一种MMR基因突变检测试剂盒

摘要

本发明属于分子生物学和医学领域，具体涉及人DNA错配修复基因（mismatch repair genes，MMR）的突变检测试剂盒及其用途，更具体地是涉及人MLH1、MSH2、MSH6、PMS1、PMS2基因的突变检测及其与遗传性非息肉性结直肠癌（HNPCC）相关性的检测。本发明的试剂盒可用于检测个体的MMR基因外显子突变的基因型，为判断该个体是否患有HNPCC以及家族成员患病风险是否大于普通人群提供参考数据。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和医学领域，具体涉及一种MMR基因突变检测试剂盒。

背景技术

结直肠癌(Colorectal Cancer，CRC)是全世界第三大常见恶性肿瘤。研究发现35％的CRC存在家族易感性，其中最常见的是遗传性非息肉病性结直肠癌(hereditary nonpolyposiscolorectal cancer，HNPCC)，占所有病例的2％～5％。DNA错配修复基因(mismatch repair genes，MMR)发生胚系突变是Lynch综合症的遗传学发病机制。研究发现至少5种MMR基因(MSH1、MLH2、MSH6、PMS1、PMS2)的胚系突变会导致HNPCC，其中MLH1的胚系突变占50％，MSH2占40％，MSH6占7％，剩下的基因占3％。在家系中，MMR基因种系突变携带者为发生HNPCC相关肿瘤的高危人群，检测MMR基因种系突变能很好地预测HNPCC相关肿瘤的发生危险。对于已发现存在遗传性错配修复基因突变的患者，可以密切监测异时多原发癌和其他HNPCC相关肿瘤的发生，并对其家族中的其他成员，特别是尚未出现肿瘤的年轻成员进行相应检测，确认突变基因携带者，不但有助于对癌症易感个体重点进行临床监测和临床症状出现前的早期诊断，也可为遗传咨询和基因治疗提供依据，并可使非突变携带者免除不必要的精神和经济负担，对基因突变携带者，可以进行密切随访，以做到早期诊断，早期治疗。

目前，用于筛选HNPCC的方法尽管较多，但只有检测出胚系(germline)的MMR基因病理性突变才能确诊为HNPCC患者。直接基因测序法是MMR基因胚系突变检测最灵敏和最特异的方法，但基于Sanger法测序费时且价格昂贵，无法满足临床上大样本量的检测需求。与传统的sanger法测序相比，第二代高通量测序技术具有通量高、速度快、费用低等优点，结合特定核酸序列靶向富集技术，可以实现对疾病最相关的基因进行深度测序。

发明内容

针对现有技术中所存在的缺陷，本发明的目的在于，提供一种检测样品中是否存在MMR基因变异的试剂。

本发明的另一目的在于，提供所述检测样品中是否存在MMR基因变异的试剂的用途，用于制备检测MMR基因变异的试剂盒。

本发明的另一目的，在于提供一种检测MMR基因变异的试剂盒。

本发明的另一目的，在于提供一种获得扩增产物的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的第一方面，提供了一种检测样品中是否存在MMR基因变异的试剂，所述的试剂是引物对，选自下组引物对中的任意一种或多种：

(1)SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；(2)SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；

(3)SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；(4)SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；

(5)SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；(6)SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；

(7)SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；(8)SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16；

(9)SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18；(10)SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20；

(11)SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22；(12)SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24；

(13)SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26；(14)SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28；

(15)SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30；(16)SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32；

(17)SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34；(18)SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36；

(19)SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38；(20)SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40；

(21)SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42；(22)SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44；

(23)SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46；(24)SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48；

(25)SEQ ID NO.49和SEQ ID NO.50；(26)SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.52；

