一种高转化效率感受态细胞的制备方法

摘要

本发明公开了一种高转化效率感受态细胞的制备方法，涉及微生物技术领域，解决现有技术操作不便、转化效率和得率低的问题。步骤为：(1)菌种在LB平板上划线，37℃过夜培养；(2)接种于SOC培养基，18℃，250rpm震荡培养至OD

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种高转化效率感受态细胞的制备方法。

技术背景

使带有遗传信息的DNA分子进入宿主细胞的过程称为“转化”；经过物理或化学方式的处理而具有容易接受外来DNA分子进入的宿主细胞，称为“感受态细胞”。在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。感受态细胞的状态直接影响转化的效率，为了使宿主细胞进行特定DNA或蛋白质的复制或表达，获得易于转化的感受态细胞是关键。

大肠杆菌具有生长快速、容易培养与研究较透彻等优势，目前已成为所有生物技术相关实验中最广泛地用作宿主细胞的微生物。制备感受态细胞的方法主要包括物理方法和化学方法两大类。其中较常用的物理方法包括电刺激、超声波、渗透压等；化学方法包括CaCl₂、RbCl(KCl)、Inoue法等。化学法具有快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广的优点，然而现有的化学方法存在操作不便，转化率及得率低的缺点。

为了解决现有技术存在的上述缺陷，本发明研发了一种转化效率高、操作简单、成本低廉的感受态细胞的制备方法，使得感受态细胞转化效率可达1×10⁸-5×10⁹。

发明内容

本发明是为了解决现有技术存在的操作不便、转化率和得率低的问题，而提供了一种高转化效率感受态细胞的制备方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种高转化效率感受态细胞的制备方法，步骤为：

(1)将大肠杆菌在不含抗性的LB平板上划线，37℃过夜培养得微生物单菌落；

(2)取微生物单菌落接种于含有250mL SOC培养基的1L锥形瓶中培养，18℃，250rpm条件下震荡培养至OD₆₀₀值在2.0-5.0之间；

(3)将震荡培养所得的菌液转移至灭过菌的50mL管中，2500g/5min，4℃条件下离心，弃上清，将沉淀菌种加入已提前在4℃预冷的缓冲液，手动重悬；

(4)将步骤(3)所得的培养液在2500g/5min，4℃条件下离心，弃上清，加入缓冲液和DMSO，使重悬后OD₆₀₀值为5.0，DMSO终浓度为7％；

(5)将步骤(4)所得的培养液分装到EP管，然后放入液氮中速冻，储存于-80℃冰箱中，即得。

进一步地，所述的SOC培养基的制备步骤为：将20g蛋白胨，5g酵母提取物，0.5g NaCl，0.186g KCl，加入900mL超纯水中，充分搅拌溶解后用1M HCl调PH至7.0，用超纯水定容至1L，高温高压灭菌后，加入5mL灭菌的2M MgCl₂，加入20mL过滤除菌的1MGlucose，混合均匀，4℃保存。

所述的缓冲液的制备方法为：PIPES 10mM，CaCl₂>2>

步骤(1)中所述的大肠杆菌在-80℃冰箱中保存。

本发明选择营养丰富的SOC培养基培养大肠杆菌，其中glucose、KCl、MgCl₂，glucose，tryptone含量更高，使得菌体生长状态更好；而18℃的低温培养，相对于37℃，18℃低温条件下，菌体生长较为缓慢，更容易控制菌体生长所需的时间，更不容易因菌液生长过快使浓度过高而导致转化效率的降低，从而使得菌体的生长状态更加可控，转化效率更高；培养物的OD₆₀₀值在2.0-5.0之间，相对于传统的OD₆₀₀值在0.3-0.5之间，本发明OD₆₀₀值跨度更大，操作上更容易使菌液生长浓度达到所要求的范围，感受态细胞的得率更高，操作更加简单；Ca²⁺处理的感受态细胞，其转化效率一般能达到5×10⁶-2×10⁷转化子/质粒DNA，本发明缓冲液在Ca²⁺的基础上，联合二价金属离子Mn²⁺、DMSO物质处理细菌，则可使转化效率提高100-1000倍，达到1×10⁸-5×10⁹；将培养物用液氮速冻，可避免感受态细胞转化效率的下降。

与现有技术相比，本发明操作简单，感受态细胞得率高，转化效率可达1×10⁸-5×10⁹。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

