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中国生物工程学会2014年学术年会暨全国生物技术大会

中国生物工程学会2014年学术年会暨全国生物技术大会

  • 召开年:2014
  • 召开地:温州
  • 出版时间: 2014-11-07

主办单位:中国生物工程学会

会议文集:中国生物工程学会2014年学术年会暨全国生物技术大会论文集

会议论文
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  • 摘要:聚酮化合物(polyketide)是一大类重要的天然产物,广泛来源于细菌、真菌和植物.这类化合物不仅结构多样,还具有广泛的生物学和药学活性,其成员包括了诸多人畜使用和农用的重要药物,如红霉素(erythromycin)、雷帕霉素(rapamycin)和洛伐他汀(lovastatin)等.目前,由聚酮衍生的药物每年涉及的销售额达到了数百亿美元,对聚酮天然产物的开发是当前新药研发领域的一个重要方向。获得多样化结构类似物是新药研发的首要条件,但由于聚酮化合物结构复杂,化学手段难以实现选择性修饰,因此基于生物合成途径的改造方法是目前创造聚酮碳骨架多样性的最有效方法。聚酮骨架是由聚酮合成酶(PKS)催化起始单元和延伸单元之间发生有序的claison缩合合成的。起始和延伸单元的使用是由PKS的各个酞基转移蛋白(AT)控制的。通过解析聚酮化合物splecoin的生物合成途径,发现了一条由苯丙氨酸合成芳香延伸单元苄基丙二酞单酞辅酶A的途径。通过体内外实验的验证,还发现了识别此类芳香延伸单元的AT功能域。
  • 摘要:幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)与人们的健康密切相关,是引起人的慢性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡等消化道疾病的重要病原菌,H.pylori的持续感染甚至可导致胃腺癌、胃淋巴瘤的发生.H.pylori可通过分泌多种致病性蛋白如(CagA、VacA、BabA)到宿主细胞中,参与宿主细胞病变过程.其中蛋白CagA是H.pylori非常重要的致病性蛋白,CagA可以激活宿主细胞内的非受体酪氨酸激酶c-Abl,激活的c-Abl能够促使CagA持续磷酸化,磷酸化的CagA参与宿主细胞的信号转导,诱使细胞发生病变.蛋白酶体是细胞内降解蛋白质的重要器官,待降解的蛋白质可在泛素连接酶的作用下被连接上泛素分子作为标记,从而进入蛋白酶体内腔进行降解。蛋白酶体可参与细胞凋亡、细胞分化,与炎症反应、肿瘤发生等疾病有密切关系。非受体酪氨酸激酶c-AbI也参与调节蛋白酶体的活性与稳定性。
  • 摘要:头孢菌素C(Cephalosporin C,CPC)是继青霉素之后的世界上第二大类β-内酰胺抗生素,而7-氨基头孢烷酸(7-ACA)作为头孢菌素类抗生素的关键中间体,在医药工业中具有重要价值.一般通过化学法或生物酶法脱去CPC的侧链而得到.因为生物酶法在利用CPC生产7-ACA中具有反应条件温和和对环境友好等优点,所以生物酶法开始成为工业生产的新方向.本文以来源于Pseudomonas sp KAC-1的CA(属于1类)蛋白序列为模版,对CA进行全局优化设计,人工合成得到目标基因并克隆至表达载体pET28b并实现了CAD的高效表达。通过SDS-PAGE分析可知表达的CA剪切不彻底,仍有一部分以前体形式存在,而自剪切的效率会影响CA的表达活性,因此对影响自剪切与活性的相关位点进行突变分析。通过结构分析,选择几个与ca活性和自剪切相关的位点进行饱和突变,发现这些位点氨基酸的替换可影响一次剪切和二次剪切。通过这些位点进行组合突变,最终得到了比活力提高了8.3倍的突变体CPCase-tib。
  • 摘要:唾液酸醛缩酶(NAL Sialic acid aldolase,EC 4.1.3.3)在生物体内可逆地催化N-乙酰-d-神经氨酸(Neu5Ac)的裂解而生成N-乙酰-d-甘露糖胺(ManNAc)和丙酮酸,从而参与糖类降解途径;在有机合成化学中,NAL通常用来催化丙酮酸与糖醛的羟醛缩合反应,因而有较好的应用前景.本实验室经过基因数据库发掘,从Clostrldlum difficile获得一个唾液酸醛缩酶(CdNAL),该有很好的酶活力以及相对较高的热稳定性,700℃下活力半衰期达到是4.5h。为研究该酶的催化反应机理及热稳定性特征,并为对其进一步改造研究提供理论依据,对该酶进行了表达纯化及晶体培养工作。在晶体培养中,使用Hamptonresearch试剂盒进行结晶在后续使用自配试剂对结晶条件进行了优化。酶分别和催化反应的底物供体ketobutyric以及受体N-acetyl-D-mannosamine共结晶的的晶体,结晶条件为25℃,结晶方法为气相扩散悬滴法.最终模型优化结果为:和ketobutyric共结晶的结构的Rwork=18. 2 %,Rfree=24.2% ;和N-acetyl-D-mannosamine共结晶结构的Rwork=18.3%,Rfree=24.5%。
  • 摘要:流感血凝素是流感病毒表面的主要蛋白之一,以三聚体形式存在,是流感疫苗的主要成分.流感血凝素变异、重配快,各种新型流感频发,新疫情爆发后,疫苗的快速研发和生产是疫情控制的关键.现有的流感疫苗主要通过流感病毒减毒株或重配株的鸡胚培养获得的病毒,经病毒纯化、灭活制备的灭活疫苗,或近一步经病毒裂解或纯化,制备的裂解疫苗和亚单位疫苗.本研究通过基因工程技术,以H7N9流感病毒为模型,建立了基因工程酵母制备H7N9流感病毒血凝素亚单位颗粒疫苗的技术。通过克隆H7N9流感病毒血凝素HA基因,构建酵母高效表达菌株,并建立发酵、纯化工艺,制备获得了血凝素糖蛋白亚单位纳米颗粒候选疫苗,在电镜下呈30nm左右的星状颗粒结构,在针对H7N9流感病毒的小鼠保护性实验中,该疫苗免疫的小鼠100%存活,而对照组全部死亡,证明该颗粒型流感疫苗对小鼠具有良好的保护性。
  • 摘要:杜氏/贝氏肌营养不良症(Duchenne/Becker muscular dystrophy,DMD/BMD)可分为两种类型,即DMD和BMD.DMD这是最常见致死性的X-连锁隐性遗传性肌病,以进行性肌萎缩无力伴小腿腓肠肌假性肥大为主要典型临床特征.约75%DMD患者存在一个或多个外显子大片段缺失或重复,剩余约25%被认为存在微小突变,包括点突变、小的插入缺失、复杂的微小重排等.在多数情况下,微小突变会导致翻译的提前终止,形成功能不全的截短蛋白,从而引起疾病的发生.将多重连接依赖性探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probeamplification, MLPA)应用于DMD/BMD的分子诊断。对来自18个家庭临床上怀疑为DMD的患者进行了MLPA分析,在6个患者的DMD基因中检测出1至多个外显子缺失(其中2例为新生突变),1例为外显子重复突变。该突变位于DiIID基因的关键剪接供体位点上,可能会影响所在内含子的识别和剪接。通过生物信息学工具对这突变进行预测,发现该突变点所在的5’端剪接供体位点失效了,并可能导致剪接方式的改变。利用杂种小基因剪接试验(hybrid minigene splicing assay, HMSA),从细胞水平上分析病人和正常人DMD基因中该突变相关位置发生了可变剪接的变化。
  • 摘要:左乙拉西坦(Levetiracetam)是一种毗咯烷酮衍生物,由比利时UCB公司研究开发,于2000年4月在美国上市,是目前唯一用于治疗局限性及继发性全身性癫痫的药品.2-氨基丁酰胺是左乙拉西坦生产中的重要中间体,通常采用化学法生产,生物法生产的报道较少.本论文内容涉及了2-氨基丁酰胺的检测方法的建立,产腈水合酶的微生物的筛选和发酵培养基的优化.探索利用生物酶(腈水合酶)催化2-氨基丁腈生产2-氨基丁酞胺的产酶条件的研究,为生物法工业生产2-氨基丁酞胺奠定理论基础。
  • 摘要:低血糖综合征(hypoglycemic syndrome)是一组由多种病因引起的综合征,血糖浓度常低于3.36mmol/L(60mg/dl),严重而长期的低血糖征可发生广泛的神经系统损害与并发症.Ⅰ型糖尿病中医源性低血糖分为无症状性低血糖、轻至中度低血糖症和严重低血糖症.而胰岛素依赖型糖尿病强化治疗使得病人患严重低血糖症的可能性增加三倍.临床上还没有一个明确的治疗方案来避免这种不良反应。本实验即是基于核磁共振的代谢组学方法研究优泌林R诱导的严重低血糖SD大鼠额叶脑组织的代谢轮廓变化,从而在整体代谢水平探索严重低血糖征的病理机制。注射优泌林R所引起的严重低血糖对于额叶有影响。在额叶中,发现Cho(胆碱)升高,Cho是胆碱复合物,是细胞膜的成分之一,其改变反映膜代谢状态的改变,其在细胞膜破裂时被释放出来,主要反映细胞膜结构成分,特别是髓鞘。Cho升高反映了髓鞘分解增加和/或神经胶质细胞增生,猜想额叶这个脑区可能受到一定程度的损伤。
  • 摘要:组织培养技术是通过无菌操作分离外植体,接种到培养基上,在人工控制环境下培养,形成完整植株.20世纪末植物组培技术朝着功能化、工厂化、产业化方向发展,在现代农业生产中广泛应用.我国野生药用植物资源种类繁多、分布广,只有少数被简单开发利用,大多数尚处于待开发状态.大多数属于濒临植物,资源严重破坏,适时而有效地开发利用野生药用植物资源,对提高人民生活水平,满足市场需求,发展当地经济均具有一定的意义.文章介绍了植物组培技术特点,植物组培技术的发展,野生药用植物资源应用,野生药用植物组培技术应用。我国野生药用植物的研究工作一直偏重于分类、植物化学、生物学特性等基础理论方面,而对于与产业化紧密相连的技术研究与推广工作则非常薄弱,远不能适应当前野生药用植物商品化和产业化开发的需要。因此,合理开发和应用野生药用植物资源需要深入研究,采用植物组织培养技术是可利用的主要方式之一。
  • 摘要:肿瘤血管生成是肿瘤生长、浸润、转移中不可缺少的生物过程,整合素αvβ3受体在新生血管内皮细胞和多种肿瘤细胞表面高度表达,含精氨酰-甘氨酰-天冬氨酰(Arg-Gly-Asp,RGD)三肽序列的多肽可特异性地与αvβ3受体结合,放射性核素标记的RGD肽有望应用于肿瘤血管生成显像与治疗.本文对131I标记的新型环RGD肽二聚体[c(RGD)2]在荷B16和U87两种小鼠肿瘤模型中的生物分布和显像进行研究,以探讨其应用于肿瘤血管生成显像和治疗的可能性。
  • 摘要:目的:对乙酰氨基酚(APAP)过量可通过诱导线粒体的功能障碍和损伤而引起肝脏坏死和急性肝脏损伤.尽管介导APAP诱导肝脏毒性的生化途径已经被研究的很清楚了,但是机体的减弱这种疾病的防御机制仍然难以捉摸.脂联素是脂肪细胞分泌的一种具有多效保护抵抗肥胖相关代谢机能异常的脂肪因子,在此研究了脂联素在APAP诱导小鼠肝脏急性损伤过程中的作用.rn 方法:脂联素敲除小鼠(ADN KO)和C57野生型对照小鼠用过量的APAP处理,然后通过组织和生化的方法评估肝脏损伤和自噬活性。在原代培养的脂肪细胞中探索脂联素抵抗APAP诱导的肝脏毒性机制。rn 结果:APAP过量引起脂联素在受损肝脏组织中大量累积。ADN KO小鼠在给予过量的APAP后表现出严重的线粒体功能障碍和损坏,氧化应激和坏死和更高的死亡率,而这些变化能够被单独注射脂联素所逆转。rn 结论:APAP诱导的脂联素在肝脏组织中累积并发挥相应的机制来改善肝脏毒性,是通过促进自噬介导清除损伤的线粒体实现的。脂联素激动剂可能代表了一类有前景的治疗药物诱导急性肝功能衰竭的方法。
