耗时长等问题，最为严重的是共价连接主要依赖肽链中天然氨基酸侧链氨基，且连接反应随机发生，酶活性位点常因其中的错误连接而被掩埋或破坏，导致酶催化性能和稳定性大幅降低甚至完全丧失。随着一步纯化与定点固定化理念兴起，它通过一步反应从粗酶液中纯化和固定化了酶，其在简化实验步骤和降低生产成本方面效果明显，但至今文献报道仅10余篇，且需要使用Co2+、Cu2+、Ni2+等重金属离子，仅限于His-Tag标签法。本论文在非天然氨基酸对天然酶进行定点修饰基础上，利用其定位作用和连接反应的生物正交性，实现酶蛋白的位点特异性共价固定研究，并同步实现酶的纯化，让开辟新方法和克服传统方法中的问题成为了可能。
　　 本研究借助PCR技术将硫酸酯酶活性中心基因序列拼接在脂肪酶的3'端，制备重组质粒pET28a-lipa(1)d6，甲酰甘氨酸生成酶(FGE，formylglycine-generating enzyme)基因连接在pBAD/myc-his A载体上;将上述两个重组质粒共转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，荧光实验证明表达出的甲酰甘氨酸脂肪酶含有醛基基团，甲酰甘氨酸完成了对脂肪酶的C端修饰，甲酰甘氨酸脂肪酶酶活和酶量与脂肪酶同等。利用甲酰甘氨酸脂肪酶的醛基基团与氨基化介孔泡沫硅载体(MCFs-NH2)发生席夫碱反应，实现了甲酰甘氨酸脂肪酶粗酶液的一步纯化与定点固定化。其中固定化甲酰甘氨酸脂肪酶绝对活力是游离脂肪酶的0.5倍，是1.5mM戊二醛固定化酶的2.5倍，固定化酶的催化效率是戊二醛固定化酶的3.0倍。在50℃、19h后，固定化甲酰甘氨酸脂肪酶仍有原活力的58.7％，是相同条件下1.5mM戊二醛固定化酶酶活的1.5倍，15mM戊二醛固定化酶酶活的1.7倍。由于甲酰甘氨酸修饰的脂肪酶固定仅能发生在N端或C端，为了进一步开拓酶的定点固定方法，在此运用生物正交方法对脂肪酶进行定点修饰，通过对脂肪酶蛋白三维结构进行分析，利用重叠延伸PCR技术，对脂肪酶理论非活性位点定点突变为TAG，后连接在pET24a(+)载体上，将pACYC184-2MjtRNATyurCUA、pBR322-MjTyrRS10与上述重组质粒共转化在大肠杆菌BL21(DE3)中，通过Western Blot和ESI-MS检测，证明表达出了对叠氮苯丙氨酸脂肪酶，对叠氮苯丙氨酸完成了对脂肪酶的定点修饰，AzPhe-lip243酶活最大，其值为213.3U/mg，AzPhe-lip355的蛋白表达量最大，其值为5.7mg/L。后利用对叠氮苯丙氨酸脂肪酶的叠氮基团与环辛炔基化介孔泡沫硅载体发生无铜点击化学反应实现了对叠氮苯丙氨酸脂肪酶的定点固定。IM-AzPhe-lip137的酶活达到175.8U/mg，是AzPhe-lip137游离酶酶活的106.9％。在50℃条件、29h后，IM-AzPhe-lip137的绝对活力为124.6 U/mg，相对活力为初始固定化酶活的70.9％，是1.5mM戊二醛固定化脂肪酶酶活的1.5倍。
　　 借助本课题利用对叠氮苯丙氨酸、甲酰甘氨酸对脂肪酶进行定点修饰，为酶赋予多样性功能基团打下了基础，在固定化中实现了目标酶的特异性固定及同步纯化，丰富了一步纯化与定点固定化新方法的研究，为酶固定化研究提供了新思路，突破了传统一步纯化与固定化酶过程方法少、成本低、无重金属污染问题，并藉此避免了传统方式中共价连接反应的随机性问题，从而丰富和推动了酶固定化理论与应用研究的发展。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 绪论

