鱼精DNA-NA、鱼精蛋白提取物及其制备方法

摘要

本发明公开了一种鱼精DNA-NA的提取物、鱼精蛋白提取物及其制备方法。方法如下：(1)取鱼精巢，加入水清洗，沥干水分，得到鱼精巢原料；(2)加入1～10倍体积的水，在温度37～58℃下，加入水解用生物酶0.1～1.2％，酶解30～300分钟；(3)将滤液浓缩至30～80％；(4)调节pH至6.0～8.0上阳离子交换树脂柱，收集流出液，将合并后的流出液和洗脱液浓缩，乙醇沉淀，收集沉淀；(5)采用1～5％氯化钠溶液继续洗脱阳离子交换树脂至流出液无蛋白时，收集洗脱液。所述鱼精蛋白提取物和鱼精DNA-NA的提取物收率和纯度高，可同时获得，不使用具有污染和毒性的物质。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及鱼精DNA-NA、鱼精蛋白提取物及其制备方法。

背景技术

成熟雄鱼的精巢组织称鱼精，因具有异味，多被废弃或作废料。但是，鱼精巢中含有大量的鱼精蛋白和鱼精核酸类物质，这两种物质均具有良好的功效。鱼精蛋白(protamine)，是一类碱性蛋白质，其中的精氨酸含量相对较多，精氨酸具有强化肝功能，刺激垂体释放促性腺激素的作用，可治疗男性不育症。同时，鱼精蛋白具有广谱抗菌活性，是一种天然防腐剂，且由于鱼精蛋白完全是天然成分，具有很高的安全性，具有安全、无毒、无副作用的优点，作为一种新型防腐剂，在食品工业中具有广阔的应用前景。

鱼精中的核酸类物质(DNA)具有一定的美容功能，作为天然的皮肤保护剂和营养剂，这些有效成分经皮吸收的时候能促进皮肤细胞再生或细胞活化，具有改善皮肤纹理、防止肌肤粗糙、褐斑、雀斑、皱纹等，达到防止皱纹和美白皮肤的效果。

目前关于鱼精蛋白和鱼精DNA制备方法的研究均为两类物质的单独提取工艺，仅仅是针对一种功效成分的提取工艺研究，比如提取鱼精蛋白时必定会舍弃鱼精核酸类物质，提取鱼精核酸类物质时必定会舍弃鱼精蛋白类物质，这对于工业化大生产无疑是很大的浪费。刘红玉等(大马哈鱼鱼精蛋白的提取及抑菌作用的研究，食品科学，2007年第2期37～39页)采用正交试验法筛选提取鱼精蛋白的最佳工艺条件，其条件为：H₂SO₄浓度为7.5％，用量为鱼精的3.5倍(W/W)，提取时间2h，95％乙醇用量为鱼精的3倍(W/W)。对鱼精蛋白进行分析，其蛋白质含量达到89.7％，且精氨酸含量较高。吴燕燕等(淡水鱼精巢核蛋白和鱼精蛋白的提取及营养分析，营养学报，1999年第1期)研究提取淡水鱼精巢中的核蛋白和鱼精蛋白的工艺条件，采用正交试验法筛选，确定了提取蛋白的最佳工艺条件为：NaCl浓度1.0mol/L，NaCl用量为原料量的10倍(W/W)，提取时间1h，95％乙醇用量为料液量的2倍(W/W)。提取鱼精蛋白的最佳工艺条件为：H₂SO₄浓度为5.0％，用量为原料量的3倍(W/W)，提取时间2h，95％乙醇用量为料液量的3倍(W/W)。辛修明等(从河鲀鱼精巢中提取DNA-NA的研究，河北渔业，1994年第5期)采用SDS、苯酚饱和溶液脱蛋白方法，得到大分子量的河鲀鱼DNA-NA产品，其中磷含量8.5％，DNA含量95.05％，蛋白质含量1％，所述的百分比为质量百分比。吴汉民(从鱼精巢中提取高聚NA-DNA的研究，浙江海洋学院学报(自然科学版)，1983年第2期)采用先用酚进行第一次变性，然后再用5％SDS-CHCl₃进行第二次变性的制备工艺，制得的成品，经鉴定达到国际同类产品的质量指标。