  • 摘要:目的:构建醇脱氢酶(ADH)和甲酸脱氢酶(FDH)共表达的重组大肠杆菌,实现其对羰基化合物的不对称还原;对这两个在催化过程中的关键酶进行结构改造,以期提高全细胞催化效率.rn 方法:首先根据大肠杆菌密码子优化的原则将短乳杆菌(Lactobacillus brevis)来源的ADH和博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)来源的FDH的基因分别进行密码子优化,构建出共表达ADH和FDH的重组大肠杆菌,利用诱导表达后的双酶共表达重组大肠杆菌对苯乙酮进行全细胞转化,用生物信息学的方法分析ADH和FDH的结构特点,采用柔性结构或刚性结构对ADH和FDH进行串联实现融合蛋白的可溶表达,探索全菌催化体系的优化方案.rn 结果:诱导表达后的双酶共表达重组大肠杆菌对苯乙酮进行全细胞转化的转化率显著高于双菌双酶的催化效率,FDH C一端无序结构在酶活性发挥中起着重要作用,酶活测定结果表明以FDH-linker-ADH方式串联后的酶活性最高。rn 结论:本研究提示通过连接肽的合理设计,能够实现ADH及FDH的串联双功能蛋白的可溶性表达,实现高效率的前手性淡基化合物到手性醇的全细胞转化。本文在合成生物学层面,为手性醇生物转化方法的优化提供重要参考,并为新型生物催化体系的开发提供新的思路和方法。
  • 摘要:经过多年的努力,人们在脊髓发育机制方面的研究已经取得了长足的进展.由于不同转录因子的表达,脊髓背侧神经上皮层分为6个区(dp1-6),而腹侧神经前体细胞可以分为5个区(p0-3和pMN),每个区产生独特的神经细胞,它们可以被不同的神经前体细胞标记物所识别.Olig基因属于bHLH转录因子的一个亚家族,它包括Olig-3。Olig1和Olig2选择性地表达在脊髓的pMN区,并对运动神经元和少突胶质细胞的特化起着关键性的调控作用。Olig3是Olig家族中的第三个成员。研究发现在腹侧脊髓中Olig3主要表达在V3中间神经元中。
  • 摘要:目的:脑膜炎球菌(MenB)外膜蛋白fHbp是一种潜在的理想疫苗,本文旨在利用大肠杆菌原核表达系统获得该蛋白.rn 方法:根据GenBank中已知基因序列(HQ998858.1)设计引物通过PCR的方法从MenB毒株(53210)扩增fHbp基因,并连入原核表达载体pEASY-E1中,重组子经验证正确后转化大肠杆菌BL21感受态细胞后,优化诱导的IPTG浓度、诱导时间、诱导温度条件.rn 结果:经PCR检测结果表明成功的构建了原核表达载体pEASY-E1-rfHbpo.SDS-PAGE结果表明不同诱导条件中,诱导表达在时问为6h,温度37度,IPTG浓度为0.5mol/L时,重组蛋白fHby表达量最高。Western-Blot结果进一步证明大小为27kDa的蛋白条带为目的蛋白。并通过Ni-NTA亲和层析获得纯化的rfhbP蛋白。rn 结论:通过大肠杆菌原核表达成功获得了rfhbP重组蛋白,为进一步验证rfhbP生物学活性及MenB疫苗开发奠定基础。
  • 摘要:α-苯丙酮酸是一种多功能有机酸,广泛应用于制药、食品、化学工业.传统化学合成法污染严重,能耗高,产率低.L-氨基酸脱氨酶(EC1.4.3.2,L-AAD)催化L-氨基酸氧化脱氨基,生成相应α-酮酸和氨,多为黄素蛋白.Proteus mirabilis中一种L-氨基酸脱氨酶为膜蛋白,能够催化脂肪族和芳香族L-氨基酸,尤其对L-苯丙氨酸具有较高催化活性.本研究中,通过异源表达P.mirabilis氨基酸脱氨酶,成功构建了大肠杆菌全细胞催化剂,转化L-苯丙氨酸生产α-苯丙酮酸.对全细胞转化条件进行了优化,在最优条件下(生物催化剂浓度6 g/L,L-苯丙氨酸浓度14 g/L,pH为7.0,35 oC下转化12 h),α-苯丙酮酸产量为6.2 g/L,转化率为44.6%.此全细胞催化剂有望应用于工业化,实现低能耗、高效率、高纯度、无污染的α-苯丙酮酸生产,为生物转化合成酮酸提供新的策略。
  • 摘要:心血管疾病是危害人类健康最常见、最严重的疾病之一,瑞舒伐他汀是降低低密度脂蛋白胆固醇最强的药物,被称为"超级他汀".(R)-3-羟基戊二酸乙酯是合成瑞舒伐他汀侧链的关键中间体,由于已报道的合成方法存在反应条件苛刻、立体选择性差或反应底物浓度低等不足,亟待开发一个反应条件温和、绿色环保的合成新工艺.本文以(R)-4-氰基-3-轻基丁酸乙酯(A5)为原料,通过对本实验室现有的腈水解酶进行筛选,最终筛选到一种腈水解酶NIT能够催化高浓度A5的水解。进一步对腈水解酶NIT进行了固定化研究,以提高其稳定性、底物耐受及循环使用次数。通过对固定化载体海藻酸钠、壳聚糖、琼脂与聚丙烯酞胺的研究,发现海藻酸钠包埋的效果最好。
  • 摘要:L-赖氨酸是唯一带有侧链伯氨基的氨基酸,也是哺乳动物的必需氨基酸和生酮氨基酸.由于谷物食品中的赖氨酸含量极低,且在加工过程中易被破坏,故被称为第一限制性氨基酸,被广泛地应用于医药制造、食品和饲料添加剂等领域.目前,L-赖氨酸工业上主要以直接发酵法进行生产,它是以葡萄糖、甘蔗糖蜜等廉价原料为碳源,利用优良的L-赖氨酸生产菌种生产L-赖氨酸.其中,大肠杆菌作为一种典型的模式微生物,具有遗传操作简单、生长周期短等优点,因而被广泛的应用于L-赖氨酸的合成.在本研究中,以大肠杆菌K-12系列的MG1655为出发菌株,针对L-赖氨酸合成的限制性因素,对其进行了一系列代谢工程改造。首先敲除了编码赖氨酸脱羧酶的cadA和ldcC基因,提高了细胞内L-赖氨酸的积累。接下来通过定点突变解除了L-赖氨酸对编码天冬氨酸激酶的lysC基因和编码二氢吡啶甲酸合酶的dapA基因的反馈抑制,并对突变后的基因进行了过量表达,使得大肠杆菌的L-赖氨酸产量提高到了1.5 g/L左右。
  • 摘要:左乙拉西坦(Levetiracetam)是一种毗咯烷酮衍生物,由比利时UCB公司研究开发,于2000年4月在美国上市,是目前唯一用于治疗局限性及继发性全身性癫痫的药品.2-氨基丁酰胺是左乙拉西坦生产中的重要中间体,通常采用化学法生产,生物法生产的报道较少.本研究的内容涉及了2-氨基丁酰胺的检测方法的建立,产腈水合酶的微生物的筛选和发酵培养基的优化.首先,建立了2-氨基丁酰胺的高通量筛选方法,即薄层色谱检测法,随后,用已建立的薄层色谱法从实验室保存的产睛水合酶菌株中快速筛选出一株活力最高的菌株,编号ZJB09141(小球诺卡氏菌)酶活为5084 U/g。最后,采用响应面分析法对睛水合酶产生菌ZJB-09141的发酵培养基进行优化。
  • 摘要:MYB转录因子是最大的植物转录因子家族成员之一,参与细胞分化、细胞周期调节,并对植物次生代谢具有重要的调节作用,本文主要对MYB的发现、结构特征以及在植物黄酮类物质生物合成代谢调控中的作用及其作用机理研究进展作以综述,为开展MYB基因的克隆及功能研究提供参考.MYB转录因子的DNA结合域在不同植物中都比较保守,其由1-3个不完全重复构成,每个不完全重复了约由50-53个氨基酸构成。MYB转录因了的N端保守的DNA结合域是该类转录因子最关键的结构域,决定转录因子与不同作用元件的结合。在转录调控过程中MYB蛋白通过其DNA结合域与靶序列的特异结合来实现对靶基因的精确调控。
  • 摘要:冻干制剂是目前用于多肽类生物制品干燥保存的一种最常用和最有效的剂型.本文主要介绍了影响冻干制剂稳定性的因素,即冻干保护剂和保护机制.冷冻干燥是在一定条件下将对热敏感或在水溶液中不稳定的药物制成溶液低温预冻成固体,然后在真空条件下直接升华干燥除去水分的一种干燥方法。由于其处于低温下操作,且冻干后的蛋白质药物呈疏松状饼块样,有利于保存和药物重溶后的复性。显然,冻干技术为理化性质不稳定的多肤类药物制剂提供了一种有效的多肽类制备方法。然而冻干是一个复杂的相变过程,存在着多种因素诱导药品中多肽变性。冷冻过程中会产生多种冻结应力破坏多肤生物活性,其机制复杂,目前一般认为主要是由机械效应和溶质效应引起。干燥好的制剂出箱后要及时密封,否则与空气接触后容易吸潮、产生萎缩等现象。在冻干制剂的配方中通常要加入各种辅料来保护药品的生物活性。但是辅料如果使用不当或一些条件的变化,反而会起到负作用。比如,在冻干制剂中,无定型甘露醇可以处于亚稳定的玻璃态,其Tg为45度,如果保存不当,样品温度达到此点,甘露醇开始有玻璃态转变到晶态,其无水结晶的形成使基质中水分分布发生变化,水分从无定型状态的甘露醇中转移到剩余的基质中,导致基质的Tg下降,引起冻干干制品的团块萎缩现象,影响产品外观。多肤冻干制品保护剂可分为多轻基化合物、糖类、氨基酸、聚合物、蛋白质等几大类。
  • 摘要:拟南芥CCA1基因在调节拟南芥光周期敏感性,依赖于光周期的胚轴伸长、种子的萌发以及对冷胁迫的适应性方面具有重要作用.本研究以热带玉米自交系B73以及强优势杂交组合豫玉22及其亲本自交系为材料,对前期克隆的玉米CCA1基因进行不同光周期处理条件下的表达分析以及在杂交种与亲本间的差异表达分析,并结合其在光周期网络途径中的其他互作基因的表达情况,研究了昼夜节律钟响应基因的差异表达与玉米杂种优势的关系.
  • 摘要:2013年8月作者用热相仪显现了人体中的经络和气,用实验证明了气是一种有生命信息能量的物质.气是细胞新陈代谢的动力,气是血之帅.气是一种综合的、复杂的、人体生命存在时才有的物质,即气具有生命信息性、波动性、粒子性等.从物理方面气包括所有现知的物质运动的能量如电磁能、万有引力能、机械能等,从生化方面气包括细胞、细胞通讯、DNA的遗传密码、染色体所带的信息、信使核糖体、转移核糖体、蛋白质等等的能量,以及未知的生命物质信息的能量.人体中有生命信息的生物大分子都处在正常体温(约37度)的大环境中,根据物理学理论,大分子受到刺激后都产生远红外电磁波,他是生命信息的载体.气在体内的传导速度是远红外产生的热效应在体液中的传递速度.气是能量,可用探测能量的仪器去探测.有生命活性的物质才具有气,生命物质离不开有形的血,因此说血是气之母.
  • 摘要:本研究对截获的一批非法入境药材样品用ITS1及TrnL-TrnF序列进行鉴定.对测序结果与GenBank中的同源序列进行比对分析,发现未知样品与马来沉香(Aquilaria malaccensis)的序列相似性最高,达到99%-99.7%,遗传距离最小,为0.00-0.01.用邻接(NJ)法构建IST1和TrnL-TrnF序列的系统进化树,未知样品均与马来沉香聚为一枝,bootstrap values分别为77%和100%.上述结果表明可利用IST1和TrnL-TrnF从分子水平区分马来沉香与其他混伪种.