1．1 脂肪酶

1．1．1 脂肪酶简介

1．1．2 脂肪酶研究进展

1．1．3 展望

1．2 非天然氨基酸在蛋白质修饰中的应用

1．2．1 非天然氨基酸种类

1．2．2 蛋白质翻译后修饰

1．2．3 密码子扩展法修饰蛋白质

1．2．4 非天然氨基酸修饰蛋白质的应用现状和前景

1．2．5 展望

1．3 酶一步纯化与定点固定化研究进展

1．3．1 酶传统固定化方法

1．3．2 酶一步纯化与定点固定化

1．3．3 展望

1．4 选题背景、目的及主要内容

第二章 非天然氨基酸修饰脂肪酶重组质粒制备

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．2．1 菌种与质粒

2．2．2 试剂与器材

2．2．3 实验方法

2．3 实验步骤

2．3．1 pET28a-lipald6制备

2．3．2 pBAD／myc-his A-FGE制备

2．3．3 pACYC184-2MjtRNATyrCUA制备

2．3．4 pBR322-MjTyrRS10制备

2．3．5 pET24a-lipTAG制备

2．4 结果与分析

2．4．1 脂肪酶修饰位点三维结构模拟

2．4．2 MjTyrRS10基因密码子优化

2．4．3 重组质粒目的基因验证

2．5 本章小结

第三章 脂肪酶的甲酰甘氨酸修饰及定点正交固定化

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 试剂与仪器

3．2．2 实验方法

3．3 实验步骤

3．3．1 甲酰甘氨酸脂肪酶蛋白表达、纯化

3．3．2 甲酰甘氨酸脂肪酶醛基基团验证

3．3．3 甲酰甘氨酸脂肪酶酶活测试

3．3．4 甲酰甘氨酸修饰脂肪酶的定点正交固定化

3．3．5 戊二醛固定脂肪酶

3．3．6 戊二醛固定化脂肪酶、固定化甲酰甘氨酸脂肪酶动力学研究

3．3．7 戊二醛固定化脂肪酶、固定化甲酰甘氮酸脂肪酶热稳定性

3．4 结果与分析

3．4．1 脂肪酶、甲酰甘氨酸脂肪酶表达与纯化

3．4．2 甲酰甘氨酸脂肪酶醛基基团验证

3．4．3 脂肪酶、甲酰甘氨酸脂肪酶酶活对比

3．4．4 固定化脂肪酶与固定化甲酰甘氨酸脂肪酶酶活比较

3．4．5 戊二醛固定化脂肪酶、固定化甲酰甘氨酸脂肪酶动力学研究

3．4．6 戊二醛固定化脂肪酶、固定化甲酰甘氨酸脂肪酶热稳定性比较

3．5 本章小结

第四章 脂肪酶的对叠氮苯丙氨酸掺入修饰及正交点击固定化

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．1 试剂与仪器

4．2．2 实验方法

4．3 实验步骤

4．3．1 对叠氮苯丙氨酸脂肪酶表达、纯化

4．3．2 对叠氮苯丙氨酸脂肪酶Western Blot

4．3．3 对叠氮苯丙氨酸脂肪酶ESI-MS检测

4．3．4 对叠氮苯丙氨酸脂肪酶酶活测试

4．3．5 对叠氮苯丙氨酸脂肪酶定点固定化

4．3．6 固定化对叠氮苯丙氨酸脂肪酶酶活测试

4．3．7 固定化对叠氮苯丙氨酸脂肪酶热稳定性

4．4 结果与分析

4．4．1 对叠氮苯丙氨酸脂肪酶制备

4．4．2 对叠氮苯丙氨酸脂肪酶质谱验证

4．4．3 脂肪酶、对叠氮苯丙氨酸脂肪酶酶活对比

4．4．4 固定化 对叠氮苯丙氨酸脂肪酶酶活研究

4．4．5 固定化对叠氮苯丙氨酸脂肪酶热稳定性

4．5 本章小结

第五章 结论与展望

参考文献

附录 攻读硕士学位期间主要科研成果