(27)SEQ ID NO.53和SEQ ID NO.54；(28)SEQ ID NO.55和SEQ ID NO.56；

(29)SEQ ID NO.57和SEQ ID NO.58；(30)SEQ ID NO.59和SEQ ID NO.60；

(31)SEQ ID NO.61和SEQ ID NO.62；(32)SEQ ID NO.63和SEQ ID NO.64；

(33)SEQ ID NO.65和SEQ ID NO.66；(34)SEQ ID NO.67和SEQ ID NO.68；

(35)SEQ ID NO.69和SEQ ID NO.70；(36)SEQ ID NO.71和SEQ ID NO.72；

(37)SEQ ID NO.73和SEQ ID NO.74；(38)SEQ ID NO.75和SEQ ID NO.76；

(39)SEQ ID NO.77和SEQ ID NO.78；(40)SEQ ID NO.79和SEQ ID NO.80；

(41)SEQ ID NO.81和SEQ ID NO.82；(42)SEQ ID NO.83和SEQ ID NO.84；

(43)SEQ ID NO.85和SEQ ID NO.86；(44)SEQ ID NO.87和SEQ ID NO.88；

(45)SEQ ID NO.89和SEQ ID NO.90；(46)SEQ ID NO.91和SEQ ID NO.92；

(47)SEQ ID NO.93和SEQ ID NO.94；(48)SEQ ID NO.95和SEQ ID NO.96；

(49)SEQ ID NO.97和SEQ ID NO.98；(50)SEQ ID NO.99和SEQ ID NO.100；

(51)SEQ ID NO.101和SEQ ID NO.102；(52)SEQ ID NO.103和SEQ ID NO.104；

(53)SEQ ID NO.105和SEQ ID NO.106；(54)SEQ ID NO.107和SEQ ID NO.108；

(55)SEQ ID NO.109和SEQ ID NO.110；(56)SEQ ID NO.111和SEQ ID NO.112；

(57)SEQ ID NO.113和SEQ ID NO.114；(58)SEQ ID NO.115和SEQ ID NO.116；

(59)SEQ ID NO.117和SEQ ID NO.118；(60)SEQ ID NO.119和SEQ ID NO.120；

(61)SEQ ID NO.121和SEQ ID NO.122；(62)SEQ ID NO.123和SEQ ID NO.124；

(63)SEQ ID NO.125和SEQ ID NO.126；(64)SEQ ID NO.127和SEQ ID NO.128；

(65)SEQ ID NO.129和SEQ ID NO.130；(66)SEQ ID NO.131和SEQ ID NO.132；

(67)SEQ ID NO.133和SEQ ID NO.134；(68)SEQ ID NO.135和SEQ ID NO.136；

(69)SEQ ID NO.137和SEQ ID NO.138；(70)SEQ ID NO.139和SEQ ID NO.140；

(71)SEQ ID NO.141和SEQ ID NO.142；(72)SEQ ID NO.143和SEQ ID NO.144；

(73)SEQ ID NO.145和SEQ ID NO.146；(74)SEQ ID NO.147和SEQ ID NO.148；

(75)SEQ ID NO.149和SEQ ID NO.150；(76)SEQ ID NO.151和SEQ ID NO.152；

(77)SEQ ID NO.153和SEQ ID NO.154；(78)SEQ ID NO.155和SEQ ID NO.156；

(79)SEQ ID NO.157和SEQ ID NO.158；(80)SEQ ID NO.159和SEQ ID NO.160；

(81)SEQ ID NO.161和SEQ ID NO.162；(82)SEQ ID NO.163和SEQ ID NO.164；

(83)SEQ ID NO.165和SEQ ID NO.166；(84)SEQ ID NO.167和SEQ ID NO.168；

(85)SEQ ID NO.169和SEQ ID NO.170；(86)SEQ ID NO.171和SEQ ID NO.172；

(87)SEQ ID NO.173和SEQ ID NO.174。

在本发明的第二方面，提供所述检测样品中是否存在MMR基因变异的试剂的用途，用于制备检测MMR基因变异的试剂盒。

在本发明的第三方面，提供一种检测样品中是否存在MMR基因变异的试剂盒，所述的试剂盒中含有前述87对引物对的一种或多种引物对。

在另一优选例中，所述的试剂盒中含有前述所有87对引物对。

在另一优选实施例中，所述的试剂盒中，含有11组多重PCR引物对组合，分别为：

(1)引物对组合1：由SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24；SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28；SEQ ID NO.63和SEQ ID NO.64；SEQ ID NO.97和SEQ IDNO.98；SEQ ID NO.111和SEQ ID NO.112；SEQ ID NO.127和SEQ ID NO.128；SEQ ID NO.149和SEQ ID NO.150组成；

(2)引物对组合2：由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34；SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40；SEQ ID NO.67和SEQ ID NO.68；SEQ ID NO.77和SEQ IDNO.78；SEQ ID NO.81和SEQ ID NO.82；SEQ ID NO.117和SEQ ID NO.118；SEQ ID NO.137和SEQ ID NO.138；SEQ ID NO.153和SEQ ID NO.154；SEQ ID NO.173和SEQ ID NO.174组成；