  • 摘要:目的:观察KGF-2体外对人角膜上皮细胞,人角膜基质细胞的增殖及迁移作用.rn 方法:体外培养人角膜上皮细胞,人角膜基质细胞,四甲基偶氮唑盐比色法(MTT 法)检测细胞增殖;体外划痕试验检测KGF-2对角膜上皮细胞,基质细胞促迁移作用研究.rn 结果:KGF-2 在1ng·mL-1~100ng mL-1之间对角膜上皮细胞有促进增殖作用且呈现剂量-效应关系;然而,在角膜基质细胞,KGF-2对其的促增殖作用,需要外源性肝素钠的调控;在外源肝素存在条件下,KGF-2 在1μg·mL-1 ~100μg·mL-1之间对角膜基质细胞有明显的促进增殖作用且呈现剂量-效应关系.KGF-2对角膜上皮细胞和角膜基质细胞有加速细胞迁移的作用.rn 结论:KGF-2对角膜细胞的修复作用与增加了角膜上皮细胞和基质细胞的增殖与迁移有关。
  • 摘要:黄酮醇合酶(flavonol synthase,FLS)是黄酮化合物代谢途径中的关键酶之一.本研究在红花转录组测序结果中获得FLS中间序列的基础上,采用RT-PCR和RACE技术,从我国传统中药材红花花瓣中克隆到黄酮醇合酶基因的全长cDNA.该基因全长1201bp,开放阅读框1011bp,编码336个氨基酸.系统进化分析表明,红花FLS基因编码氨基酸与同属菊科植物氨基酸具有一定的同源性,其中与金光菊的亲缘关系最近。根据红花FLS基因片段设计PCR引物进行荧光定量PCR,结果表明,红花FLS基因在吉红油姊妹系的盛花期表达量最高。同时,通过分子生物学方法,成功构建pBASTA-FLS植物表达载体,为后续研究该基因的功能鉴定及在黄酮化合物合成途径中的作用奠定了基础。
  • 摘要:固定化β-半乳糖苷酶具有易于分离、可重复使用等优点,在低聚半乳糖和低乳糖乳生产中具有重要应用.比较了两种固定化酶载体—环氧基树脂(EP)和氨基功能树脂(HA),固定化亮白曲霉来源β-半乳糖苷酶的效果.氨基功能载体酶固定化率为72.5%,固定化酶活力可达到145 U/g,而环氧基树脂酶固定化率为24%,固定化酶活力为24 U/g.两种固定化β-半乳糖苷酶的最适温度、最适pH与游离酶相同.但是氨基载体固定化酶的热稳定性明显高于游离酶及环氧基载体固定化酶,其在重复使用20次后,酶活力保持在60%左右.以300 g/L的乳糖为起始浓度,通过该氨基载体固定化酶生产低聚半乳糖(GOS),最大产量为87g/L。
  • 摘要:利用植物油体表达系统生产蛋白,是生物反应器研究的热点.具有生产成本低、来源广、易于大规模生产、不含危害人类健康的病原生物等优点,并且重组蛋白可以在种子内长期、稳定地贮存.肝细胞生长因子(HGF)是1984年Nakamura从肝部分切除的鼠血浆中分离和部分纯化并命名的,成熟HGF是由重链(α链)与轻链(β链)通过链间二硫键连接而成的异二聚体.利用基因工程表达人HGF(hHGF)是大量获取具生物活性HGF的有效途径。而利用植物油体表达系统表达HGF不仅价格低廉,而且植物来源广,易于大规模生产,可大大降低生产成本。研究利用转基因拟南芥和红花种子成功地特异性表达了人HGF(hHGF)并获得了转基因拟南芥T3代和转基因红花T2代。为利用植物油体表达系统生产药用蛋白奠定了基础,同时提供了一个可能使用的大规模产hHGF的方法。
  • 摘要:β-丙氨酸及其衍生物被广泛应用于医药、食品、饲料及化工等领域.β-丙氨酸的合成方法有化学法和生物法两种,通过β-氨基丙腈的水解是合成β-丙氨酸重要方法之一.然而腈类物质的化学法水解,通常需要强酸、强碱、高温等苛刻条件,反应过程中也会产生一些副产物以及大量的盐类物质,且对于环境污染较大.腈基水解酶(Ntilase,EC3.5.5.1)能够催化腈类物质直接水解生成相应的羧酸,为通过β-氨基丙腈的水解得到β-丙氨酸提供了一个温和、绿色、环境友好的合成途径.通过对实验室现有腈基水解酶筛选得到能够催化高浓度(210g/L) β-氨基丙腈的腈基水解酶,通过将腈基水解酶与天冬氨酸裂解酶的反应进行串联,消耗掉腈基水解酶催化过程中产生的NH3,解决了腈基水解酶催化过程中NH3释放对环境的污染问题,同时也有效地降低了3-氨基酞胺的生成。
  • 摘要:膀胱癌是一种很难治愈的恶性肿瘤,术后大约70%患者易复发,因此需要反复多次治疗,费用十分昂贵.通常经尿道膀胱肿瘤切除术治疗后,再辅以膀胱内灌注化疗或免疫治疗以防复发和延缓肿瘤进展.然而,灌注的化疗药物在膀胱内保留时间短,渗透膀胱上皮粘膜的效率低,且毒副作用大而限制了其治疗效果.基于此,开发既具有粘附又具有药物缓控释释放性能的药物载体应用于膀胱内灌注化疗成为研究的热点.针对膀胱内给药遇到的关键问题,将开发既具粘附又具可控药物释放性能的聚糖类和聚糖表面修饰的纳米药物载体,使其粘附于膀胱壁粘膜层并持续释放抗癌药物,从而增加抗癌药物在膀胱内的作用时间.此外,将磁性纳米粒子附着或包埋的药物载体也将被制备,并研究其通过磁热疗和化疗协同效应提高治疗效率。
  • 摘要:RsmA是假单胞菌属高度保守的全局性调控因子,该蛋白可通过与靶基因的mRNA结合影响其稳定性或者抑制靶基因的翻译影响蛋白表达.固氮施氏假单胞菌A1501中发现一个rsmA同源基因及一个可能参与rsmA活性调节的非编码小RNA rsmZ基因.对A1501菌中RsmA及RsmZ的分子进化及表达特性进行了研究.分析结果表明,RsmA与铜绿假单胞菌同源性可达98%,RsmZ具有4个RsmA的结合位点.实时定量RT-PCR结果显示,rsmA在生长初期具有高表达量,而在指数生长期以及平台稳定期表达量下降.非编码RNA rsmZ的转录水平在整个生长时期未发生显著变化。
  • 摘要:红花花瓣富含多糖、多酚和花色素苷等次生代谢产物,严重影响花瓣总RNA的提取.为探索适合红花花瓣总RNA的提取方法,通过对4种RNA提取方法,RNA提取试剂盒、RNAiso Plus试剂法、改良的CTAB法和SDS法进行比较研究,以获得质量较好的红花不同时期的花瓣总RNA,为后续分子生物学实验奠定基础.结果表明,,高,浓度高.通过RT-PCR验证,所提取的RNA可以满足基因克隆、实时定量PCR等分子生物学实验要求。
  • 摘要:3-羟基丙酸(3HP)被美国能源部列为12种高附加值的生物基化学品之一.当前研究的3HP生物合成途径主要有两类:一类为使用维生素B12依赖型甘油脱水酶及醛脱氢酶将甘油转化为3HP,而维生素B12价格昂贵,已经成为阻碍这一途径步入商业生产的主要缺陷之一;另一类为使用丙二酸单酰辅酶A还原酶(MCR)将脂肪酸合成中间体丙二酸单酰辅酶A转化为3HP,因而可利用多种木质纤维素水解的糖类物质为原料进行3HP的生产,但该途径3HP产量太低.通过对MCR蛋白序列的分析,将MCR拆分成了两个具有独立活性的功能片段MCR-N和MCR-C。MCR-C将丙二酸单酞辅酶A转化为丙二酸半醛,而MCR-N进一步将丙二酸半醛转化为3HP,发现MCR-C催化的反应为限速步骤,并进一步测定了MCR-C的酶动力学性质,鉴定了其催化位点和辅酶结合位点。发现MCR蛋白拆分为两个结构域后,整体催化能力有明显提高。
  • 摘要:为了更好地了解聚乙二醇PEG与蛋白质结构-性能关系,调查了水溶液中不同分子量的PEG和PEG:蛋白质的不同的质量比和蛋白质之间相互作用.蛋白质和PEG的相互作用一直是一个被忽视的议题.从荧光光谱,核磁共振,原子力显微镜得到的集体数据表明,在水溶液中长链PEG更能够与蛋白质相互作用.这种往往被忽视的长链PEG与蛋白质相互作用在本章节体现在,蛋白的色氨酸荧光的提高,诱导了更多聚合物结合在蛋白质上,增加了蛋白质的疏水腔,提供了蛋白质和PEG的多个结合位点(核磁共振),使形成PEG-蛋白质复合物变得容易吸附在HOPG表面(原子力显微镜)。相反,短链PEG与此不同,表现出与蛋白质的很小几乎没有的相互作用。这种PEG与蛋白的作用与分子量密切的相关,原因在于PEG链中-CH2-CH2基团的存在,高分子量的PEG表现出两亲性,而不像低分子量PEG表现出的超强的亲水性。相比传统的PEG观点,数据在溶液中支持PEG的分子量在控制PEG-蛋白质相互作用中起着重要的作用,并且高分子量的PEG可以改变蛋白质的微环境和构象,而这种变化不应忽视,因为这种相互作用非常有可能改变PEG修饰的蛋白质的活性的改变。这项工作能够对PEG的结构性能有更好的理解并提出新的见解,这有助于将来设计更多更好的基于PEG优良性能的生物医学的材料。
  • 摘要:丙酮酸(Pyruvic acid),又称2-氧代丙酸(2-oxopropanoicacid)、α-酮基丙酸,是最重要的有机酸之一,广泛应用于生物制药、农用药品、食品工业、生化研究、传感器及医用等领域.丙酮酸的合成已逐渐由生物制造法代替了传统生产工艺,丙酮酸是微生物细胞代谢的中心中间代谢产物,正常代谢过程中无法在细胞内大量积累,故微生物法合成丙酮酸首先需要构建能够大量积累丙酮酸的平台菌株;发酵过程中通过分批添加高温灭菌的固体CaCO3来调节pH值,生成的丙酮酸钙还需要进一步的分离提纯等流程来获得丙酮酸,使得丙酮酸生产、纯化成本变高,流程繁琐且耗时更长,为解决这一问题,拟通过适应性进化手段驯化筛选出能够耐受低pH值的丙酮酸高产酵母菌株.本课题的意义在于建立了丙酮酸高通量筛选方法-双酶偶联法,该方法具有高效率、低成本、高准确度的特点,避免了常规液相HPLC法检测时前期样品处理的繁琐及检测过程耗时长的缺点;构建了能够积累丙酮酸的PDC基因缺失平台菌株,可作为后续代谢工程改造丙酮酸生产菌株的出发菌;利用TALEN蛋白介导构建突变库,获得耐低pH值同时高产丙酮酸的菌株,该菌株可以减少了大规模发酵生产中控制pH值及后续丙酮酸分离纯化的繁琐工作量,为丙酮酸生物制造研究奠定了一定的基础。
  • 摘要:高脂血症是体内脂质代谢紊乱导致血脂水平增高,并由此引发一系列临床病理表现的病症.饮食不节等可导致机体的功能减弱或失调,脂质代谢紊乱,发生高脂血症.研究表明高脂血症最主要、最直接的损害是加速全身动脉粥样硬化,是心血管疾病最重要的危险因素之一,同时与中风、糖尿病、高血压、脂肪肝等疾病有着密切关系.因此,有效降低血脂是目前临床研究的热点之一.多糖是一类广泛存在于动物细胞膜、植物和微生物细胞壁中的生物高分子物质,多糖能提高机体免疫力、促进细胞因子生成,同时还具有抗肿瘤、抗氧化及抗疲劳等功能。多种多糖物质包括魔芋多糖,南瓜多糖,枸杞多糖等,其动物实验表明一定种类的多糖及富含多糖的物质具有显著降血脂效果。
  • 摘要:生物丁醇是一种重要的化工原料和极具潜力的新型燃料,然而目前生物法制造丁醇与石化方法相比,并无显著经济竞争力.为提高丁醇发酵的经济效益,本文基于丙酮丁醇梭菌中乙偶姻和丙酮生成的竞争性关系,采用基因工程手段将传统丁醇发酵中的廉价副产物替换为高值化学品乙偶姻.研究表明,乙酰乳酸脱羧酶基因alsD是丙酮丁醇梭菌中乙偶姻合成的关键基因,强化表达alsD基因大幅提高了丙酮丁醇梭菌的乙偶姻产量而降低了丙酮产量.失活乙酰乙酸脱羧酶基因adc彻底消除了丙酮的产生而进一步提高了乙偶姻得率.对发酵条件进行优化后,所得基因重组菌株最终产生丁醇(13.8 g/L)、乙偶姻(4.3 g/L)、乙醇(3.9 g/L),而无丙酮.最终实现了乙偶姻完全取代丙酮与丁醇联产的目的,丁醇发酵的总产品得率以及产品价格均得以提升,为提高生物丁醇的经济效益提供了重要思路,也为后续丁醇联产2,3-丁二醇的研究奠定了基础.