由上可见，现有技术中仅有只针对鱼精蛋白提取物或鱼精DNA的提取方法，造成资源浪费，因此亟需开发新的提取方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服了现有鱼精蛋白和鱼精DNA的制备方法往往只能针对其中一种成分进行提取，并且提取工艺中使用有毒物质的缺陷，提供了鱼精DNA-NA提取物、鱼精蛋白提取物及其制备方法和同步提取两者的制备方法。该制备方法充分利用原料资源，能够同时有效提取多种有效成分，操作步骤简单方便，工艺合理，获得的产品的收率和纯度显著提高，有利于应用于工业化生产。

本发明提供一种同时获得鱼精DNA-NA提取物和鱼精蛋白提取物的方法，其包括以下的步骤：

①取鱼精巢，加入水清洗，沥干水分，得到清洗干净的鱼精巢原料；

②向步骤①所得的鱼精巢原料中加入1～10倍体积的水，在温度37～58℃下，加入0.1～1.2％水解用生物酶，酶解30～300分钟，得酶解后的鱼精巢原料，所述的水解用生物酶为蛋白酶，所述的百分比为占鱼精巢原料的质量百分比；

③将步骤②所得的酶解后的鱼精巢原料过滤，将过滤所得的滤液浓缩至所述滤液原体积的10～80％，即为料液A；

④将步骤③所得的料液A调节pH值至6.0～8.0得料液B，上阳离子交换树脂柱，收集流出液，并用水清洗所述阳离子交换树脂柱，合并流出液和洗脱液，浓缩，用乙醇进行沉淀，收集沉淀，获得鱼精巢提取物Ⅰ，即为鱼精DNA-NA的提取物，所述的水的体积为所述阳离子交换树脂柱体积的2～6倍；

⑤采用1～5％氯化钠溶液继续洗脱所述阳离子交换树脂，洗脱至流出液无蛋白时，停止洗脱，收集洗脱液获得鱼精巢提取物Ⅱ，即为鱼精蛋白的提取物，所述百分比为质量百分比。

步骤①为：取鱼精巢，加入水清洗，沥干水分，得到清洗干净的鱼精巢原料。其中，所述的鱼为本领域常规的鱼，较佳地为选自鲑鱼、鳕鱼和鲣鱼的一种或多种。

步骤②为：向步骤①所得的鱼精巢原料中加入1～10倍体积的水，在温度37～58℃下，加入0.1～1.2％水解用生物酶，酶解30～300分钟，得酶解后的鱼精巢原料，所述的水解用生物酶为蛋白酶，所述的百分比为占鱼精巢原料的质量百分比。其中，较佳地，所述的水解用蛋白酶为碱性蛋白酶、复合风味蛋白酶和胰蛋白酶中的一种或多种。较佳地，向步骤①所得的鱼精巢原料中加入2～6倍体积的水。较佳地，所述的温度为45～58℃。较佳地，所述酶解的时间为180～240分钟。

步骤③为：将步骤②所得的酶解后的鱼精巢原料过滤，将过滤所得的滤液浓缩至所述滤液原体积的10～80％，即为料液A。其中，较佳地，将过滤所得的滤液浓缩至所述滤液原体积的40～60％。

步骤④为：将步骤③所得的料液A调节pH值至6.0～8.0得料液B，上阳离子交换树脂柱，收集流出液，并用水清洗所述阳离子交换树脂柱，合并流出液和洗脱液，浓缩，用乙醇进行沉淀，收集沉淀，获得鱼精巢提取物Ⅰ，即为鱼精DNA-NA的提取物，所述的水的体积为所述阳离子交换树脂柱体积的2～6倍。其中，较佳地，所述料液A调节pH至6.5～7.5。较佳地，所述的水的体积为所述阳离子交换树脂柱体积的2～4倍。较佳地，所述的浓缩为将所述流出液和所述洗脱液浓缩至所述流出液和所述洗脱液的原总体积的15％～50％；更佳地为25％～50％。较佳地，所述的百分比为乙醇占浓缩至原总体积15％～50％的所述流出液和所述洗脱液与所述乙醇体积之和的百分比。