(3)引物对组合3：由SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18；SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26；SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38；SEQ ID NO.59和SEQ ID NO.60；SEQ ID NO.79和SEQ IDNO.80；SEQ ID NO.101和SEQ ID NO.102；SEQ ID NO.113和SEQ ID NO.114；SEQ ID NO.123和SEQ ID NO.124；SEQ ID NO.141和SEQ ID NO.142；SEQ ID NO.163和SEQ ID NO.164组成；

(4)引物组合4：由SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22；SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36；SEQ ID NO.61和SEQ ID NO.62；SEQ ID NO.87和SEQ ID NO.88；SEQ ID NO.99和SEQ IDNO.100；SEQ ID NO.119和SEQ ID NO.120；SEQ ID NO.133和SEQ ID NO.134；SEQ IDNO.147和SEQ ID NO.148；SEQ ID NO.155和SEQ ID NO.156；SEQ ID NO.159和SEQ IDNO.160组成；

(5)引物组合5：由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20；SEQID NO.41和SEQ ID NO.42；SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48；SEQ ID NO.55和SEQ ID NO.56；SEQ ID NO.89和SEQ ID NO.90；SEQ ID NO.95和SEQ ID NO.96；SEQ ID NO.115和SEQ IDNO.116组成；

(6)引物组合6：由SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32；SEQ ID NO.53和SEQ ID NO.54；SEQ ID NO.65和SEQ ID NO.66；SEQ ID NO.75和SEQ IDNO.76；SEQ ID NO.91和SEQ ID NO.92；SEQ ID NO.103和SEQ ID NO.104；SEQ ID NO.109和SEQ ID NO.110；SEQ ID NO.125和SEQ ID NO.126；SEQ ID NO.161和SEQ ID NO.162组成；

(7)引物组合7：由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16；SEQID NO.57和SEQ ID NO.58；SEQ ID NO.85和SEQ ID NO.86；SEQ ID NO.93和SEQ ID NO.94；SEQ ID NO.129和SEQ ID NO.130；SEQ ID NO.145和SEQ ID NO.146；SEQ ID NO.9和SEQID NO.10组成；

(8)引物组合8：由SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30；SEQ ID NO.49和SEQ ID NO.50；SEQ ID NO.69和SEQ ID NO.70；SEQ ID NO.83和SEQ IDNO.84；SEQ ID NO.121和SEQ ID NO.122；SEQ ID NO.131和SEQ ID NO.132；SEQ ID NO.135和SEQ ID NO.136；SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44组成；

(9)引物组合9：由SEQ ID NO.105和SEQ ID NO.106；SEQ ID NO.73和SEQ ID NO.74；

(10)引物组合10：由SEQ ID NO.107和SEQ ID NO.108；SEQ ID NO.71和SEQ ID NO.72；SEQ ID NO.171和SEQ ID NO.172组成；

(11)引物组合11：由SEQ ID NO.139和SEQ ID NO.140；SEQ ID NO.151和SEQ IDNO.152；SEQ ID NO.165和SEQ ID NO.166；SEQ ID NO.167和SEQ ID NO.168；SEQ IDNO.169和SEQ ID NO.170；SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.52；SEQ ID NO.143和SEQ IDNO.144；SEQ ID NO.157和SEQ ID NO.158；SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46组成。

基于本发明的所述试剂盒采用的是PCR来进行检测，所述试剂盒中还可以包括其他一些试剂，如：总DNA抽提试剂、PCR试剂、PCR产物纯化试剂中的一种或多种。具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据实际需要配置。

所述总DNA抽提试剂可采用各种常规的抽提DNA的试剂，这些试剂可市购获得。

所述PCR试剂可采用各种常规的PCR试剂，这个试剂可市购获得。

所述PCR产物纯化试剂可采用各种常规的PCR产物纯化试剂，这个试剂可市购获得。

此外，所述的试剂盒中还包括使用说明书，便于本领域技术人员使用。

在本发明的第四方面，提供一种获得MMR基因扩增产物的方法，所述的方法包括：以核酸样品为模板，利用选自前述的引物对或试剂盒进行PCR扩增，获得扩增产物。

用于PCR扩增的模板，亦即核酸样品(如基因组DNA)也可采用本领域的常规方法提取获得。在另一优选例中，采用经典的基因组DNA提取方法或是商品化的基因组提取试剂盒，从样本中提取基因组DNA，作为核酸样本。

在另一优选例中，利用前述11组引物对组合作为引物分别进行多重PCR扩增，将得到的11组多重PCR产物合并，即得扩增产物。

除了采用本发明的引物，本发明对PCR反应体系中其它各组分及其终浓度没有特别的限制，本领域人员可根据常规建立PCR体系时采用的一般成分及其浓度来建立PCR反应体系。