  • 摘要:能量在自然界无处不在,微藻可利用光能和CO2合成有机质从而储存化学能.被誉为第三代生物能源的微藻能源(Biofules from microalgae,微藻生物燃料)的产业化潜力巨大,近年来已成为国内外生物能源和碳减排领域的研发热点.目前国内外大多处于原创技术开发、中试阶段,仅少数进入示范阶段,特别是美国Sapphire energy 公司的能源微藻规模化培养面积已达数千亩并建立了配套的全能源化产品(Bio-oil,生物油)加工系统.华东理工大学和嘉兴泽元生物制品有限责任公司等在国内外独创的"高值产品与碳减排耦联的微藻生物燃料"生产新模式,可大幅降低微藻能源(固碳)的成本,其中的高附加值产品已完成工业化试验,微藻生物燃料及微藻固碳部分已进入中试阶段.基于笔者多年的研发实践和今年对美国及欧洲微藻企业与研究机构的考察结果提出如下观点,包括对微藻能源产品重要性的再认识液体燃料的不可替代性及其作为石化产品原料与生物基化学品的巨大市场需求(微藻是直接利用阳光合成生物基化学品,其效率更高)。对微藻能源、微藻固碳及微藻废水处理等的一体化认识微藻能源、微藻固碳及微藻废水处理的出发点不同,但本质相同(均利用微藻的光自养培养特性),要实现产业化则必须设计系统的产品路线,是典型的生物产品工程,隶属工业生物技术范畴,但必须通过光自养培养解决大宗原料来源问题等。
  • 摘要:目的:低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension,HPH)是多种心肺疾病发生发展的重要病理环节,其发病机理十分复杂,其肺动脉平滑肌细胞增生肥大等引起的中膜增厚是肺动脉高压主要的病理变化.因此,尝试控制平滑肌细胞增殖,一直是肺动脉高压治疗过程中的重要策略.有研究表明,新近发现的生物活性肽apelin,在肺等大型脏器中高度表达,具有调节循环稳态、抗炎与免疫调控和血管发生等多种广泛生理学效应,但其对肺动脉平滑肌细胞增殖的影响及具体机制和信号途径尚不明确.本课题组主要通过低氧处理平滑肌细胞,观察apelin对细胞增殖及自噬的影响并探讨其机制,望为肺动脉高压的治疗提供新思路及药物靶点.rn 方法:本课题组将体外原代培养的大鼠PASMCs放置于三气培养箱中细胞增殖的影响。MTT方法检测各组的PASMCs增殖率;流式细胞仪检测细胞周期的变化;划痕法检测细胞迁移的变化;通过免疫荧光染色和免疫印迹法检测白噬空泡及白噬相关蛋白的表达变化。通过上述实验研究,旨在初步探讨apelin在低氧诱导的细胞增殖抑制中,是否具有调节作用,及其相关分了机制。rn 结果:与对照组比较,单独应用apelin组的PASMCs细胞增殖率无明显变化。与对照组比较,1%低氧组PASMCs增殖率及迁移速度明显增加,同时明显促进了细胞周期进程,细胞内出现大量白噬空泡,LC3-Ⅱ蛋白表达增强。与1%低氧组比较,1μmol/ L apelin明显抑制低氧引起的细胞增殖率和迁移速度的增加,且白噬相关蛋白LC3-Ⅱ表达降低及白噬空泡积聚程度明显下降。rn 结论:本研究表明,低氧激活白噬过程并促进了PASMCs增殖和迁移及细胞周期进程,而小分了活性肽apelin在一定程度上通过抑制白噬进程,达到抑制肺动脉平滑肌细胞增殖和迁移的作用,为肺动脉高压疾病的治疗提供一种新的策略。
  • 摘要:多基因复合性状是当前转基因植物发展的主要特色,而且在转基因产品安全评价中,要求去除选择标记基因,以避免选择标记基因可能带来的安全性问题.因此,培育多性状无选择标记基因的转基因植物是当前研究的热点问题之一.目前已提出多种去除筛选标记或多基因转化系统,其中同一载体中含有多个T-DNA的共转化策略是能够同时实现去除筛选标记和多基因转化的简单有效的方法,但多克隆位点中有限的酶切位点限制了插入基因的数目.本研究通过同尾酶技术和双T-DNA技术的结合,构建了多基因双T-DNA植物表达系统。此系统包含2个载体:一个为双T-DNA的植物表达载体DT2300,另一个为基因表达盒构建载体2300M。构建的多基因表达系统能够至少表达6个目标基因,而且通过后代筛选,从而建立起了无选择标记的多基因共转化技术体系,为多基因共转化提供了新的有用工具。
  • 摘要:鼠李糖脂是一种阴离子生物表面活性剂,其一般是由1~2个鼠李糖与1~2个β-羟基脂肪酸连接组成,可以作为乳化剂、乳化稳定剂、破乳剂、保湿剂、防腐剂等应用于食品、日化工业、农业、环保等领域.相对于化学表面活性剂,鼠李糖脂具有低毒性和良好的生物降解性等优点.同时,鼠李糖脂的抑菌特性也使其具有成为环境友好灭菌剂的潜力.在脂肪酸β氧化有利于鼠李糖脂合成的前提下,发现甘油混合脂肪酸可以提高鼠李糖脂的产量,并减少发酵时间。比较葵酸、月桂酸、棕榈酸和硬脂酸,发现月桂酸与甘油的混合双碳源发酵能大大提高鼠李糖脂。在下游提取中,相比以油料为底物的鼠李糖脂发酵,双碳源鼠李糖脂发酵后,甘油、脂肪酸和鼠李糖脂能够很好分开,可以降低纯化成本,最终使鼠李糖脂能够可以应用于洗涤及化妆品等领域。
  • 摘要:猪表皮生长因子(porcine epidermal growth factor,pEGF)作为一类重要的乳源性生长因子,能够刺激小肠DNA合成及细胞增殖,促进肠道发育,从而提高断奶动物生产性能及免疫功能等.本研究比较分析了胞内EGF、胞外EGF以及含His标签EGF在断奶仔猪中的生物学活性,为研发一种更适用于畜牧生产及临床医学的表达方式是具有重要意义.
  • 摘要:松弛素与胰岛素、类胰岛素生长因子IGF一样属胰岛素家族成员,是由两条短链构成的短肽激素.具有软化生殖道组织、刺激乳腺生长与分化,调节卵泡发育、舒张血管、抗炎及促进伤口愈合等生理作用.近几年发现,人松弛素在临床上还具有治疗心衰的作用.诺华公司研制的重组人松弛素2(serelaxin)Ⅲ期临床试验表明,与对照组相比,serelaxin不仅能大大缓解呼吸困难,还明显降低了住院期间心衰加重的状况,显著缩短了ICU停留时间和总住院时间,改善生物标志物,而且药物安全性良好.本研究为生物法获得重组人松弛素2提供了新的途径,酵母制备获得人松弛素2可白切割C肤,无需体外酶切、一步法实现焦谷氨酸化修饰,即可获得与天然结构一致的人松弛素2,为该产品的进一步研制提供了很好的基础,该技术具有高效、低成本、易规模化的优点,具有广阔的商业化前景。
  • 摘要:α-酮异己酸(KIC)是亮氨酸代谢中的重要前体物质,在医药、食品、饲料等行业有着重要的应用前景.来自Proteus vulgaris的氨基酸脱氨酶具有广泛的底物特异性,并且自身含有可定位信号肽,可以将酶展示于大肠杆菌表面.本研究中通过在E.coli BL21(DE3)中异源表达来自Proteus vulgaris的氨基酸脱氨酶基因,并利用全细胞转化的方法,催化底物亮氨酸脱氨基形成α-酮异己酸.同时,对全细胞转化的条件(底物浓度、转化温度、菌体量、转化时间)进行优化,发现细胞浓度为0.8 g/L,L-亮氨酸浓度为100 mM,温度为35oC,转化时间为16 h时,α-酮异己酸产量为12.73 g/L,转化率为97%.这种α-酮异己酸的生产方法转化效率高,产物纯度高,反应条件温和,易于分离和纯化,为工业化利用L-亮氨酸为底物生产α-酮异己酸奠定了基础.
  • 摘要:磷脂酶CE1(phospholipase C epsilon-1,PLCE1)是新发现的磷脂酶家族C新成员,其分子结构和功能较为复杂,在细胞信号转导过程中可能起重要作用.PLCE1的激活可引起一系列的生化反应,最终调节细胞的生长、增殖、分化等.此外,PLCE1特有的CDC25和RA相关结构域具有鸟嘌呤核苷酸交换活性,能够与小G蛋白的Ras超家族之间相互作用,参与MAPK信号通路,影响细胞骨架改变、细胞运动、增殖、凋亡、肿瘤生成及发展等.PLCE1基因的外显了上rs3765524和rs2274223位点与胃癌发生相关,并影响该基因的表达参与胃癌发生,初步可以看作为胃癌诊断和治疗的有效候选分了,为胃癌的发病机理研究奠定理论基础。
  • 摘要:γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是由微生物合成的细胞外氨基酸聚合物,由D型和L型一谷氨酸通过γ-酞胺键连接而成。具有保湿性和可生物降解等许多优良的理化和生物学特性,在环境、医药、食品和化妆品等领域具有广泛的应用前景,是不可降解的合成高分子材料(如塑料和水凝胶等)优良的替代品,因此,开发该产品有利于加快我国高分子产业和产品结构向绿色化和功能化的方向发展。利用重叠PCR方法将枯草芽孢杆菌(B.subtilis)P43启动子与透明颤菌血红蛋白基因vgb基因连接,构建至大肠杆菌—枯草芽孢杆菌穿梭质粒pMA5,得到重组质粒载体pMA5-P43-vgb,并将其转化B.subtilis NX-2,从而获得重组菌B.subtilis NX-2(vgb+).SDS-PAGE检测发现血红蛋白VHb在重组菌中表达的目的蛋白大小为16 kDa,另外,一氧化碳差光光谱结果验证B.subtilis NX-2(vgb+)表达了具有生理活性的血红蛋白.在7.5L发酵罐上对重组菌B.subtilis NX-2(vgb+)进行发酵实验,结果显示重组菌比出发菌的生物量提高了41.2%,γ-PGA的产量提高了7.5%.该研究为γ-PGA的进一步工业化生产奠定了基础.
  • 摘要:血栓性疾病严重威胁人类健康,微生物纤溶酶在血栓性疾病的预防和治疗方面具有巨大的应用潜力.本文总结了微生物纤溶酶的来源及其酶学特性,对比分析了微生物纤溶酶的发酵生产技术,探讨了微生物纤溶酶的产业化现状.在此基础上,总结出微生物纤溶酶产业化过程中存在的问题,并针对这些问题提出了未来发展方向,为推动微生物纤溶酶的产业化进程提供借鉴.