步骤⑤为：采用1～5％氯化钠溶液继续洗脱所述阳离子交换树脂，洗脱至流出液无蛋白时，停止洗脱，收集洗脱液获得鱼精巢提取物Ⅱ，即为鱼精蛋白的提取物，所述百分比为质量百分比。其中，较佳地，采用1～2％氯化钠溶液，所述百分比为质量百分比。

较佳地，所述的方法还包括如下的步骤：

⑥取所述的鱼精巢提取物Ⅰ干燥；和/或，

⑦将步骤⑤所得的鱼精巢提取物Ⅱ进行脱味脱色处理，干燥。

步骤⑥为：取所述的鱼精巢提取物Ⅰ干燥。其中，所述的干燥为本领域常规的干燥，较佳地为喷雾干燥或真空干燥；所述干燥的时间为本领域常规的时间，较佳地为30～120分钟。所述干燥的温度为本领域常规的温度，较佳地为40～60℃。

步骤⑦为：将步骤⑤所得的鱼精巢提取物Ⅱ进行脱味脱色处理，干燥。其中，所述的脱色脱味处理为本领域常规的脱色脱味处理，较佳地为活性炭处理。所述的干燥为本领域常规的干燥，较佳地为喷雾干燥或真空干燥；更佳地，所述真空干燥在所述鱼精巢提取物Ⅱ脱色脱味后浓缩至膏状时进行。所述干燥的时间为本领域常规的时间，较佳地为30～120分钟。所述干燥的温度为本领域常规的温度，较佳地为40～60℃。

利用所述的同时获得鱼精DNA-NA的提取物和鱼精蛋白提取物的方法，所得的鱼精DAN-NA的提取物的纯度为85％以上，所述的百分比为鱼精DNA-NA占鱼精DNA-NA的提取物的质量百分比。鱼精DNA-NA的收率为3％～7％，所述的百分比为鱼精DNA-NA占鱼精巢的质量百分比。所得的鱼精蛋白提取物的纯度为90％以上，所述的百分比为鱼精蛋白占鱼精蛋白的提取物的质量百分比。收率为10～15％，所述的百分比为鱼精蛋白占鱼精巢的质量百分比。

本发明提供一种鱼精DNA-NA的提取物，其包括85～98％核酸和0.1～8％游离蛋白质，较佳的，游离蛋白的含量为1.0％以下，所述百分比为质量百分比。所述鱼精DNA-NA的提取物的分子量为5000～60万道尔顿。