在另一优选例中，第1-8组和11组的多重PCR反应体系50μl，包括：5X Multiplex PCRMaster Mix 10μl，模板50ng，Forward Primer 1.0μM 2.5-20μl，Reverse Primer 1.0μM2.5-20μl，ddH₂O补足至50μl。第9-10组的多重PCR反应体系50μl：2X>2O补足至50μl。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

从一般PCR到多重PCR，其设计难度会随之翻倍。可以说，引物设计是多重PCR的最大障碍。本发明涉及一种多重PCR靶向富集结合高通量测序检测MMR基因突变的的试剂盒及方法，本发明通过设计能扩增5个MMR基因(MSH1、MLH2、MSH6、PMS1、PMS2)所有外显子的引物，并自主开发多重PCR靶向富集MMR基因外显子序列的方法，实现MMR基因外显子的扩增后利用第二代高通量测序技术，检测MMR基因的胚系突变。本发明代表了最新的二代高通量测序技术在遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)MMR基因胚系突变检测的技术突破。它通过多重PCR靶向富集MMR基因外显子序列结合第二代高通量测序技术，实现了同时检测5种MMR基因的胚系突变，为HNPCC的临床诊断和研究提供提供了通量高、速度快、费用低的技术方法。我们发明的方法及试剂盒以illumina公司的Miseq测序仪为主要平台，但这个方法和发明同样适用于其它高通量测序平台，包括illumina公司的Hiseq 2500/3000/4000、NextSeq 500和Life公司的Ion PGM/Proton系统等等。

附图说明

图1：为本发明的技术路线图。

图2：最上面条带(绿色)和最下面的条带(紫色)是dna ladder，相当于marker；中间的多条黑色条带是检测到的样品条带。

图3：横坐标为片段大小，即bp数；纵坐标为信号强度，即核酸含量。

图4：最上面条带(绿色)和最下面的条带(紫色)是dna ladder，相当于marker；中间的多条黑色条带是检测到的样品条带。

图5：横坐标为片段大小，即bp数；纵坐标为信号强度，即核酸含量。

图6：是本发明实施例3的sanger测序验证结果截图，A)MLH1:exon18:c.C2101A；B)MSH2:exon14:c.G2425A；C)MSH6:exon5:c.G3205C。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，找到了一类特别适合于扩增5个MMR基因所有73个外显子的引物，所述引物经过合理的设计、优选而获得，用于PCR扩增时特异性良好，且扩增效率高，对于所有73个外显子的覆盖度高达100％。本发明人还优化了PCR扩增反应，例如，多重PCR反应体系，进一步提高了扩增效率。

针对目前检测MMR基因突变过程繁琐复杂、耗费时间长的缺点，发明人还设计了一种检测5个MMR基因突变的方法，所述方法简单、耗时短且成本低。基于此，完成了本发明。

可采用各种技术来检测MMR基因或MMR基因变异位点，在检测MMR基因变异时，检测可以针对cDNA，也可以针对基因组DNA。可用已有的现有技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。

较为方便的是用MMR基因特异的引物进行PCR，对MMR基因进行扩增，对扩增产物进行序列测定，从而判断是否发生变异。

本发明人在研究中发现，检测MMR基因或MMR基因突变时，利用一般的引物，PCR扩增时的特异性差，扩增效率低下。因此需要设计和筛选特异性好的引物。经过大量的试验和比较，本发明人找到了分别对应于5个MMR基因所有73个外显子的引物。经验证所述引物获得的扩增产物既包括了MMR各外显子上尽可能完整的序列，且特异性非常好，几乎没有非特异性扩增或扩增产物特别少的情况。特别适用于复杂体系的PCR扩增。各引物的核苷酸序列如表2所示。

多重PCR相对单重PCR有很多优点，能够节省时间，节省试剂，节约经费开支，为疾病的预测和防治提供更多更准确的诊断信息。单重PCR检测，当引物针对的序列发生了突变时则可能出现假阴性结果，而针对同种病原的多重PCR检测，因为针对的是多个基因，同时在多个位点发生变异的可能性很小，能大大降低假阴性出现的概率。

多重PCR反应体系较难建立，要求确保反应中的引物之间不会发生相互作用，扩增产物大小相近但又能通过电泳分开。多重PCR扩增对试验操作要求很高，任何一种实验条件控制不当，都将很容易导致扩增条件的失败。现有技术中报道的多重PCR体系的建立，不改变PCR反应条件时，进行两重PCR比较容易获得预期结果，而对三重或以上的PCR扩增比较困难。本发明者通过设计多组引物组合，对多重PCR体系优化，成功建立多重PCR检测体系，能够一次性检测出多种基因突变，不但能快速、简洁、准确地检测病害，而且能大大节约检测成本。