  • 摘要:分子佐剂具有增强免疫原性的功能,DNA疫苗的分子佐剂就是与DNA疫苗所编码的抗原基因共同作用于机体后,分子佐剂的基因表达产物通过一系列抗原递呈途径,调节DNA疫苗抗原基因所诱导的免疫应答的强弱和类型,提高免疫的效果的一类分子.本研究的目的是评价单个复制子DNA载体共表达IL-4和抗原增强疫苗的免疫原性,以筛选有效的疫苗载体用于DNA疫苗的研究;同时确定共表达是递送抗原和分子佐剂有效的方式,能够增强疫苗的免疫原性和有效性,可以使抗原和分子佐剂同时表达于一个环境,更好地诱导机体产生强的免疫应答。此外,共表达这种方式能够减少疫苗载体的数量,仅仅一个单一载体代替两个载体,更适合于DNA疫苗的研发与应用。
  • 摘要:Pfu DNA聚合酶从生活于海底火山口附近的超嗜热古生菌Pyrococcus furiosus 中分离得到.最初的聚合酶直接从菌体中直接分离,但由于古细菌需要厌氧培养,生长温度在100℃左右很难培养从而难以获得大量的酶.Pfu DNA聚合酶具有3′-5′外切酶活性,出错的机率仅为Taq DNA聚合酶的1/10,是保真性最好的DNA聚合酶之一,被广泛应用于分子生物学的各种研究中。IPTG是一种十分有效的乳糖操纵子的诱导剂,但其价格较为昂贵,为了减少IPTG用量,采用多次少量的添加策略进行诱导表达。
  • 摘要:系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一种表现有多系统损害的慢性系统性自身免疫病,其发病机制复杂.目前临床上的常规治疗手段主要是使用糖皮质激素和其它免疫抑制剂,不良反应严重.研究表明,SLE的发生与发展与α干扰素(interferon α,IFNα)密切相关,目前认为IFNα可能是治疗SLE的新靶标,通过中和抗体阻断IFNα的活性可能有益于SLE的控制.IFNα至少有12个亚型,各亚型之间具有较高的序列同源性,并且具有共同的受体,即I型干扰素受体(IFNAR)。研究表明,SLE至少与其中的9个亚型相关,因此认为,研制针对IFNa多个亚型中和抗体可能为SLE治疗提供新的选择。目前,该领域的研究以MedImmune公司研发的针对IFNa多个亚型的Sifalimumab单抗为代表,已经完成SLE治疗的二期临床试验。根据国外该领域相关临床项目的情况分析,该抗体极有希望进一步发展成为抗IFNa多亚型的治疗性抗体,为SLE等适应症的治疗开辟新的途径,带来新的希望。
  • 摘要:以玉米秸秆与白菜混合青贮体系为研究对象,对其乳酸菌进行分离纯化和鉴定.从青贮原料中共分离得到12个疑似乳酸菌菌株,经过表型特征与16S rRNA序列分析发现它们分属于3个属,4个种.3个属分别为乳杆菌属(Lactobacillus)、片球菌属(Pediococcus)和肠球菌属(Enterococcus),其中,乳杆菌属和片球菌属为优势属,共占91.7%.4个种分别为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)和肠道肠球菌(Enterococcus hirae)。除菌株CSCWL2-6为异型发酵乳酸菌外,其余菌株均为同型发酵乳酸菌。玉米秸秆与白菜混合青贮体系中的乳酸菌优势属为乳杆菌属和片球菌属,且以同型发酵乳酸菌为主。
  • 摘要:氨基酸脱氢酶有严格的手性选择性,野生型酶多为L-选择性,已被用于L-氨基酸的合成;已知的D-氨基酸脱氢酶多为膜蛋白,不能被用于工业生产,仅有内消旋-2,6-二氨基庚二酸脱氢酶(meso-2,6-D-diaminopimelic acid dehydrogenase)(DAPDH)(EC1.4.1.16)及变体可用来进行D-氨基酸的生物合成.在辅酶偏好性方面,已知的DAPDH酶及突变子的辅酶偏好性均为NADP(H).脱氢酶在实际应用中都更倾向于用NAD(H)做循环体系。将氨基酸脱氢酶直接还原氨化生产D-氨基酸的方法向实际应用靠近的过程中,需要有NAD(H)依赖型的DAPDH。文章对Y76位是否对辅酶偏好性有影响进行了摸索,此外,对和与辅酶NADP+上磷酸基团有直接作用的R35/R36位也进行了偏好性改造摸索,并和Y76的部分突变子进行了组合突变测试。为研究Y76是否会影响辅酶的偏好性,对其进行了一些定点突变尝试,发现突变子对两种辅酶的偏好性都发生了变化,还尝试构建了R35S/R36V突变子,并和Y76突变子中的一些进行了组合,结果发现R35/R36和76位点组合后对辅酶偏好性有协同影响作用。
  • 摘要:L-丝氨酸是一种能够参与细胞内众多重要活性物质代谢的非必需氨基酸.另外,作为一种重要的工业产物,L-丝氨酸在食品、精细化工及医药方面都有着广泛的应用.目前,L-丝氨酸的合成主要依赖于直接提取以及化学合成,虽然产率较高,但是这两种方法均会对环境造成一定的危害.随着代谢工程和合成生物学的发展,利用微生物反应器,通过系统调控微生物代谢途径使其大量积累某种代谢产物逐渐得到了广泛的应用.大肠杆菌作为一种模式生物,具有生长速度快、培养方法简单等优点,因而常常作为宿主菌用于微生物发酵.但是作为一种代谢中间产物,L-丝氨酸在野生型大肠杆菌中的积累量较低,因而亟需一种能够得到高产L-丝氨酸大肠杆菌的改造策略.为了提高大肠杆菌L-丝氨酸的产量,在野生型大肠杆菌DHSa的基础上,首先敲除了编码丝氨酸脱水酶的sdaA基因,阻断了L-丝氨酸向丙酮酸的转化,L-丝氨酸的产量也由1.35g/L,提高到1.52g/L。在基因敲除菌株的基础上,利用中等拷贝数质粒pBBR1MCS2过量表达了SerA,Sera,Serf三个酶,使得L-丝氨酸的摇瓶发酵产量达到了4.5g/L。将三个基因分别以不同拷贝数整合到基因组上,得到了一株整合了10个拷贝sera基因,4个拷贝serB基因以及4个拷贝serC基因的菌株,该菌株的L一丝氨酸产量可以达到5.1g/L。
  • 摘要:近年来越来越多的研究发现,基因的转录调控与人类疾病存在密切关系.转录因子结合位点(TFBS)是转录调控机理研究中的核心内容.第二代测序的ChIP-seq技术可以产生高分辨率的数据来精确定位TFBS,使得医学科研工作者可以更加深入细致地研究转录调控水平的疾病发病机理.然而,ChIP-seq数据晦涩难懂,且一维的序列格式解读和检索特别繁琐耗时,故前人发明了希尔伯特曲线的方法对结果进行二维的图像化呈现.本文在希尔伯特曲线的基础上,进一步开发了二维快速检索技术,对未来的医学诊断应用进行了预探索.使用R的HilbertVis软件包生成1000例模拟数据,转化为希尔伯特曲线并存储为图片。由于图片右侧有色柱且图片区有黑框,故需对图片进行切割,只保留希尔伯特曲线部分。将预处理后的图片分别采用感知哈希算法和颜色直方图进行特征值提取,并导入MongoDB数据库。感知哈希算法的速度显著快于颜色直方图方法,但是其计算结果的精细度远不如颜色直方图,不能对结果进行细分。颜色直方图刻画某一种颜色的像素数目占像素总数目的比例,是一种全局的统计关系,计算精度高,可以对相似性进行更精细的打分。
  • 摘要:表皮生长因子受体(EGFR)是受体酪氨酸激酶(RTKs)ErbB家族成员,对细胞的增殖、分化、迁移和损伤修复均具有重要作用.EGFR在多种实体肿瘤中高表达,并且其高表达和异常激活影响肿瘤恶性生长的细胞功能网络,包括存活、增殖、分化、转移以及新血管生成,对肿瘤的发生、发展、侵袭和转移等起到核心调节作用,是多种实体瘤治疗的重要靶标.目前全球共有3个靶向EGFR的抗体药物上市,十多个新品种在临床研究阶段.本研究以一株来自大容量全合成人抗体库技术的全人源抗EGFR抗体安美木单抗为研究对象,对比研究了安美木单抗与一个已上市的抗EGFR抗体昔妥西单抗在亲和力、表位、药效和药理学机制方面的异同。安美木单抗通过抑制EGFR信号通路和ADCC效应发挥抗肿瘤作用,尽管其体外活性较弱,但因在肿瘤局部高蓄积,体内抗肿瘤活性与西妥昔相当。并且其在免疫重建鼠模型中药效高于西妥昔,显示良好的临床药效学前景。
  • 摘要:为了有效改善发酵体系中的溶氧水平,提高小白链霉菌Streptomyces albulus PD-1发酵生产ε-聚赖氨酸(ε-PL)的能力,文中通过对氧载体的种类、最佳添加浓度以及添加时间进行筛选,最终确定在0 h添加0.5%(V/V)的正十二烷促进ε-PL生产效果最佳.在5L发酵罐0 h添加0.5%的正十二烷进行批次补料发酵,在ε-PL合成时期发酵液中的溶氧从对照的23.8%提高到32%,最终ε-PL的产量和菌体干重分别可以达到(30.8±0.46)g/L和(33.8±0.29)g/L,较之对照组分别提高了31.6%和20.7%.通过对菌体内ε-PL合成相关基因的转录水平及菌体内ATP水平的变化进行检测,发现添加氧载体后ε-PL合成从物质代谢和能量代谢两个层次都得到了增强.
  • 摘要:目的:用131I标记BDI-1,探讨其在荷瘤裸鼠体内的生物分布及药代动力学参数,为其用作为膀胱癌诊断和治疗的新型靶向药物提供基础数据.rn 方法:用Ch-T法进行BDI-1的131I标记,标记完成之后,采用Sephadex G-25分离纯化,用纸层析法测定标记产物的放化纯度,经尾静脉注入到荷人膀胱癌裸鼠体内.rn 结果:研究结果表明,静注后,131I-BDI-1主要分布于荷瘤裸鼠肝脏、脾脏、肾脏和肿瘤等组织。利用DAS 2.0软件进行分析,得出131I-BDI-1在荷瘤裸鼠体内的药代动力学过程符合权重为1/C的二室模型。rn 结论:本实验中生物分布数据表明泌尿系统排泄是131的主要排泄途径。肝脏较大的放射性摄取可能与131I-BDI-1分子量较大,经肝脏代谢有关。随时间延长,肿瘤与其他脏器(除血液外)相比,放射性曲线下降缓慢。15min-72h内,肿瘤摄取率在72h最高,为3.77。表明131I-BDI-1具有良好的肿瘤靶向性和较长的滞留时间,有利于肿瘤的靶向显像与靶向治疗。
  • 摘要:真菌毒素是某些真菌产生的有毒次级代谢产物,广泛存在于农产品以及农产品加工副产物中.真菌毒素不仅可以破坏人和动物体内的DAN、RNA以及各种酶的合成,还会造成农产品的营养损失.真菌毒素检测是真菌毒素的防治研究工作中的一个重要方面,本文对粮食中真菌毒素的常规检测方法和新型检测方法以及其优缺点进行综述.