本发明提供一种鱼精蛋白的提取物，其包括85％～98％蛋白质和1～5％核酸，所述百分比为质量百分比。所述鱼精蛋白的提取物中精氨酸含量为50％～70％。

本发明提供一种鱼精DNA-NA的提取物的制备方法，所述的鱼精DNA-NA为鱼精DNA的钠盐，其包括以下的步骤：

步骤①～步骤④与所述的同时获得鱼精DNA-NA提取物和鱼精蛋白提取物的方法中的步骤①～步骤④相同。

较佳地，所述的制备方法还包括如下的步骤：

取步骤④所述的鱼精巢提取物Ⅰ，干燥。

本发明提供一种鱼精蛋白提取物的制备方法，其包括如下步骤：

步骤①～步骤⑤与所述的同时获得鱼精DNA-NA提取物和鱼精蛋白提取物的方法中的步骤①～步骤⑤相同。

较佳地，所述的制备方法还包括如下的步骤：

将步骤⑤所得的鱼精巢提取物Ⅱ进行脱味脱色处理，干燥。

本发明提供一种所述的鱼精DNA-NA在制备保湿和抗衰老皮肤外用剂中的应用。

本发明提供一种所述的鱼精蛋白提取物在制备防腐剂中的应用。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：所述的同时获得鱼精DNA-NA和鱼精蛋白提取物的制备方法优化了提取工艺，能够同步提取得到鱼精蛋白提取物和鱼精DNA-NA，充分利用鱼精巢资源，并且获得的鱼精蛋白提取物和鱼精DNA-NA收率和纯度高。并且在制备方法中不使用具有污染和毒性的物质，避免使用常规方法中硫酸、SDS、苯酚等物质，不产生污染物，具有良好的社会效益和经济效益。所述的鱼精蛋白具有良好的抗菌性，可以应用于防腐剂的制备。所述的鱼精DNA-NA则具有保湿和抗衰老的功效，可应用于皮肤外用剂的制备。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1制备鱼精DNA-NA的提取物

(1)取鱼精巢，加入水清洗，沥干水分，得到清洗干净的鱼精巢原料；

(2)向步骤(1)得到的鱼精巢原料中加入3倍体积的水，在56℃下，加入0.5％碱性蛋白酶酶解240分钟，得酶解后的鱼精巢原料，所述的百分比为占鱼精巢原料的质量百分比；

(3)将步骤(2)所得的酶解后的鱼精巢原料过滤，将过滤得到的滤液浓缩至所述滤液原体积的50％，即为料液A；

(4)将步骤(3)所得的料液A调节pH值至6.5得料液B，上阳离子交换树脂柱，收集流出液，并用水清洗所述阳离子交换树脂柱，合并流出液和洗脱液，将其浓缩至流出液和洗脱液原总体积的15％，用乙醇沉淀，收集沉淀，即为鱼精巢提取物Ⅰ，其中乙醇的终浓度为45％，所述百分比为乙醇占浓缩至15％的所述流出液、洗脱液和所述乙醇总体积的体积百分比；所述的水的体积为所述阳离子交换树脂柱体积的2倍。

(5)将步骤(4)所得的鱼精巢提取物Ⅰ40℃干燥30分钟，即可。

将获得的鱼精DNA-NA的提取物测定，发现核酸含量为85％，游离蛋白质的含量为2.5％，所述的百分比为质量百分比。获得的鱼精DNA-NA的收率为3％，所述的百分比为鱼精DNA-NA占鱼精巢的质量百分比。

实施例2制备鱼精蛋白提取物

(1)取鱼精巢，加入水清洗，沥干水分，得到清洗干净的鱼精巢原料；

(2)向步骤(1)得到的鱼精巢原料中加入5倍体积的水，在45℃下，加入0.6％复合风味蛋白酶酶解60分钟，得酶解后的鱼精巢原料，所述的百分比为占鱼精巢原料的质量百分比；

(3)将步骤(2)所得的酶解后的鱼精巢原料过滤，将过滤得到的滤液浓缩至所述滤液原体积的25％，即为料液A；

(4)将步骤(3)所得的料液A调节pH值至7.5得料液B，上阳离子交换树脂柱，收集流出液，并用水清洗所述阳离子交换树脂柱，合并流出液和洗脱液，将其浓缩至流出液和洗脱液原总体积的50％，用乙醇沉淀，收集沉淀，即为鱼精巢提取物Ⅰ，其中乙醇的终浓度为70％，所述百分比为乙醇占浓缩至50％的所述流出液、洗脱液和所述乙醇总体积的体积百分比；所述的水的体积为所述阳离子交换树脂柱体积的4倍。

(5)采用1％氯化钠溶液继续洗脱所述阳离子交换树脂，洗脱至流出液无蛋白时，停止洗脱，收集洗脱液，即得鱼精巢提取物Ⅱ，所述百分比为质量百分比；

(6)将步骤(5)所得的鱼精巢提取物Ⅱ用活性炭进行脱味脱色处理，进行60℃30min喷雾干燥，即可。

将获得的鱼精蛋白提取物进行测定，蛋白质92％、核酸2％，所述百分比为质量百分比。所述鱼精蛋白的提取物中精氨酸含量为60％。获得的鱼精蛋白的收率为10％，所述的百分比为鱼精蛋白占鱼精巢的质量百分比。