本发明还提供了用于在分析物中检测含有MMR基因或MMR基因变异的试剂盒，该试剂盒包括装在适当容器中的、用于特异性扩增MMR基因或MMR基因变异的引物，并且用所述引物扩增出的含有MMR基因或MMR基因相关外显子上疾病相关的变异部位。所述的试剂盒中含有选自表2的至少一对引物，用于获得相关的MMR基因或MMR基因外显子上包含变异位点的序列。最佳的，所述的试剂盒中含有表2中所有的引物对，这样更有利于完整地分析MMR基因或MMR基因各外显子序列的变异情况。

此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、PCR扩增等所需的各种试剂，包括但不限于：抽取液、扩增液、杂交液、酶、洗液等。这些都是本领域人员所了解的。

此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或核酸序列分析软件等，便于本领域人员使用和分析。

获得MMR基因扩增产物的方法

本发明人还提供了一种优化的从核酸样品中获得MMR基因扩增产物的方法，所述的方法包括：以核酸样本为模板，利用选自表2的引物对进行PCR扩增，获得扩增产物。

采用所述的引物，采用常规的PCR扩增方法即可获得较为理想的扩增结果。一种可选的PCR扩增方法中，PCR热循环步骤如下：98℃变性10秒、55℃退火30秒、72℃延伸60秒，三十个循环。

进行PCR热循环前的模板变性步骤可根据本领域常规的方法。较佳的方法如下：94℃预变性1分钟。

进行PCR热循环后的序列延伸步骤可根据本领域常规的方法。较佳的方法如下：72℃延伸4分钟。

除了采用本发明的引物，本发明对PCR扩增体系中其它各成分及其浓度没有特别的限制，本领域技术人员可根据常规建立PCR体系时采用的一般成分及其浓度来建立PCR扩增体系。用于PCR扩增的模板(如基因组DNA)可采用本领域的常规方法提取获得。

采用本发明的获得MMR基因或MMR基因扩增产物的方法，扩增效率和特异性均非常理想，且特别适合于复杂体系的PCR扩增，例如以血样基因组DNA作为PCR模板的扩增。

本发明还提供了一种确定待测样品中是否存在MMR基因变异的方法，所述的方法包括：采用前述的方法从待测核酸样品中扩增MMR基因片段，获得扩增产物；以及分析扩增产物中MMR基因片段的序列，并与野生型MMR基因中对应的序列进行比较；如果存在不同，则表明待测核酸样品中存在MMR基因变异。

通过基因变异的情况，可进一步得知受试者遗传性非息肉性结直肠癌(HNPCC)的患病风险，从而达到早期检测早期预防的目的。

本发明的主要优点在于：

(1)首次针对5个MMR基因和5个MMR基因的所有73个外显子设计了合适的引物，所述引物在用于PCR扩增时特异性良好，扩增效率高。

(2)优化了获得MMR基因扩增产物的方法，所述方法精确、快速、稳定、成功率高。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the seriesMETHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODSIN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

本发明的技术方案路线图如图1所示，主要包括如下技术环节：

技术环节一：利用本发明的引物对及其组合进行多重PCR靶向富集MMR基因外显子。

技术环节二：对技术环节一产生的5个基因(MSH1、MLH2、MSH6、PMS1、PMS2)外显子扩增产物利用二代高通量测序技术进行序列测定和鉴定。

实施例1引物设计与合成

本发明对5个基因(MSH1、MLH2、MSH6、PMS1、PMS2)的73个外显子总共11419个碱基设计了87对Primer，PCR扩增产物长度为257-528bp，该组合探针primer能覆盖5个MMR基因(见表1)的所有外显子区域。引物合成由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列信息详见表2。