  • 摘要:植酸是畜禽植物性饲料中磷存在的主要形式,是一种广谱性的抗营养因子,绝大多数单胃动物的消化道内缺乏分解植酸的酶,对植物性饲料中植酸的利用率很低.植酸酶是催化植酸及植酸盐水解成肌醇与磷酸(盐)的一类酶的总称,可提高动物对磷酸盐的利用率,减轻动物排泄物中磷的含量,提高营养成分的吸收利用.目前,植酸酶在实际应用中还存在许多问题,如表达量低、热稳定差、最适pH值不适应动物胃肠道环境.随着基因工程、分子生物学等生物学上游技术的发展,为这些问题的解决提供了有效途径.文章综述了植酸酶的应用方向及基因工程研究的最新进展,并讨论其进一步的研究发展方向.植酸酶基因主要有动物、植物、微生物三种来源。迄今为止,己经有近几十种植酸酶编码基因得到了分离及克隆。由于动物、植物源性的植酸酶存在各种缺点,因此现在用于研究的植酸酶基因主要来源于微生物。目前,植酸酶的生产都采用微生物发酵的方法,原产植酸酶的细菌大多数不适合大规模发酵培养,通过基因工程手段将植酸酶基因转入到适合大规模发酵的菌种中使其高效表达,可以实现植酸酶的大规模发酵。研究表明,以真菌作为生产菌株在产量,热稳定性,抗蛋白酶降解等方面都明显优于细菌。
  • 摘要:钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA 5是一种L-精氨酸工业生产菌株,为本研究的出发菌株,聚羟基丁酸酯(PHB)则是一种在C:N较高时在细胞内形成的聚合物,在极端条件下可作为细胞的碳源和能源,同时赋予细胞一定的抗逆性,帮助细胞度过难关.将PHB代谢途径引入细胞中,可以改善细胞的全局代谢途径,相关文献已有报道.在L-精氨酸和PHB的合成过程中,都需消耗辅酶NADPH,二者存在一定的辅酶竞争关系,另外,NAD激酶可以调节细胞内的辅酶水平,过表达NAD激酶可以作为一种增加细胞内部NADPH含量的有效手段,相关文献也已有报道.因此,通过引入PHB代谢途径到细胞中,并在细胞中过表达NAD 激酶来促进细胞增产L-精氨酸,成为本文的研究内容.将PHB的基因簇引入出发菌株C. crenatum SYPA 5,得到C. crenatumP1,并进行5 L发酵罐培养96 h。通过本研究,发现将PHB代谢途径引入细胞和过表达NAD激酶,增加胞内NADPH含量,是两种增产L一精氨酸的有效手段,使得细胞更加活跃分泌生产更多的L一精氨酸,具有一定的工业应用价值。
  • 摘要:在亚洲,禽流感H9N2于上世纪70年代自香港首次出现后,不断在香港活禽市场的鸭中被检测到.1994年,禽流感H9N2在中国大陆的广东省首次爆发,之后H9N2很快传播到大陆的其它地区和省份,并在中国的家禽,如鸡,鸭,鹌鹑等宿主中长期的流行传播,不断的造成散在的,小规模的禽流感疫情.在流行期间,H9N2也进化出了多个不同的谱系,如G1,Ck/Bei等.此外,H9N2也扩大了其宿主范围,1998年后,香港,山东以及其它省份的猪体内也分离到了H9N2.更为重要的是,1997年前后,H9N2在香港以及中国大陆出现了感染人的病例.禽流感H9N2还可以通过重配产生具有新的抗原性和遗传特性的新型流感病毒。1997年,造成香港疫情的禽流感H5N1病毒就包含有由禽流感H9N2提供的6个内部基因片段。H9N2病毒的持续传播,迁徙以及伴随的选择性清洗,不断的威胁着人类健康,因此需要更加广泛的监测,尤其要提高对野鸟宿主的关注。另一方面,提高国内禽类贸易活动的安全标准对于H9N2禽流感的控制也将起到重要作用。
  • 摘要:机体代谢与免疫之间存在紧密的功能关系,免疫系统的各种耗能行为可诱导代谢系统行为改变,从而有效地分配能量;同时受到免疫调控的代谢系统同样会对免疫系统产生反馈调节,甚至改变机体的免疫行为.补体系统是内生免疫的一个核心组成部分,有越来越多的证据显示,该系统的激活同样与特定的代谢过程存在着紧密关联.SAK-HV是前期构建的多靶点治疗AS的新型重组蛋白,它由低免疫原性的SAK突变体、抑制血小板聚集的RGD序列(Arg-Gly-Asp)和抑制凝血酶的水蛙素C末端12肤构成的重组融合蛋白,对于APOE-/-小鼠的动脉粥样硬化治疗效果显著。在实验验证了该融合蛋白具有预期的溶栓、抗凝和抗炎功能外,发现它能有效地降低血脂,并可显著地逆转高脂喂养的APOE小鼠的肝脏脂肪变性。SAK-HV重组蛋白的成分问的精巧互补可能是增强其降脂效果的主要因素。
  • 摘要:本文按照人脐带间充质干细胞(HU-MSC) "新药"产品申报及临床应用前研究要求,对HU-MSC的体外制备与鉴定、细胞资源库建设、临床级任间充质干细胞制剂制备与质量控制技术进行研究并建立了相应措施技术规范,对HU-MSC制剂进行了体内急慢性毒性实验及治疗系统性红斑狼疮(SLE)的疗效与机制评价,解决了HU-MSC制备、制剂化和临床应用前的关键技术问题,为细胞产品产业化及临床转化应用奠定了技术和理论基础。
  • 摘要:2013年8月作者用红外摄相仪显现了人体经络和得气(能量)的热相图,证实了经络是生命信息能量谐振通道,只要介质的谐振频率相同,都可让此频率的信息能量通过,不需要有形管道,这就是解剖学上找不到经络的原因.用测能量的仪器如热相仪等可测量经络中的能量及其变化情况并显示经络.生命信息能量的载体是远红外电磁波,显示远红外电电磁波的通行传导情况,就会找到生命信息能量的通道(经络).当能量通道被自由基阻塞(经络不通)可以用自由基显影技术显示能量通道被阻塞的影像显示经络.活着的人有生命信息,有经络现象;死亡的人没有生命信息,因此没有经络.
  • 摘要:病原菌的O多糖(OPS)、荚膜多糖(CPS)往往是其重要的保护性抗原,以细菌多糖为保护性抗原的疫苗一直是细菌疫苗研发的重点之一.目前,已有一批多糖疫苗上市多年,但多糖疫苗的免疫记忆性和免疫原性较弱,特别是在2岁以下儿童和老年人体内尤为突出.如今,这类疫苗的研发重点已转向多糖-蛋白结合疫苗,其中7价肺炎结合疫苗、4价脑膜炎结合疫苗、b型流感嗜血杆菌结合疫苗已经上市,且一批多糖-蛋白结合疫苗正处于不同的研发阶段.目前,G1ycoUaxyn AG公司开发出了基于空肠弯曲弧菌N一糖基化修饰系统的生物交联技术,制备了基于痢疾杆菌O多糖和金黄色葡萄球菌荚膜多糖的结合疫苗,并分别进入临床前研究和一期临床研究。
  • 摘要:作为新一代的他汀类药物,瑞舒伐他汀在药效和安全性方面均达到令人满意的效果,并已被批准用于血脂异常症、高胆固醇血症以及高甘油三酯血症的治疗中.光学纯的(R)-3-羟基戊二酸乙酯是合成瑞舒伐他汀手性侧链的重要前体.生物催化的高效、绿色等特点,使得(R)-3-羟基戊二酸乙酯的生物合成研究已经成为一个热点.目前(R)-3-羟基戊二酸乙酯的生物合成方法主要集中在利用脂肪酶或α-胰蛋白酶选择性水解3-羟基戊二酸二乙酯,然而昂贵的商业酶制剂限制了其大规模工业化生产.本文通过在大肠杆菌中共表达卤醇脱卤酶和腈水解酶,构建新的生物反应体系以实现(R)-3-羟基戊二酸乙酯的生物合成.利用共表达重组菌全细胞作为催化剂,一个三步、双酶、一锅法串联反应被建立.单一构型的底物(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯在卤醇脱卤酶的作用下发生闭环反应形成相应的环氧化物;接着环氧化物((S)-3,4-环氧丁酸乙酯)在卤醇脱卤酶和亲核试剂(CN-)的共同作用下发生开环反应形成中间产物(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯;中间产物在腈水解酶的水解作用下形成期望的产物(R)-3-羟基戊二酸乙酯.本工作首次实现了卤醇脱卤酶和腈水解酶在大肠杆菌中的共表达;并首次构建了卤醇脱卤酶和腈水解酶双酶一锅法串联反应体系,(s)-4-氯-3-羟基丁酸乙醋为底物合成瑞舒伐他汀关键中间体(R)-3-羟基戊二酸乙酯。
  • 摘要:蛋白质翻译后修饰是指在细胞生命活动过程中,特定氨基酸残基的侧链共价地连接新的化学基团或小蛋白质,以及主链共价键在水解酶切的作用下发生断裂.翻译后修饰的时空特异性极大地丰富了蛋白质组的多样性,并在调节蛋白质的稳定性与功能上起到了极为重要的作用,从而参与细胞的各项生化和生理过程.最近,围绕翻译后修饰,针对赖氨酸修饰的底物位点构建了数据资源CPLM,针对磷酸化相关的蛋白激酶和磷酸酶构建了数据资源EKPD,系统分析了小鼠睾丸中的磷酸化调控。蛋白质磷酸化是另外一种重要的翻译后修饰,参与了几乎所有的生物学过程。磷酸化由复杂的蛋白激酶和磷酸酶可逆地调节。通过计算预测重构了位点特异性激酶底物调控网络,并获得了精子发生相关蛋白质的子网络。对网络的分析结果发现包括MAPK,CDK2和CDC2在内的激酶拥有显著多的底物位点,这表明这些激酶应该有很高的活性并在精子发生过程中非常重要。
  • 摘要:分子拟态(molecular mimicry)为致病菌致病过程中的一个重要的致病机制.它可以帮助致病菌逃避宿主的免疫识别,促进致病菌的粘附和帮助其入侵宿主细胞.目前获得普遍认可的关于分子拟态进化机制有两种:一种为趋异进化,这种机制是致病菌通过水平转移从宿主体内获取一段遗传物质,随着不断的趋异进化最终增加致病菌的适应度.来源于趋异进化的分子拟态有两个特征,一是拟态蛋白会与真核的基因在序列上有明显的相似性,二是这种类型的拟态分子在细菌分布范围较小,一个拟态分子通常出现在一个或少数几个菌株.为了研究分子拟态的进化机制,从毒力因子数据库VFDB获取了功能标识为分子拟态的毒力因了。在研究相关毒力基因的分布时,发现其广泛分布于非致病菌中,尤其是neuB基因。据此认为neuB基因的进化起源不同于前文提及的趋异进化和趋同进化,有可能是一种新的进化机制。neuB广泛分布于真核界、细菌界以及古细菌中,尤其是在宿主不相关的分致病菌中。为了进一步研究进化起源,构建了neuB的系统发生树。系统发生树上,真核和细菌的分支各白聚集成簇,表明真核和细菌的neuB基因具有各白独立的进化起源,不可能通过水平转移从真核转移至细菌。研究结果发现neuB基因作为祖先基因通过垂直传递而获得的。
  • 摘要:玉米是重要的粮饲兼用作物,生物技术育种的Bt抗虫玉米是国际上最先实现商业化生产的作物,玉米在保障我国粮食安全方面举足轻重,是我国开展生物技术育种产业化的重点作物之一.我国玉米生物技术育种一个限制因素就是可以用于驱动外源基因表达的组织特异性启动子的数量少,尤其是可用的且具有自主知识产权的胚特异性启动子非常有限.一旦落入国外的"专利陷阱",将会使我国生物技术育种产品产业化功亏一篑.针对此问题,本研究基于基因芯片分析开展了全基因组水平、规模化鉴定玉米胚特异性高表达基因和启动子。该研究利用一套包括14种玉米不同组织及发育时期的芯片表达数据,鉴定出28个胚优先高表达的基因;并对这些基因的表达水平以及表达的组织特异性进一步用公共数据库的表达数据以及实时定量PCR进行了验证。同时,该研究首次报导了玉米,高粱和大豆植物基因组中大量存在双向基因对-一种特殊的基因结构形式,并首次用实验验证了驱动这些基因对表达的启动子具有双向启动子功能。在玉米全基因组中搜寻发现共有1696个双向转录本对。
  • 摘要:作为研究基因功能的重要手段,基因的定点修饰、编辑技术一直为现代代分子生物学的研究热点.近十年来基于靶向核酸酶(targeted nucleases)的基因组编辑技术取得了里程碑式的突破与进展.CRISPR/CAS9则属于一种在RNA序列引导下识别靶基因核酸酶系统,且只需改变很短的RNA序列就可以实现不同位点的特异性识别及靶基因降解或编辑修饰,并被证实几乎可以在所有动物和植物细胞中诱导位点特异性的遗传改变。随着对CRISPR/CAS9对靶基因识别及剪切的机理及CAS9结构的深入了解,已有多种有效途径对体外培养细胞进行特异的基因敲除及编辑。
  • 摘要:脆性X综合征(fragile X syndrome,FXS)是一种常见的遗传性智力低下疾病.其致病基因——脆性X智力障碍1基因(fragile X mental retardation 1 gene,FMR1)定位克隆于Xq27.3,长38Kb,由17个外显子和16个内含子组成,编码一个选择性RNA结合蛋白,称为脆性X智力障碍蛋白( fragile X mental retardation protein,FMRP).己有的研究表明,FMR1基因存在复杂的可变剪接表达,且可变剪接参与了FMR1基因功能和活性的调节。对进一步研究可变剪接对FMRP功能的影响打下基础,并对FXS的发病机制的研究提供新的方向。
  • 摘要:利用生产上广泛应用的两系杂交水稻"两优培九"为研究材料,结合高通量测序技术挖掘出控制水稻产量的遗传位点,为超级杂交稻产量相关位点的解析提供了宝贵的材料和有效的途径.中国的杂交稻为世界粮食生产作出了巨大贡献,作为超级杂交稻标杆组合的两优培九以其丰产特性,在生产上大面积种植.研究人员通过长期努力,采用单粒传方法构建出132个超级杂交稻两优培九的核心重组自交系和1709个用于基因克隆的大规模重组自交系,并进一步对核心重组自交系进行了基因组重测序,并最终利用171,847个单核苷酸多态(SNP)标记成功构建了一张超高分辨率的遗传连锁图谱.
