枯草芽孢杆菌HD11发酵生产γ-聚谷氨酸的研究

摘要

γ-聚谷氨酸(γ-PGA)主要是一些芽孢杆菌产生的一种胞外高分子多氨基酸聚合物，是由L-谷氨酸和D-谷氨酸通过α-氨基和γ-羧基形成的酰胺键缩合形式的一种多肽。γ-聚谷氨酸是一种具有极强水溶性、生物相容性、可完全降解性的环境友好型新材料，在医药、农业、食品等领域，具有极大的开发价值和应用前景。本文从γ-PGA产生菌的鉴定、诱变育种、液体发酵工艺、固体发酵条件等方面进行了研究。主要研究结果如下：
　　 (1)试验室保藏γ-聚谷氨酸产生菌Bacillussp.HD11，经过进一步电镜结果及16SrRNA基因序列分析，确定为枯草芽孢杆菌，命名为BacillussubtilisHD11。
　　 (2)以BacillussubtilisHD11为出发菌株，采用硫酸二乙酯、亚硝基胍对菌株进行单因素及复合因素诱变育种，快速、高效地筛选出γ-PGA高产菌株F12，其γ-PGA产率达到20.27g/L，比原保藏菌种提高了39.2％，且传代稳定。
　　 (3)对诱变选育的菌株F12的液体发酵工艺进行了研究。试验结果表明：葡萄糖、谷氨酸钠的初始浓度及补料方式对菌株F12发酵生产γ-PGA影响显著。菌株F12发酵生产γ-PGA最适初始葡萄糖浓度为15g/L，在发酵12h、24h时分两次补加同浓度葡萄糖，使总葡萄糖浓度为60g/L，γ-PGA产率达到26.32g/L；最适初始谷氨酸钠浓度为30g/L，在发酵24h时补加谷氨酸钠，使总谷氨酸钠浓度为40g/L，γPGA产率达到28.4g/L。同时补加葡萄糖和谷氨酸钠的试验结果表明：在发酵12h、24h时分两次补加葡萄糖，24h时一次补加谷氨酸钠发酵效果最好，γ-PGA产率达到30.57g/L。甘油对菌株F12发酵生产γ-PGA有明显的影响，试验表明在发酵16h时添加30g/L的甘油，γ-PGA产率提高到31.02g/L。在同时补加葡萄糖、谷氨酸钠发酵过程中，在发酵16h时添加30g/L甘油，γ-PGA产率达到了34.25g/L。
　　 (4)将三羧酸循环中间体(苹果酸、延胡索酸)，氨基酸(L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬氨酸、L-缬氨酸)及草酸添加到发酵培养基中初步了解对γ-聚谷氨酸合成的影响。通过多质量浓度梯度试验发现，L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-缬氨酸最适添加浓度分别为：4g/L、3g/L、3g/L；γ-PGA最高产率分别达到：43.68g/L、43.88g/L、34.68g/L。
　　 (5)以F12为试验菌株，对其固态发酵生产γ-聚谷氨酸的条件进行了初步研究。其中包括对培养基基质、载体、料水比、接种量、发酵时间、外加碳源、外加氮源的研究。结果表明基质选择大豆粉、载体为麦麸发酵效果最佳。最佳培养条件为：料水比为1:1，接种量8％，发酵时间36h。添加葡萄糖20g/kg，谷氨酸钠20g/kg，尿素20g/kg，对γ-PGA合成均具有显著的促进作用，γ-PGA产率分别达到90g/kg，101g/kg，98g/kg。