实施例3制备鱼精DNA-NA的提取物和鱼精蛋白提取物

(1)取鱼精巢，加入水清洗，沥干水分，得到清洗干净的鱼精巢原料；

(2)向步骤(1)得到的鱼精巢原料中加入10倍体积的水，在58℃下，加入0.5％胰蛋白酶酶解300分钟，得酶解后的鱼精巢原料，所述的百分比为占鱼精巢原料的质量百分比；

(3)将步骤(2)所得的酶解后的鱼精巢原料过滤，将过滤得到的滤液浓缩至所述滤液原体积的10％，即为料液A；

(4)将步骤(3)所得的料液A调节pH值至7得料液B，上阳离子交换树脂柱，收集流出液，并用水清洗所述阳离子交换树脂柱，合并流出液和洗脱液，将其浓缩至流出液和洗脱液原总体积的25％，用乙醇沉淀，收集沉淀，即为鱼精巢提取物Ⅰ，其中乙醇的终浓度为60％，所述百分比为乙醇占浓缩至25％的所述流出液、洗脱液和所述乙醇总体积的体积百分比；所述的水的体积为所述阳离子交换树脂柱体积的6倍；

(5)将步骤(4)所得的鱼精巢提取物Ⅰ50℃喷雾干燥120分钟，即可；

(6)采用3％氯化钠溶液继续洗脱所述阳离子交换树脂，洗脱至流出液无蛋白时，停止洗脱，收集洗脱液，即得鱼精巢提取物Ⅱ，所述百分比为质量百分比；

(7)将步骤(6)所得的鱼精巢提取物Ⅱ用活性炭进行脱味脱色处理，进行40℃喷雾干燥120min。

将获得的鱼精DNA-NA的提取物测定，发现核酸含量为90％，游离蛋白质的含量为5％，所述的百分比为质量百分比。获得的鱼精DNA-NA的收率为7％，所述的百分比为鱼精DNA-NA占鱼精巢的质量百分比。

将获得的鱼精蛋白提取物进行测定，蛋白质90％、核酸5％，所述百分比为质量百分比。所述鱼精蛋白的提取物中精氨酸含量为58.5％。获得的鱼精蛋白的收率为15％，所述的百分比为鱼精蛋白占鱼精巢的质量百分比。

实施例4制备鱼精DNA-NA的提取物和鱼精蛋白提取物

(1)取鱼精巢，加入水清洗，沥干水分，得到清洗干净的鱼精巢原料；

(2)向步骤(1)得到的鱼精巢原料中加入1倍体积的水，在37℃下，加入0.1％碱性蛋白酶酶解180分钟，得酶解后的鱼精巢原料，所述的百分比为占鱼精巢原料的质量百分比；

(3)将步骤(2)所得的酶解后的鱼精巢原料过滤，将过滤得到的滤液浓缩至所述滤液原体积的40％，即为料液A；

(4)将步骤(3)所得的料液A调节pH值至8得料液B，上阳离子交换树脂柱，收集流出液，并用水清洗所述阳离子交换树脂柱，合并流出液和洗脱液，将其浓缩至流出液和洗脱液原总体积的50％，用体积比90％的乙醇沉淀，收集沉淀，即为鱼精巢提取物Ⅰ，其中乙醇的终浓度为50％，所述百分比为乙醇占浓缩至50％的所述流出液、洗脱液和所述乙醇总体积的体积比；所述的水的体积为所述阳离子交换树脂柱体积的3倍；

