山梨酸或其盐在枯草芽孢杆菌发酵生产低分子量γ‑聚谷氨酸中的应用

摘要

本发明公开了山梨酸或其盐在枯草芽孢杆菌发酵生产低分子量γ‑聚谷氨酸中的应用。将山梨酸或其盐应用于枯草芽孢杆菌的γ‑聚谷氨酸发酵生产，可以提高低分子量γ‑聚谷氨酸的产率。利用本发明的发酵生产低分子量γ‑聚谷氨酸的方法，使高于245kD的γ‑聚谷氨酸的含量占总γ‑聚谷氨酸的百分数从原来的80.28％下降到21.50％～72.18％，100‑245kD的γ‑聚谷氨酸的含量占总γ‑聚谷氨酸的百分数从原来的19.72％上升至27.49％～52.72％，而低于100kD的γ‑聚谷氨酸的含量占总γ‑聚谷氨酸的百分数从原来的0上升至0.3％～25.78％；也使γ‑聚谷氨酸的产量维持15g/L以上。本发明的山梨酸或其盐提高低分子量γ‑聚谷氨酸的产量的发酵方法简单有效，提供了一种有别于物理或化学方法生产低分子量γ‑聚谷氨酸的方法。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及山梨酸或其盐在枯草芽孢杆菌发酵生产低分子量γ-聚谷氨酸中的应用。

背景技术：

γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是一种微生物发酵产生的谷氨酸聚合物，而相对分子量是其重要特征参数，与其生物学功能密切相关。低分子量的γ-PGA在化妆品中应用广泛，具有保湿、维持皮肤弹性、提升天然保湿因子含量、美白肤色、促进营养成分吸收等功效。还有研究使用低分子量的γ-PGA制备药物载体，使药物容易渗透到达作用位点。但是直接发酵产物分子量较大(＞1000kD)，有必要生产低分子量γ-PGA。目前已报道多种获得低分子量γ-PGA的方法，如筛选产低分子量γ-PGA的生产菌，但筛选周期长，不确定性高；分段收集，但得率低；采用酸、碱或超声水解，虽然是现在生产γ-PGA最常用的方法，但有数据表明水解后其含量会减少32％；酶解法效率高，但还处于实验研究阶段。如果能在直接发酵获得低分子量的γ-PGA，则是一种高效低成本生产低分子量γ-PGA的新工艺，具有潜在的经济和社会效益。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供山梨酸或其盐在枯草芽孢杆菌发酵生产低分子量γ-聚谷氨酸中的应用。

优选，所述的低分子量γ-聚谷氨酸为分子量低于245kD的γ-聚谷氨酸。

本发明的第二个目的是提供一种发酵生产低分子量γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将山梨酸或其盐加入到发酵培养基中并混合，由此得到含有山梨酸或其盐的发酵培养基，然后将枯草芽孢杆菌接种到含有山梨酸或其盐的发酵培养基中发酵培养生产低分子量γ-聚谷氨酸；

或者，将枯草芽孢杆菌接种到发酵培养基中发酵培养，当发酵液中γ-聚谷氨酸含量达17g/L以上时，加入山梨酸或其盐至发酵液中，混合后继续发酵培养生产低分子量γ-聚谷氨酸。

优选，以山梨酸计，所述的山梨酸或其盐在含有山梨酸或其盐的发酵培养基或发酵液中的浓度为0.037～3.7g/L。即是将山梨酸或其盐加入到发酵培养基中并混合，此时以山梨酸计，山梨酸或其盐的终浓度为0.037～3.7g/L，进一步优选为0.37～0.75g/L。或者所述的将山梨酸或其盐加入发酵液中，此时以山梨酸计，山梨酸或其盐的终浓度为0.037～3.7g/L。

优选，所述的山梨酸盐选自山梨酸钾、山梨酸钠或山梨酸钙。

优选，所述的发酵培养基每升含有：柠檬酸12g、甘油80g、L-谷氨酸20g、氯化铵7g、磷酸氢二钾0.5g、七水硫酸镁0.5g、二水氯化钙0.15g、六水氯化铁0.04g和一水硫酸锰0.104g，余量为水，pH 6.5。

优选，所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7，其保藏编号为：CCTCC NO：M206102。