(1)取少量保存在-80℃的大肠杆菌TG1菌种在LB平板上划线，37℃过夜培养；

(2)挑取单克隆至含有250mL SOC培养基的1L锥形瓶中培养，18℃250rpm条件下培养至OD₆₀₀值在2.0-3.0之间；其中细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×10⁷个左右为佳，即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD₆₀₀值来控制；

SOC培养基的制备步骤为：将20g蛋白胨，5g酵母提取物，0.5g NaCl，0.186g KCl，加入900mL超纯水中，充分搅拌溶解后用1M HCl调PH至7.0，用超纯水定容至1L，高温高压灭菌后，加入5mL灭菌的2M MgCl₂，加入20mL过滤除菌的1M>

(3)将培养物转移至灭过菌的50mL管中，2500g/5min 4℃条件下离心收菌；

(4)弃上清，加入已提前在4℃预冷的缓冲液，手动重悬，此步骤不可剧烈摇晃；

缓冲液的制备方法为：将PIPES 10mM，CaCl₂>2>

(5)2500g/5min 4℃条件下离心，弃上清；加入适量缓冲液和DMSO，使重悬后OD₆₀₀值为5.0，DMSO终浓度为7％；

(6)分装100μl每管，然后放入液氮中速冻，确保液氮没过所有EP管，倒掉冰盒内所有液氮后，放置10s(防爆)，再储存于-80℃冰箱中，即得；

(7)用时取出于冰上融化，加入转化产物轻柔混匀，冰上放置30min后，42℃热击45s，涂板。

实施例2

(1)取少量菌种在不含抗性的LB平板上划线，37℃过夜培养；

(2)挑取单克隆至含有250mL SOC培养基的1L锥形瓶中培养，18℃250rpm条件下培养至OD₆₀₀值在3.0-4.0之间；

SOC培养基的制备步骤为：将20g蛋白胨，5g酵母提取物，0.5g NaCl，0.186g KCl，加入900mL超纯水中，充分搅拌溶解后用1M HCl调PH至7.0，用超纯水定容至1L，高温高压灭菌后，加入5mL灭菌的2M MgCl₂，加入20mL过滤除菌的1M>

(3)将培养物转移至灭过菌的50mL管中，2500g/5min 4℃条件下离心收菌；

(4)弃上清，加入已提前在4℃预冷的缓冲液，手动重悬，此步骤不可剧烈摇晃；

缓冲液的制备方法为：将PIPES 10mM，CaCl₂>2>

(5)2500g/5min 4℃条件下离心，弃上清；加入适量缓冲液和DMSO，使重悬后OD₆₀₀值为5.0，DMSO终浓度为7％；

(6)分装100μl每管，然后放入液氮中速冻，确保液氮没过所有EP管，倒掉冰盒内所有液氮后，放置10s(防爆)，再储存于-80℃冰箱中，即得；

(7)用时取出于冰上融化，加入转化产物轻柔混匀，冰上放置30min后，42℃热击45s，涂板。

实施例3

(1)取少量菌种在不含抗性的LB平板上划线，37℃过夜培养；

(2)挑取单克隆至含有250mL SOC培养基的1L锥形瓶中培养，18℃250rpm条件下培养至OD₆₀₀值在4.0-5.0之间；

(3)SOC培养基的制备步骤为：将20g蛋白胨，5g酵母提取物，0.5g NaCl，0.186g KCl，加入900mL超纯水中，充分搅拌溶解后用1M HCl调PH至7.0，用超纯水定容至1L，高温高压灭菌后，加入5mL灭菌的2M MgCl₂，加入20mL过滤除菌的1M>

将培养物转移至灭过菌的50mL管中，2500g/5min 4℃条件下离心收菌；

(4)弃上清，加入已提前在4℃预冷的缓冲液，手动重悬，此步骤不可剧烈摇晃；

缓冲液的制备方法为：将PIPES 10mM，CaCl₂>2>

(5)2500g/5min 4℃条件下离心，弃上清；加入适量缓冲液和DMSO，使重悬后OD₆₀₀值为5.0，DMSO终浓度为7％；

(6)分装100μl每管，然后放入液氮中速冻，确保液氮没过所有EP管，倒掉冰盒内所有液氮后，放置10s(防爆)，再储存于-80℃冰箱中，即得；

(7)用时取出于冰上融化，加入转化产物轻柔混匀，冰上放置30min后，42℃热击45s，涂板。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。