枯草芽孢杆菌ZJU-7发酵生产γ-聚谷氨酸的研究

摘要

γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是由微生物合成的一种细胞外高分子多氨基酸聚合物，它是由谷氨酸单体以γ-羧基和α-氨基相缩合而成的，是一种对人体和环境无毒害的生物相容性新型天然高分子。 本文以本实验室筛选得到的γ-PGA高产菌株BacillussubtilisZJU-7为基础，从中筛选出相对高产的菌株；并在摇床上进行了氮源替代研究，找到了一种新的廉价氮源工业级酵母膏水解液替代进口胰蛋白胨作为ZJU-7发酵的新氮源，大大降低了γ-PGA的生产成本。 在15L搅拌式发酵罐上对ZJU-7进行了分批发酵研究，主要考察了不同初始葡萄糖浓度对发酵结果的影响以及用价格更为低廉的工业级麸酸代替味精作为前体时的发酵情况。结果显示，较佳的罐上初始葡萄糖浓度为100g/L；而用麸酸代替味精作为前体时，发酵48小时后粘度可达4200mPa·s，高于味精的3200mPa·s。 在分批发酵的基础上，在10L搅拌罐上进行流加发酵试验，主要研究了流加葡萄糖、前体及培养液时对发酵结果的影响，并在100L发酵罐上进行发酵放大。结果表明：恒速流加葡萄糖使其浓度在整个发酵过程中维持在10g/L，30g/L，50g/L左右时，发酵过程中维持越高的糖浓度最终发酵液的粘度越大，粘度的增长速度也越快，聚谷氨酸产量也越高；当糖浓度维持50g/L时发酵液的最高粘度可达6000mPa·s，最高产量为59g/L。葡萄糖前期流加后期不流加时，发酵液的最高粘度也可达6000mPa·s，最终发酵液中的残糖浓度几乎降为零，很好地达到了降低残糖的效果。在流加麸酸的发酵过程中，由于发酵前期培养基中不加麸酸，导致菌体前期生长过快而过早进入死亡期，γ-PGA产量并不高。当发酵后期流加培养液时，菌体可进行较好的二次生长，最高粘度可达7000mPa·s。在100L发酵罐上进行发酵放大试验时，发酵情况与10L罐上十分相似，最高产量为54g/L。 本文还对15L搅拌式发酵罐进行机械加工，将其改造成为新型反应器CFBB并运用于ZJU-7的发酵研究。 发酵结果说明，菌体在CFBB中生长的过程中能有效的固定到纤维基质上，罐中固定化细胞干重与游离细胞干重的比值约为0.625； CFBB中发酵液最高粘度为4000mPa·s，略低于搅拌罐，而产γ-PGA的速度要明显慢于搅拌罐，达到最高粘度所需的时间约为150个小时，是搅拌罐上的两倍。

目录

文摘

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致谢

第一章绪论

1.1γ-聚谷氨酸(poly-γ-glutamic，γ-PGA)的分子结构

1.2γ-PGA的生物合成机理

1.3 γ-PGA的性质及应用

1.3.1γ-PGA的性质

1.3.2 γ-PGA在医药领域的应用

1.3.3 γ-PGA在农业领域的应用

1.3.4γ-PGA的其他用途

1.4 γ-PGA的合成方法

1.4.1提取法制备γ-PGA

1.4.2化学合成法

1.4.3酶转化法

1.4.4微生物发酵法

1.5微生物法生产γ-PGA的主要菌株

1.6 γ-PGA工业化生产

1.7 γ-PGA的分离纯化

1.8γ-PGA发酵生产的主要影响因素

1.8.1 碳源对γ-PGA发酵生产的影响

1.8.2氮源对γ-PGA发酵生产的影响

1.8.3谷氨酸对γ-PGA发酵生产的影响

1.8.4金属离子对γ-PGA发酵生产的影响

1.8.5供氧和pH对γ-PGA发酵生产的影响

1.9CFBB及其在高粘度发酵上的应用

1.10本课题主要研究内容

第二章实验材料与方法

2.1菌种

2.2仪器与试剂

2.2.1主要仪器

2.2.2主要试剂及标准品

2.3培养基和培养条件

2.3.1主要培养基

2.3.2培养方法

2.4分析测定方法

2.4.1pH测定

2.4.2含菌量测定

2.4.3固定化细胞洗脱方法

2.4.4细胞干重测定方法

2.4.5葡萄糖和谷氨酸含量的测定方法

2.4.6发酵液粘度测定

2.4.7发酵液中γ-PGA含量的测定

第三章ZJU-7发酵培养基的氮源替代研究

3.1前言

3.2材料与方法

3.2.1 菌株

3.2.2塔养基

3.2.3培养方法

3.2.4测定方法

3.3实验结果与讨论

3.3.1 Bacillus subtilis ZJU-7发酵培养基氨源替代研究

3.3.3碳源浓度对γ-PGA 产量的影响

3.3.4盐浓度对γ-PGA 产量的影响

3.3.5前体添加量对γ-PGA产量的影响

3.4小结

第四章ZJU-7分批发酵工艺研究

4.1前言

4.2材料与方法

4.2.1菌株

4.2.2培养基

4.2.3培养方法

4.2.4测定方法

4.3实验结果与讨论

4.3.1摇瓶中种子生长曲线

4.3.2不同初始葡萄糖浓度对菌体生长的影响

4.3.3不同初始葡萄糖浓度对γ-PGA 产量的影响

4.3.4 以麸酸作为前体的发酵结果

4.4小结

第五章ZJU-7流加发酵工艺研究

5.1前言

5.2材料与方法

5.2.1菌株

5.2.2培养基

5.2.3培养方法

5.2.4测定方法

5.3实验结果与讨论

5.3.1 流加葡萄糖的发酵结果

5.3.2葡萄糖前期流加后期不流加的发酵结果

5.3.3流加麸酸前体的发酵结果

5.3.4流加培养液的发酵结果

5.3.5 1OOL发酵罐上放大发酵结果

5.4小结

第六章CFBB反应器发酵生产γ-PGA初探

6.1前言

6.2材料与方法

6.2.1菌株

6.2.2培养基

6.2.3培养方法

6.2.4测定方法

6.3实验结果与讨论

6.3.1 本实验中使用的CFBB结构示意图

6.3.2 CFBB发酵结果

6.3.3 CFBB中固定化细胞密度测定

6.4小结

结论

参考文献

简历