表1：引物设计参考序列信息表

表2：针对5个MMR基因的87对引物

实施例2引物组合及多重PCR靶向富集方法

一、实验材料

(一)、主要试剂

1、荧光定量检测试剂盒：Qubit^TM>

2、定量检测试剂盒：Agilent DNA 7500and 12000Kit，Agilent公司，该试剂盒包含；

3、Multiplex PCR试剂盒：MixMultiplex PCR 5×Master Mix，NEB公司；

4、测序文库连接接头试剂盒：NEXTflex^TM>

5、测序文库构建试剂盒：NEXTflex^TM>

6、测序试剂盒：MiSeq Reagent Kit v3(600-cycles)，Illumina公司

7、纯化试剂盒：Agencourt AMPure XP beads，Beckman Coulter(Agencourt)公司

(二)、主要仪器

1、0.5ul～2ml移液器，Eppendof，德国；

2、微型离心机，杭州奥盛仪器有限公司；

3、高速离心机，sigma，德国；

4、涡旋振荡器，Scientific Industries，美国；

5、干式恒温器，TECHNE，德国；

6、TC-412型PCR仪，TECHNE，德国；

7、Agilent 2100生物分析仪，Agilent，德国；

8、Qubit荧光定量仪，Invitrogen，美国；

9、Miseq sequencer测序仪，Illumina，美国；

二、单管PCR扩增

1.以商品化的gDNA作为模板，分别采用如表2中所示的87对引物对作为引物，进行单管PCR扩增。采用87对中的每组引物对单独PCR扩增时所用的反应体系和扩增条件如下，所用的PCR kit为TaKaRa Ex

反应体系：

反应条件：

2.对每对对引物单独扩增所得到的单管PCR扩增产物进行纯化，具体方法同本实施例三、2中的方法。

3.将得到的87组PCR产物分别纯化后，等量混合，并采用Agilent 2100生物分析仪检测，结果如图2和图3所示。其中，如图2所示，最上面条带(绿色)和最下面的条带(紫色)是dna ladder，相当于marker；中间的多条黑色条带是检测到的样品条带。如图3，横坐标为片段大小，即bp数；纵坐标为信号强度，即核酸含量。本发明所设计的87对引物是对针5个MMR基因所有外显子区域的特异性引物，根据图2和图3的结果，可以看出采用这87对引物对进行单管PCR时，能扩增出来得到相应的PCR扩增产物，充分说明了这87对引物对的特异性和有效性。

三、多重PCR扩增

1.进一步的，将实施例1设计和优化的87对引物对(如表2所示)进行组合，得到如表3所示的11组引物对组合。然后以商品化的gDNA作为模板，采用这11组引物对组合作为引物分别进行多重PCR扩增。每组多重PCR的DNA模板量为10-200纳克，其中第1-8和11组使用NEB MixMultiplex PCR 5×Master Mix试剂盒进行多重PCR扩增，第9和10组使用TaKaRa LA Tag with GC Buffer试剂盒进行多重PCR扩增，扩增条件为：95℃预变性1分钟；95℃变性20秒、63℃退火60秒、68℃延伸30秒，三十个循环；68℃延伸5分钟。

表3：11组引物对组合

第1-8组和11组多重PCR反应体系：

Component50μl reactionFinal Conc.Multiplex PCR 5X Master Mix10μl1X1μM Primer Stockvariable0.15μM(0.05-0.4μM)Template DNAvariable50ngNuclease-free waterto 50μl

第9、10组多重PCR反应体系：

Component50μl reaction2X GC Buffer I25μldNTP4ulTemplate DNA50ngPrimer mix2ulLa Tag0.5ulNuclease-free waterto 50μl

2.将采用每组引物对组合所得到的多重PCR产物分别进行纯化：

(1)待PCR扩增反应结束后，拿出96孔PCR反应板，撕开封口膜，每孔加入48ul AMPureXP Beads，上下混合均匀；

(2)室温放置5min；

(3)将离心管放置于96孔板磁力架上，放置5min，使得磁珠完全吸附在管壁上；

(4)用移液器将离心管中的液体小心吸取并丢弃；

(5)在磁力架上的96孔PCR板中加入200ul新鲜配制的80％乙醇，放置30s后用移液器吸取上清液并丢弃；

(6)重复步骤1.3.6.3.5，确保离心管中剩余的乙醇全部被吸出；

(7)将96孔板从磁力架上移开，自然干燥2min，使得壁上的磁珠完全干燥；

(8)加入21ul Resuspension Buffer，小心混匀，确保管壁上的磁珠完全溶于Buffer中；

(9)将96孔板重新放置到磁力架上，放置5min，使得磁珠完全吸附到管壁上；

(10)小心吸取20ul洗脱液至新的1.5ml离心管中。

3.采用11组引物对组合分别单独扩增PCR产物纯化后，得到11组纯化后的多重PCR产物，然后将这11组纯化后的多重PCR产物等量混合后，采用Agilent 2100生物分析仪检测，结果如图4和图5所示。其中，如图4所示，最上面条带(绿色)和最下面的条带(紫色)是dna ladder，相当于marker；中间的多条黑色条带是检测到的样品条带。如图5，横坐标为片段大小，即bp数；纵坐标为信号强度，即核酸含量。将图4、图5的结果与图2、图3进行比较，采用11组引物对组合分别进行多重PCR扩增商品化的g DNA与采用87组引物对分别进行单重PCR扩增商品化的g DNA，得到的结果是一致的，充分说明，采用11组引物对组合分别进行多重PCR扩增商品化的g DNA，是可行的。