(5)将步骤(4)所得的鱼精巢提取物Ⅰ60℃真空干燥60分钟，即可。

(6)采用5％氯化钠溶液继续洗脱所述阳离子交换树脂，洗脱至流出液无蛋白时，停止洗脱，收集洗脱液，即得鱼精巢提取物Ⅱ，所述百分比为质量百分比；

(7)将步骤(6)所得的鱼精巢提取物Ⅱ用活性炭进行脱味脱色处理，在所述鱼精巢提取物Ⅱ脱色脱味后浓缩至膏状时，50℃真空干燥100min。

实施例5制备鱼精DNA-NA的提取物和鱼精蛋白提取物

(1)取鱼精巢，加入水清洗，沥干水分，得到清洗干净的鱼精巢原料；

(2)向步骤(1)得到的鱼精巢原料中加入6倍体积的水，在50℃下，加入0.1％胰蛋白酶、0.1％复合风味蛋白酶和1％胰蛋白酶酶解30分钟，得酶解后的鱼精巢原料，所述的百分比为占鱼精巢原料的质量百分比；

(3)将步骤(2)所得的酶解后的鱼精巢原料过滤，将过滤得到的滤液浓缩至所述滤液原体积的80％，即为料液A；

(4)将步骤(3)所得的料液A调节pH值至6得料液B，上阳离子交换树脂柱，收集流出液，并用水清洗所述阳离子交换树脂柱，合并流出液和洗脱液，将其浓缩至流出液和洗脱液原总体积的15％，用体积比95％的乙醇沉淀，收集沉淀，即为鱼精巢提取物Ⅰ，其中乙醇的终浓度为70％，所述百分比为乙醇占浓缩至15％的所述流出液、洗脱液和所述乙醇总体积的体积比；所述的水的体积为所述阳离子交换树脂柱体积的2倍；

(5)将步骤(4)所得的鱼精巢提取物Ⅰ60℃真空干燥40分钟；

(6)采用2％氯化钠溶液继续洗脱所述阳离子交换树脂，洗脱至流出液无蛋白时，停止洗脱，收集洗脱液，即得鱼精巢提取物Ⅱ，所述百分比为质量百分比；

(7)将步骤(6)所得的鱼精巢提取物Ⅱ用活性炭进行脱味脱色处理，进行55℃喷雾干燥80min。

实施例6鱼精DNA-NA的提取物进行保湿、抗衰老相关美容效果测试

测试样品：将实施例1制备的鱼精DNA-NA配制成皮肤外用剂A和不含有鱼精DNA-NA的普通皮肤外用剂

受试人群：年龄25-30岁年龄段的女性16名。

16名受试者在恒温恒湿的稳定环境的实验室内，露出待测手前臂静坐15分钟。用水分测试探头测量已被标尺标记部位皮肤的水分初始值，再将不同的待测样品均匀涂抹在标尺标记部位。让受试者在实验室静坐3小时，再用水分测试探头测量被标记部位的水分值。

结果发现，在同等条件下，含有鱼精DNA-NA的提取物的皮肤外用剂A的保湿性要远远优于不含有鱼精DNA-NA的提取物的普通皮肤外用剂的保湿性，并且保湿性可以持续较长时间。

此外，还分别用皮肤外用剂A和普通皮肤外用剂培养人皮肤成纤维细胞，结果发现含有鱼精DNA-NA的皮肤外用剂A对人皮肤成纤维细胞培养的促进作用要远远优于不含有鱼精DNA-NA的提取物的普通皮肤外用剂，因此鱼精DNA-NA的提取物具有抗衰老的美容效果。

实施例7鱼精蛋白的提取物的抑菌实验

将实施例2制备的鱼精蛋白的提取物配置成防腐剂，将所述防腐剂添加至培养有金色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach)、大肠杆菌(Escherichia coli)和绿脓杆菌(P.aeruginosa)的培养基中，发现含有实施例2制备的鱼精蛋白的提取物的抑菌剂可以明显抑制金色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌的生长。因此，鱼精蛋白的提取物具有抑菌效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不构成对权利要求范围的限制，本领域内技术人员可以想到的其他实质上等同的替代，均在本发明保护范围内。