所述的将枯草芽孢杆菌接种到含有山梨酸或其盐的发酵培养基中发酵培养或者将枯草芽孢杆菌接种到发酵培养基中发酵培养，优选，其种子液的接种量为1～10％，发酵温度37℃，在往复式摇床振荡培养72～120h，摇床转速80～150r/min，冲程为65～75mm。

本发明将山梨酸或其盐应用于枯草芽孢杆菌的γ-聚谷氨酸发酵生产，可以提高低分子量γ-聚谷氨酸的产率。利用本发明的发酵生产低分子量γ-聚谷氨酸的方法，使高于245kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸的百分数从原来的80.28％下降到21.50％～72.18％，100-245kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸的百分数从原来的19.72％上升至27.49％～52.72％，而低于100kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸的百分数从原来的0上升至0.3％～25.78％；也使γ-聚谷氨酸的产量维持15g/L以上。本发明的山梨酸或其盐提高低分子量γ-聚谷氨酸的产量的发酵方法简单有效，提供了一种有别于物理或化学方法生产低分子量γ-聚谷氨酸的方法。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

以下实施例中的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为：CCTCC NO：M206102，该菌公开于专利号：ZL 200610122640.5，发明名称为：γ-聚谷氨酸产生菌及利用该菌株制备γ-聚谷氨酸的方法的专利中。

实施例1：

菌种的活化：将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7菌种接种在固体培养基斜面上，37℃培养16～24h，得到活化的枯草芽孢杆菌菌种。所述的固体培养基的成分：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，琼脂20g/L，余量为水，pH7.0～7.2；配制方法是将上述成分混合均匀后，调pH值，然后灭菌备用。

种子液的制备：取2环上述活化的枯草芽孢杆菌菌种，接入装有50mL发酵培养基的300mL三角瓶中，37℃，100rpm振荡培养18h，得到枯草芽孢杆菌种子液。所述的发酵培养基的成分：柠檬酸12g/L，甘油80g/L，L-谷氨酸20g/L，氯化铵7g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，七水硫酸镁0.5g/L，二水氯化钙0.15g/L，一水硫酸锰0.104g/L，六水氯化铁0.04g/L，余量为水，调pH为6.5；配制方法是将上述成分混合均匀后，调pH值，然后灭菌备用。

液体摇瓶发酵：按上述方法配制发酵培养基，分装50mL入300mL三角瓶，将枯草芽孢杆菌种子液按接种量为体积分数2.5％接入到发酵培养基中，发酵温度37℃，在往复式摇床振荡培养48h，摇床转速80r/min，冲程为65mm；当发酵液中γ-聚谷氨酸达到17g/L时，加入无菌的山梨酸钾溶液，使发酵液中山梨酸钾浓度达到5g/L(以山梨酸计，浓度为3.7g/L)，继续培养48h。发酵完毕，检测γ-聚谷氨酸的产量为22.58g/L。分子量分布为高于245kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为72.18％，100-245kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为27.49％，低于100kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为0.33％。

实施例2：

菌种的活化和种子液的制备步骤与实施例1相同。

液体摇瓶发酵：将山梨酸溶于乙醇中，配制成母液。在发酵培养基(配方同实施例1的发酵培养基)中加入山梨酸母液，使山梨酸的终浓度为0.037g/L，配制成含有山梨酸的发酵培养基，分装50mL入300mL三角瓶，将枯草芽孢杆菌种子液按接种量为体积分数10％接入到含有山梨酸的发酵培养基中，发酵温度37℃，在往复式摇床振荡培养72h，摇床转速150r/min，冲程为75mm。发酵完毕，检测γ-聚谷氨酸的产量为23.82g/L。分子量分布为高于245kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为68.86％，100-245kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为30.84％，低于100kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为0.3％。

实施例3：

菌种的活化和种子液的制备步骤与实施例1相同。

液体摇瓶发酵：在发酵培养基(配方同实施例1的发酵培养基)中加入山梨酸钙，使培养基中的山梨酸钙浓度达0.087g/L(以山梨酸计，浓度为0.075g/L)，配制成含有山梨酸钙的发酵培养基，分装50mL入300mL三角瓶，将枯草芽孢杆菌种子液按接种量为体积分数1％的量接种至含有山梨酸钙的发酵培养基中，发酵温度37℃，在往复式摇床振荡培养96h，摇床转速110r/min，冲程为75mm。发酵完毕，检测γ-聚谷氨酸的产量为22.333g/L。分子量分布为高于245kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为50.75％，100-245kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为44.94％，低于100kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为4.31％。