四、对MMR基因外显子扩增产物利用第二代高通量测序技术进行序列测定和鉴定

对于上述步骤产生的多重PCR产物，经过定性和定量检测后，为可考察本发明的准确性，同时利用第二代高通量测序技术进行对MMR基因外显子扩增产物进行序列测定，来判定所述引物扩增的准确性。主要是测序文库的制备和测序。文库制备包括PCR产物末端补平、5`端磷酸化、3`端加A、连接illumina测序接头、连接产物PCR富集及纯化，然后使用Miseq测序仪进行序列测定和分析。

具体的，(1)测序文库构建

使用NEXTflex^TM>

1)DNA末端补平和3’端加A

1.1、模板使用gDNA多重PCR产物，建库起始量为200ng，反应总体积为50ul，配制酶反应混和液。

反应体系：

1.2、将混合液混匀后置于PCR仪进行酶反应。

酶反应条件：

2)连接测序接头Adapter

2.1、配制连接反应混和液

反应体系：

2.2、将混合夜混匀后置于PCR仪进行酶反应，反应条件是：25℃温育30min。

3)连接产物纯化

3.1、将连接产物转移至新的1.5ml离心管中，然后加入48ul AMPure XP Beads，混合均匀；

3.2、室温放置5min；

3.3、将离心管放置于磁力架上，放置5min，使得磁珠完全吸附在管壁上；

3.4、用移液器将离心管中的液体小心吸取并丢弃；

3.5、在磁力架上的离心管中加入200ul新鲜配制的80％乙醇，放置30s后用移液器吸取上清液并丢弃；

3.6、重复步骤3.5，确保离心管中剩余的乙醇全部被吸出；

3.7、将离心管从磁力架上转移到普通离心管架上，自然干燥2min，使得离心管壁上的磁珠完全干燥；

3.8、加入21ul Resuspension Buffer，小心混匀，确保管壁上的磁珠完全溶于Buffer中；

3.9、将离心管重新放置到磁力架上，放置5min，使得磁珠完全吸附到管壁上；

3.10、小心吸取20ul洗脱液至新的1.5ml离心管中。

4)PCR富集

4.1、配制PCR反应体系，并将反应混合液加入到PCR反应管中；

反应条件：

4.2、将PCR反应管放置到PCR仪上进行PCR扩增；

反应条件

4.3、将PCR产物转移至新的1.5ml离心管中，然后加入44ul AMPure XP Beads，混合均匀并室温放置5min；

4.4、将离心管放置于磁力架上，放置5min，使得磁珠完全吸附在管壁上；

4.5、用移液器将离心管中的液体小心吸取并丢弃；

4.6、在磁力架上的离心管中加入200ul新鲜配制的80％乙醇，放置30s后用移液器吸取上清液并丢弃；

4.7、重复步骤1.3.6.3.5，确保离心管中剩余的乙醇全部被吸出；

4.8、将离心管从磁力架上转移到普通离心管架上，自然干燥2min，使得离心管壁上的磁珠完全干燥；

4.9、加入21ul Resuspension Buffer，小心混匀，确保管壁上的磁珠完全溶于Buffer中；

4.10、将离心管重新放置到磁力架上，放置5min，使得磁珠完全吸附到管壁上；

4.11、小心吸取20ul洗脱液至新的1.5ml离心管中。

(2)测序文库质检

1)使用Agilent 2100bioanalyzer和Agilent DNA 7500and 12000Assay Kit对文库质检进行检测，具体步骤如下：

1.1、准备gel-dye Mix(胶、染料混合液)：将Agilent DNA 7500and 12000Assay Kit室温解冻30min，振荡混匀DNA dye，加25ul dye至DNA gel胶中，振荡混匀并转移至含有离心柱的离心管中，1500g离心10min，过滤后的gel-dye溶液避光保存；

1.2、灌胶：准备一个新的DNA芯片放置到芯片架子上，加9ul gel-dye混合液至标记为G的孔中，然后将注射器调至1ml位置盖在芯片上，下压注射器至卡位，静置30s后将注射器调回至1ml位置，然后在另外两个标记为G位置的孔中加入9ul gel-dye混合液；