  • 摘要:手性醇,包括仲醇和伯醇,是一种常见的光学活性化学品,其作为合成中间体或手性原料,在医药、化妆品、香料以及食品工业中起着非常重要的作用.由于对很多手性醇具有良好的对映体选择性,脂肪酶被越来越广泛的应用于制备光学纯的手性单一构型对应体.因此,化学修饰用来改善脂肪酶对底物的对映体选择性成为近年来的研究热点.实验结果表明,在脂肪酶活化剂正己烷存在的条件下,被酪氨酸专一修饰剂N-乙酞咪A+修饰后,洋葱假单胞菌脂肪酶对乙酸仲丁酯、丁酸仲丁酯、己酸仲丁酯、乙酸仲己酯、乙酸仲辛酯的(乃型水解对映体选择性分别提高了3.2,3.4,3.1,2.4以及2.8倍。实验过程中不加入正己烷,被修饰后的洋葱假单胞菌脂肪酶对以上四种酯的对映体选择性没有得到改善。基质辅助激光解析飞行时问质谱分析结果表明4,29,45以及95位酪氨酸为修饰位点。
  • 摘要:发酵工程是利用生物质原料,在生物反应器(发酵罐)中通过微生物细胞转化,生产各种化学品和能源产品的工程技术.以获得高产量、高底物转化率和高生产强度相对统一为目标的发酵过程优化与控制技术,是发酵工程的核心.其研究不仅关系到能否发挥菌种的最大生产性能,而且会影响下游处理的难易程度,因而在整个生物产品的研发过程中具有特别重要的作用.本论文首先概述了传统发酵过程优化与控制的策略,包括基于微生物反应原理的培养环境优化技术、基于微生物代谢特性的分阶段培养技术、基于反应动力学的流加发酵优化技术和基于代谢通量分析的过程优化技术. 发酵过程优化与控制技术在整个生物产品的研发过程中具有承上启下的作用,在国内外发酵工程学者和工程师的重视和努力下,取得了很大的技术突破和迅速发展。但传统的发酵过程优化与控制技术是以基于参数离线检测的培养条件优化和过程建模为主导,具有一定的时效滞后性。目前随着组学技术(如基因组学、代谢组学和蛋白质组学)以及实时检测技术和工具的快速发展,基于微生物生理特性实时分析的发酵过程优化与控制技术将会是未来的一个重要发展方向,同时组学和实时在线测量代谢通量的整合将会使发酵过程优化和控制的目标更加微观化(如以某一个或几个胞内代谢途径通量为优化目标,而不仅仅是宏观性的代谢产物的产量),控制效率更高,优化效果更好。
  • 摘要:随着现代化工业进程的发展,煤和石油作为的主要能源被使用,而燃烧终产物二氧化碳的排放量越来越大,由此导致的温室效应已经成为了全球最为关注的环境问题.利用化学方法固定工业排放二氧化碳,往往需要较高的反应温度,消耗大量的热能.因而利用生物方法在温和的条件下固定二氧化碳已逐渐成为人们研究的热点.芳香羧酸脱酸酶是可以降解芳香酸生成芳香烃(主要是苯酚类化合物)和二氧化碳的一类酶,反应可以在常温下进行,且不需要加入ATP及辅因子.同时其可以催化苯酚类化合物与二氧化碳反应生成有应用价值的芳香羧酸.通过研究不同来源脱羧酶对水杨酸衍生物的催化活性,拓展了对这些芳香羧酸脱酸酶的底物特异性的认识,为进一步研究脱羧反应的机理,以及利用生物法固定二氧化碳得到有价值的芳香羧酸打下了基础。
  • 摘要:(S)-2-氨基丁酸是抑制人体神经信息传递的非天然氨基酸,具有加强葡萄糖磷酸酯酶的活性,促进脑细胞代谢的作用.同时,(S)-2-氨基丁酸也是一种重要的化工原料和医药中间体,已广泛应用于治疗局限性及继发性全身性癫痫的手性药物左乙拉西坦和抗结核药物盐酸乙胺丁醇药物的合成.以(S)-2-氨基丁酸为原料合成左乙拉西坦的方法合成收率高,是目前国内外的主流生产路线.而(S)-2-氨基丁酸的制备主要来源于化学合成和生物催化,其中生物催化法具有反应条件温和、生产成本低、污染少等优点,具有很大的发展前景.采用以立体选择性腈水解酶为生物催化剂,以外消旋2-氨基丁腈为底物,不对称合成(S)-2-氨基丁酸的技术路线。将40株产睛水解酶的重组大肠杆菌分别进行LB液体培养和IPTG诱导腈水解酶的表达,并离心收集菌体细胞。通过对Nitb116402腈水解酶的“热点”氨基酸进行定点饱和突变改造,构建饱和突变库,通过薄层层析(TCL)检测获得2株酶活提高较为显著的突变株,分别为240-91和251-85。HPLC检测结果表明,突变酶的酶活提高至原始酶的2倍左右。
  • 摘要:生物乙醇是目前为止研究最早、技术最为成熟的生物质能源产品,一直以来都被公认为最有可能替代化石能源的生物质能源之一.菊芋具有适应性强、耐贫瘠、耐寒、耐旱、种植简易及产量高等特点,是近年来非粮作物燃料乙醇研究的热点.集成生物加工(Consolidated bioprocessing,CBP)系统集水解酶生产、底物水解和发酵为一体,是目前利用许多非粮作物生产燃料乙醇经济上最具有竞争能力的技术路线.本文提出的两阶段的通气策略解决了发酵时间与乙醇得率的矛盾,此种策略能够实现残糖的降低与发酵时间的缩短,为菊芋乙醇的工业化奠定基础。
  • 摘要:乙醇作为石油化石燃料的替代能源已日益受到世界各国的高度重视.根据Global Insight调查报告显示,2006年世界乙醇产量135亿加仑,2012年为277亿加仑,到2030年世界乙醇需求将达到800亿加仑.世界燃料乙醇需求的不断提高,需要不断提高乙醇的产量.高性能乙醇生产菌种是提升乙醇生产能力的核心.在传统菌种改造策略的基础上,结合先进的基因组水平分子改造技术(基因组工程技术),开发高性能生产菌种仍然是提升乙醇发酵生产能力的重要途径,同时降低乙醇生产成本也是燃料能源乙醇工业的关键问题.然而世界上许多热带、亚热带国家或地区,由于地域环境温度较高,普通酵母难以进行正常乙醇发酵,必须配以制冷设备才能维持正常生产。酿酒酵母高温发酵生产乙醇可以减少冷却水使用量,同时降低染菌几率。为改善菌株,从工业酿酒酵母S.c Y出发,利用适应进化(adaptive evolution)的方法对菌株进行高温环境的适应性驯化。菌株S.cY01与S.cY分别敲除5个基因之后,在40度条件下进行生长评价,5基因敲除对菌株S.cY生长影响高于S.cY01。以玉米芯为原料,利用进化菌株S.c Y01进行高温同步糖化发酵(40度),在300L规模条件下,最高乙醇产量达到7.2%(V/V),原料转化率达到75%。
  • 摘要:黑蒜是兴起于二十一世纪初的一种以药食植物大蒜为原料经生物发酵而加工成的新型健康食材.与生大蒜相比,黑蒜在口感、营养成分方面都发生了巨大的改变;在药食保健功能方面比生大蒜具有大幅度提高.本文就黑蒜的强抗氧化性、延缓衰老、预防癌症、强力杀菌、降低血糖、降血脂、预防心脑疾病、保肝强精等药食功效的研究进展进行论述.通过生物发酵技术将大蒜从传统的摄入量受限的调味品成功转化为可随身携带的休闲型保健食品,使大蒜的原有药食功能得以大幅提升,对人类健康具有重要贡献.