实施例4：

菌种的活化和种子液的制备步骤与实施例1相同。

液体摇瓶发酵：在发酵培养基(配方同实施例1的发酵培养基)中加入山梨酸钾，使培养基中的山梨酸钾浓度达0.5g/L(以山梨酸计浓度为0.37g/L)，配制成含有山梨酸钾的发酵培养基，分装50mL入300mL三角瓶，将枯草芽孢杆菌种子液按接种量为体积分数5％的量接种至含有山梨酸钾的发酵培养基中，发酵温度37℃，在往复式摇床振荡培养96h，摇床转速150r/min，冲程为75mm。发酵完毕，检测γ-聚谷氨酸的产量为17.48g/L。分子量分布为高于245kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为28.26％，100-245kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为51.51％，低于100kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为20.23％。

实施例5：

菌种的活化和种子液的制备步骤与实施例1相同。

液体摇瓶发酵：在发酵培养基(配方同实施例1的发酵培养基)中加入山梨酸钠，使培养基中的山梨酸钠浓度达0.89g/L(以山梨酸计浓度为0.75g/L)，配制成含有山梨酸钠的发酵培养基，分装50mL入300mL三角瓶，将枯草芽孢杆菌种子液按接种量为体积分数10％的量接种至含有山梨酸钠的发酵培养基中，发酵温度37℃，在往复式摇床振荡培养120h，摇床转速110r/min，冲程为65mm。发酵完毕，检测γ-聚谷氨酸的产量为15.49g/L。分子量分布为高于245kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为21.50％，100-245kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为52.72％，低于100kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为25.78％。

对比例1：

菌种的活化：将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7菌种接种在固体培养基斜面上，37℃培养16～24h，得到活化的枯草芽孢杆菌菌种。所述的固体培养基的成分：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，琼脂20g/L，余量为水，pH7.0～7.2；配制方法是将上述成分混合均匀后，调pH值，然后灭菌备用。

种子液的制备：取2环上述活化的枯草芽孢杆菌菌种，接入装有50mL发酵培养基的300mL三角瓶中，37℃，100rpm振荡培养18h，得到枯草芽孢杆菌种子液。所述的发酵培养基的成分：柠檬酸12g/L，甘油80g/L，L-谷氨酸20g/L，氯化铵7g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，七水硫酸镁0.5g/L，二水氯化钙0.15g/L，一水硫酸锰0.104g/L，六水氯化铁0.04g/L，余量为水，调pH为6.5；配制方法是将上述成分混合均匀后，调pH值，然后灭菌备用。

液体摇瓶发酵：按上述按配方配制发酵培养基分装50mL入300mL三角瓶，将枯草芽孢杆菌种子液按照接种量为体积分数1％接种到发酵培养基中，发酵温度37℃。在往复式摇床振荡培养96h，摇床转速110r/min，冲程为75mm。发酵完毕，检测γ-聚谷氨酸的产量为25.68g/L。分子量分布为高于245kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为80.28％，100-245kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为19.72％，低于100kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为0。

对比例2：

菌种的活化和种子液的制备步骤与实施例1相同。

液体摇瓶发酵：将灭菌后的发酵培养基(配方同实施例1的发酵培养基)分装50mL入300mL三角瓶，将枯草芽孢杆菌种子液按接种量为体积分数5％的量接种至发酵培养基中，发酵温度37℃，在往复式摇床振荡培养96h，摇床转速150r/min，冲程为75mm。发酵完毕，检测γ-聚谷氨酸的产量为26.58g/L。分子量分布为高于245kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为77.23％，100-245kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为22.77％，低于100kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为0。

对比例3：

菌种的活化和种子液的制备步骤与实施例1相同。

液体摇瓶发酵：将灭菌后的发酵培养基(配方同实施例1的发酵培养基)分装50mL入300mL三角瓶，将枯草芽孢杆菌种子液按接种量为体积分数10％的量接种至发酵培养基中，发酵温度37℃，在往复式摇床振荡培养120h，摇床转速110r/min，冲程为65mm。发酵完毕，检测γ-聚谷氨酸的产量为27.56g/L。分子量分布为高于245kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为74.76％，100-245kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为25.24％，低于100kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为0。