1.3、在芯片加样孔和ladder孔中加入5ul marker(绿色标记)；

1.4、取1ul文库DNA和1ul Ladder分别加入芯片加样孔和ladder孔中，2400rpm振荡1min以混匀样品，然后将芯片放置到Agilent 2100生物分析仪上进行检测。

2)使用Qubit分光光度计对文库进行定量

2.1、将Qubit^TM>

定量混合液体系：

2.2、振荡混匀后避光静置2min；

2.3、校准分光光度计，检测标准样Standard 1和2；

2.4、检测样本Sample，记录检测结果。

(3)高通量测序

使用Miseq测序仪对样本文库进行测序，测序所用试剂为MiSeq Reagent Kit v3(600-cycles)。

(4)数据分析结果

测序数据分析使用Bowtie2软件与人类基因组参考序列(hg19)进行比对，用SAM工具软件对比对结果进行突变筛查分析(筛选条件：1、比对质量大于20；2、测序深度大于100)，用ANNOVAR软件对筛选的突变进行功能注释。分析所得结果用sanger法测序验证。

通过上述的实验和分析步骤，分析结果，5个MMR基因总扩增率高达61.89％～88.17％，外显子覆盖度为100％，亦即能扩增基因5个MMR基因的所有外显子。

以上数据充分说明，采用本发明的引物对组合1～11对5个MMR基因外显子进行PCR扩增，准确度高、特异性强、灵敏度高。

实施例317例结直肠癌病例和14例正常人MMR基因突变检测

一、实验材料，同实施例2。

二、样本检测

(一)、多重PCR靶向富集

采用了Qiagen的试剂盒，按照试剂盒说明中的方法，对31个样本(17例结直肠癌病例和14例正常人)提取基因组DNA。采用如实施例2表3所示的11组引物对组合对31个样本的基因组DNA进行多重PCR扩增，具体方法同实施例2。

(二)、多重PCR产物纯化，具体方法同实施例2。

(三)、测序文库构建，具体方法同实施例2。

(四)、测序文库质检，具体方法同实施例2。

三、高通量测序，，具体方法同实施例2。

四、数据分析结果

测序数据分析使用Bowtie2软件与人类基因组参考序列(hg19)进行比对，用SAM工具软件对比对结果进行突变筛查分析(筛选条件：1、比对质量大于20；2、测序深度大于100)，用ANNOVAR软件对筛选的突变进行功能注释。分析所得结果用sanger法测序验证，部分结果如图6所示。再次，印证了本发明方法的准确性。

通过多重PCR靶向富集5个MMR基因和高通量测序，31个样本共得到2.7gigabases(Gb)数据，平均每个样本86Mb，平均reads数为287048。如表4所示，其中30个样本的五个筛查基因(MLH1、MSH2、MSH6、PMS1、PMS2)外显子测序覆盖度为100％，1个为96.8％，平均覆盖度为99.9％，外显子区域平均测序深度为2284。经过生物信息分析，31个测序样本共发现13种非同义单核苷酸变异(single nucleotide variation,SNV)、2种同义SNV，在非同义SNV中，位于MLH1基因的有3个：c.A655G:p.I219V、c.T1151A:p.V384D、c.C2101A:p.Q701K；位于MSH2基因的有3个：c.C1168T:p.L390F、c.A1690G:p.T564A、c.G2425A:p.E809K；位于MSH6基因的有3个：c.G116A:p.G39E、c.G3205C:p.G1069R、c.A3488T:p.E1163V；位于PMS2基因的有4个：c.G59A:p.R20Q、c.A1621G:p.K541E、c.C1408T:p.P470S、c.C1454A:p.T485K。2个同义SNV是MSH6基因c.T3306A和PMS2基因c.C780G；基因PMS1未检测到SNV。这些SNV与数据库dbSNP和InSight进行检索，发现14种是已经报导过的，其中MSH6的c.G3205C:p.G1069R未见报导。

如表5所示，通过上述的实验和分析步骤，在17个大肠癌病例和14个正常人样本中共发现外显子区域13种非同义单核苷酸变异、2种同义单核苷酸变异。其中一个致病或可能致病的变异，即c.C2101A:p.Q701K；两个致病性不确定的变异，即c.G2425A:p.E809K、c.G3205C:p.G1069R，其余为可容忍的变异。

表4

表5：MMR基因突变筛查结果

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。