  • 摘要:采用博弈论建模研究反生物恐怖策略是近年来关于恐怖活动研究的热点之一.本文介绍了博弈论在生物恐怖防御领域的三个应用方面,包括防御策略选择,防御经费投入和防御联盟的形成,并探讨了博弈模型的后续发展方向.生物恐怖作为当今世界一大公害,对国际社会的和平、安全与秩序构成了巨大威肋。博弈论理论的不断发展和完善为反生物恐怖研究提供了个崭新的视角,它从冲突与合作的角度出发,通过分析恐怖袭击过程中各方的相互依赖又相互竞争的关系,寻找利益最大化的关键点,为预防和打击恐怖活动犯罪提供决策参考和依据。
  • 摘要:布鲁氏菌是一类革兰氏阴性的胞内寄生菌,主要感染牛、羊、猪、狗等哺乳动物,也可以通过接触感染的动物或者吃被感染的食物以及实验室接触等方式传播给人类.由布鲁氏菌感染引起的疾病被称为布鲁氏菌病,是一种分布广泛的人畜共患病,可以造成较大的经济损失和严重的公共安全问题.据WHO统计,全世界每年都有超过50万的布鲁氏菌病患者.中国,在过去的十几年里,布鲁氏菌病患者的数目呈现快速增长,而且在每个省内均发现不同程度的流行.本研究首先对现有104M疫苗株进行基因组测序,获得了完整的全基因组序列,然后基于已有的布鲁氏菌株的基因组序列进行比较基因组学分析。结果发现疫苗株104M和毒株A13334的基因组最为相似。进一步分析发现:与A13334的基因组相比,104M缺失了一些基因,这些基因直接或问接的与菌株毒力相关;另外,一系列在毒力相关基因上的突变位点也被识别出来,其中一些位点突变与菌株的毒力改变有关。总之,该研究提供了一组与毒力相关的候选基因,为进一步阐明布鲁氏菌104M的减毒机制提供了研究基础。
  • 摘要:酒精性肝病( Alcoholic liver disease,ALD ) 是因长期、大量饮用各种含酒精的饮料所致的肝脏损害性病变,主要表现为酒精性脂肪肝、酒精性肝炎和酒精性肝纤维化等形式.活性氧和自由基在酒精性肝损伤的发病过程中发挥了重要的作用,抗氧化剂能通过一系列化学反应减少活性氧的形成或者增强机体的抗氧化防御水平,从而保护机体免受氧化应激损伤。香菇多糖等已经应用于临床,随着酒精性肝病的发病率不断上升,迫切需要更多对酒精性肝病有预防及治疗效果的药物,多糖研究的热点包括了玉郎伞多糖,大蒜多糖,香菇多糖,贻贝多糖,桦褐孔菌多糖等。多糖对小鼠酒精性肝损伤保护作用将为酒精性肝病的治疗及预防药物来源提供一种可能。
  • 摘要:当前棉花纤维品质的改良是我国棉花育种的首要目标之一.由于受育种周期长、外源种质利用困难、棉花纤维品质与产量性状之间呈负相关等因素的限制,用常规育种的方法较难培育出产量和品质同步改良的棉花新品种.利用基因工程的方法可以实现优良基因的定向转移,达到棉花纤维产量与品质同步改良的目标.为了实现这一目标,研究者们已分离了一些在棉纤维细胞特异或优势表达的基因及启动子,为棉花纤维品质改良基因工程奠定了良好的基础,但缺乏真正具有应用前景的高效纤维特异表达的基因和调控元件.RNA-Seq技术是一种新的高效、快捷的研究转录组的方法,该技术能够在单核普酸水平对任意物种的整体转录活动进行检测,在分析转录本的结构和基因表达水平的同时,还能发现未知转录本和稀有转录本,是深入研究转录组和寻找特异表达基因的很好工具。本研究以陆地棉苏棉21为材料,对棉花纤维和根叶之间的差异明显和可信度较高的基因,进行GO功能和Pathway显著性富集分析,发现差异表达基因主要富集在质膜和氧化还原反应代谢通路,推测质膜和氧化还原反应基因可能在纤维伸长发育过程中起重要作用。
  • 摘要:除草剂大量使用在消除杂草危害、提高劳动生产率的同时,也危害生态环境和人类健康,并对作物产生了严重的药害.大量的生态学研究结果表明:微生物降解代谢是土壤和水体环境中除草剂消失的主要因素.从生产除草剂的工厂污泥及除草剂污染土壤中富集分离到能降解磺酞脉类除草剂、氯代乙酞胺类除草剂、酞胺类除草剂、麦草畏、杀草丹和氟乐灵等除草剂的细菌菌株20余株。二苯醚类化合物是很多除草剂和菊醋类农药的合成中间体,也是这些农药的降解代谢产物。从细菌Hansschlegelia zhihuaiae S113基因组克隆到一个醋酶基因sulE。SuIE降解谱广,可将噻吩磺隆、甲磺隆、等磺酰脲除草剂的酯键水解,生成相应的无除草活性酸产物。SuLE分子量较小,具有较宽的pH和温度耐受范围,且其催化活性不需要任何辅因子。将SuLE导入到酵母菌S.cerevisiae BY4741可显著提高该菌对噻吩磺隆和甲磺隆的耐受性,表明SuLE在抗除草剂转基因工程具有应用潜力。
  • 摘要:微生物油脂又称单细胞油脂,其脂肪酸组成与动植物油脂相近.微生物油脂技术具有生产周期短、可连续生产、生产潜力大等优势,且不与人争粮,不与粮争地.将木质纤维素资源转化为微生物油脂,对保障生物柴油产业和油脂化工可持续发展具有战略意义.但是,当前微生物油脂尚未实现大规模生产,主要原因是技术不够成熟、生产成本高,特别是原料成本.为降低成本,人们采取了以下主要策略:1、应用廉价原料,特别是工业有机废物和农林废弃物,如淀粉工业废水、废糖蜜、作物秸秆、甘蔗渣等;2、进行过程集成和优化,特别是将原料处理、产物回收等过程与发酵过程集成,简化工艺流程,提高生产强度;3、联产高值产品,如多不饱和脂肪酸、类葫萝卜素等。微生物油脂是典型胞内产物,在生产过程中伴生大量菌渣,其中含有多糖、蛋白质、微量元素以及其他营养物质。为探索进一步降低微生物油脂成本的途径,以圆红冬包酵母产油培养为模式过程,研究菌渣高效回收、循环利用以及废水回用的关键技术。发现菌渣水解液可作为产油酵母碳源,也可作为营养物质替代酵母粉和蛋白陈等氮源。建立了资源回用半闭合和闭合的新工艺,对推动微生物油脂产业化具有重要参考意义。
  • 摘要:玉米的组织培养受基因型和受体范围的限制比较大,因此成功应用于其它植物的常规转基因方法如农杆菌法、基因枪法等在玉米的转化受到很大的限制.国内科学家周光宇认为植物受精卵或其前后的生殖细胞处于未形成细胞壁的类似"原生质体"状态,正进行活跃的DNA复制、分离和重组,这时很容易将外源DNA片段整合到受体基因组中,以达到遗传转化的目的.另一方面,细胞穿膜肽Tat2具有保护DNA不被降解和携带DNA穿膜进入细胞核的特性,本项目正是基于以上事实,首次将细胞穿膜肽Tat2应用于玉米花粉管通道转化法研究,将线性DNA结合细胞穿膜肽Tat2通过花粉管通道整合进玉米基因组中,用于提高花粉管通道法转化效率。经三年试验统计,转化效率稳定在1%-2%之间,3:1分离比的转基因株系占总数的16%。
  • 摘要:本文通过三种半夏种属来源及其亲缘关系的分析,鉴定了荆州地区的半夏人工种植的主要品种,对其当地药农种植符合《中国药典》规范的半夏药材具有指导意义,为后续优质半夏资源的保护与选育提供了参考依据.通过采集自湖北荆州地区的三种不同表现型的半夏属植物的叶片组织中提取基因组,纯化后经直接PCR扩增得到其对应的ITS序列并测序.运用NCBI GenBank数据库进行序列比对与进化树分析.根据比对与分析结果,结合植物形态学特征显示,HBB-01为Pinellia ternata,为《中国药典》中规定的半夏类药材品种;HBD-02为P.tripartita,为药用半夏的混淆品;HBF-03的结果较为复杂,其不仅与芋属(Colocasia)天南星属(Arisaema)、半夏属(Pinellia)等植物ITS序列的同源性高达80%以上,而且在进化关系上,它们也有一定关联.所以推测HBF-03可能为天南星科不同属但亲缘关系较近的植物产生的变种,具体种属来源有待进一步论证.
  • 摘要:铁皮石斛为我国传统的名贵中药材,被誉为"中华九大仙草之首".近年来,随着铁皮石斛野生资源的日益匮乏,市场缺口日益增大,组织培养技术已成功应用到铁皮石斛上.铁皮石斛组培体具有生长周期短,生产成本低,产品质量均一等优势,其是否可以作为铁皮石斛替代性药源,从中提取有效成分,引起了人们的广泛关注,关键取决于铁皮石斛的有效成分含量和药理作用.本文综述了近年来国内外关于铁皮石斛组培体主要有效成分—多糖、生物碱和氨基酸的含量、组成和不同培养条件对有效成分含量的影响,以及铁皮石斛组培体的药理作用的研究进展,为铁皮石斛组培体的合理开发应用和铁皮石斛组织培养技术的进一步发展提供理论依据,对于保护铁皮石斛野生资源,实现其可持续利用具有重要意义.
  • 摘要:X-连锁肾上腺-脑白质营养不良(X-linked adrenoleukodystrophy,X-ALD)是一种遗传异质性疾病,其疾病基因——ABCD1基因定位于染色体Xq28,编码1个含745个氨基酸残基的蛋白质,称为ABCD1蛋白,又称ALD蛋白(ALD protein,ALDP).其生化特点是极长链饱和脂肪酸(very long chain fatty acids,VLCFAs),特别是二十六烷酸(C26:0)及二十四烷酸(C24:0)在不同组织和体液中的积累.病变主要侵犯脑白质、肾上腺等组织,临床上主要表现为听力、视力、智力及运动障碍等中枢神经系统症状以及肾上腺皮质功能减退的症状。
  • 摘要:成纤维细胞生长因子10(Fibroblast Growth Factor10,FGF10)又称为角质细胞生长因子-2(Keratinocytegrowth factor-2,KGF-2),为成纤维细胞生长因子家族(FGFs)成员,属于FGF7亚家族.FGF10在生物生长和发育中有广泛的生物学作用,参与上皮细胞进行有丝分裂,能够刺激上皮细胞的增殖、迁移和分化.对白色脂肪组织,心脏,肝,脑,肾,胸腺,盲肠,眼腺,内耳,舌头,眼,气管,胃,唾液腺,前列腺,乳腺,和胡须的发育起一定作用.油料植物种子中含有大量的油体,而且在油体上有一种被称为油体蛋白(oleosin)的特异性蛋白质。油体蛋白嵌入在油体的表面,并且可以在种子中高表达。通过基因工程技术使外源基因和植物中的油体蛋白基因形成融合基因,使其在植物种子油体中特异性表达。由于油体比水轻,通过简单离心,可以降低靶蛋白的提取和纯化成本,油体可保护靶蛋白,增加其半衰期。
  • 摘要:为探讨MLPA在早期自然流产胚胎绒毛染色体异常检测中的应用价值,收集2012年12月至2013年12月在南京军区福州总医院妇产科确诊为早期自然流产的病例共26例,清宫后获取其胚胎绒毛组织,应用MLPA亚端粒检测试剂盒进行MLPA检测,并与G显带核型分析进行比较.26例早期自然流产绒毛样本均在15±3天内进行了绒毛细胞培养,G显带核型分析,成功24例(成功率92.3%),1例由于绒毛组织污染而培养失败(3.8%),1例由于分裂相少、染色体形态差而核型分析失败(3.8%).
  • 摘要:甾体化合物是广泛存在于动植物中的一大类化合物,许多甾体化合物都具有很强的生理活性,临床上广泛应用于抗炎、抗毒、抗过敏、抗休克等.甾体药物的发现及成功合成是近半个世纪以来医药工业取得的最引人注目的两大进展之一,甾体药物也成为仅次于抗生素的第二大类药物.羟基化的甾体是甾体药物合成中重要的中间体,不同位点的甾体羟基化可由化学法实现,但由于生物法具有专一性高、副产物少、污染小等优点,越来越受到重视.19-OH-甾体是合成19-去甲甾体的重要中间体,而后者可用于合成高效当体激素药物,比如合成炔诺酮、米非司酮、诺龙苯丙酸醋、替勃龙等药物的关键中间体。而目前为止可以催化体化合物进行19位羟化的酶或微生物却鲜见报道,工业上仅能用化学法进行合成。
  • 摘要:本研究基于反向代谢工程的原理,以两株合成不同水平的β-胡萝卜素重组酿酒酵母T73-01(最高含量4.0 mg/g DCW)和T73-08(最高含量1.1 mg/g DCW)以及原始菌株T73为研究对象,利用基因芯片技术研究了β-胡萝卜素合成水平差异对酿酒酵母全基因组转录的影响,以期初步揭示影响β-胡萝卜素合成水平的关键因素,获得更加有效的代谢调控策略.外源类胡萝卜素合成抑制了细胞生长,抑制作用随着色素水平的增加逐渐增强;不同β-胡萝卜素合成水平对细胞全基因组转录的影响是不同的。研究结果表明:缓解/降低外源类胡萝卜素物质对细胞膜的胁迫作用以及尽快将合成的类胡萝卜素转运至胞外是进一步提高外源p-胡萝卜素合成水平的有效手段。
  • 摘要:碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor,bFGF)是成纤维细胞生长因子家族中的23个成员之一,具有较好创伤愈合和神经保护作用.本研究用基因工程的方法将穿膜肽TAT基因与重组人成纤维细胞因子(rhbFGF)基因进行融合,构建pET3c-TAT-rhbFGF重组质粒,将其转入大肠杆菌BL21(DE3)pLsS菌株.IPTG诱导表达后,融合蛋白经SDS-PAGE及Western blot鉴定为高效可溶性表达.经过离子交换和亲和层析两步纯化后,获得了纯度高于95%的融合蛋白,NIH 3T3细胞增殖实验表明,TAT-rhbFGF融合蛋白具有较好的生物学活性。
  • 摘要:生物柴油是一种具有较好发展前景的生物能源,微藻作为生物柴油的来源之一,由于其具有生长速度快,油脂含量高,不占用耕地等优势,被认为是当前替代化石燃料的最具潜力的生物柴油原料之一.因此,寻求一种低成本高回收率的微藻采收方法,对于降低微藻的生产成本,提高微藻能源的竞争力具有重要意义。在传统的阳离子型聚丙烯酞胺(CPAM)絮凝剂的基础上,利用磁性Fe304纳米颗粒,合成了一种新型的磁性絮凝剂,并将其应用于微藻的采收过程中。在该磁性絮凝剂的基础上,研制了一台适用于微藻磁性采收的磁分离装置,并成功用于户外袋式反应器中培养的布朗葡萄藻的原位分离。在微藻培养结束后,将磁性絮凝剂直接加入到微藻培养液中,通过通气进行混合,然后直接泵入磁分离器中,微藻一磁性颗粒聚集体会被由永磁铁构成的磁鼓吸附到其表面,通过磁鼓的转动,吸附在磁鼓表面的磁性聚集体会被安置于磁鼓表面的刮板不断刮除,而分离后的培养液则从底部的出料口排出。
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