牛精子全蛋白制备方法的建立及鲜、冻精差异蛋白的检测

摘要

本研究分析了冷冻保存对牛精子蛋白表达的影响，探索了牛精液冷冻损伤的分子机理，为提高牛及其它物种的精子冷冻效果提供参考。 通过对几种不同的制备精子全蛋白的方法、不同染色方法及各个方法的重复性进行比较，最终选择Trizol法作为精子蛋白制备的方法。应用固相pH梯度(Immobilized pHgradient，IPG)胶条和双向凝胶电泳技术(two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)，采用硝酸银染色法，利用Image Master<'TM> 2D Platinum软件进行图谱分析。结果检测出约1 600多个蛋白质点，蛋白质分子量基本分布在10～100KD，等电点约为pH4～9的区域内。同时，对等电聚焦(Isoelectric focusing，IEF)和十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodiumdo-decylsufate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)中出现的具体问题进行分析，初步建立了牛精子蛋白表达的二维电泳图谱。 采用已经建立的精子二维电泳方法，对牛新鲜精子和冷冻精子进行分析。结果获得了背景清晰、分辨率高、重复性好的鲜精和冻精蛋白的双向凝胶电泳图谱，鲜精和冻精蛋白质点数为：1681个和1513个，其匹配率达59.6％和75.7％。冻精蛋白质点有10.2％的缺失，两组存在显著性差异(p<0.05)。其中选取鲜精组和冻精组8个差异点，5个蛋白质点在冻精中表达下调，3个蛋白质点在冻精中表达缺失，以备下一步的质谱分析。 对得到的鲜精和冻精差异蛋白质点的鉴定，将为揭示精子冷冻的机理提供实验依据，为进一步提高牛精液冷冻保存效果提供参考，为进一步提高猪、马、羊等物种精液的冷冻效果提供了理论依据。另外该研究对胚胎的冷冻保存也同样具有比较重要的理论与现实意义。

目录

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前言

第一章文献综述

1.1精液冷冻的影响因素

1.1.1冷冻稀释液

1.1.2冷冻力法的影响

1.2冷冻解冻后精子所发生的物理化学变化

1.2.1精子形态结构的变化

1.2.2精子中蛋白质的变化

1.3二维电泳蛋白制备方法的研究进展

1.3.1变性剂

1.3.2去污剂

1.3.3还原剂

1.3.4载体两性电解质

1.4精子二维电泳技术的研究进展

1.4.1二维电泳技术的研究进展

1.4.2二维电泳技术在研究精子方面的应用

1.4.3精子蛋白制备方法的研究进展

1.5本研究目的和意义

第二章材料与方法

2.1试验材料

2.1.1样本的采集

2.1.2主要仪器

2.1.3主要试剂

2.1.4试剂配制

2.2试验方法

2.2.1精子细胞的洗涤

2.2.2精子细胞不同裂解方法的比较

2.2.3蛋白定量

2.2.4一向等电聚焦

2.2.5IPG胶条的平衡和转移

2.2.6二向SDS-PAGE

2.2.7染色

2.2.8凝胶图像分析

第三章结果

3.1三种裂解方法的比较

3.1.1三种裂解方法提取蛋白浓度的比较

3.1.2尿素裂解法与尿素盐酸胍两步裂解法的比较

3.1.3不同染色方法的比较

3.1.4尿素盐酸胍两步裂解法重复性的比较

3.1.5尿素盐酸胍两步裂解法与Trizol法的比较

3.1.6牛精子蛋白二维电泳全蛋白图谱的建立

3.2鲜精和冻精蛋白质图谱的表达变化

第四章讨论

4.1选择合适的蛋白制备方法

4.2第一向等电聚焦条件的优化

4.3平衡条件的优化

4.4转移及二向SDS-PAGE

4.5 染色

4.6凝胶图像分析

4.7双向电泳操作注意事项

4.8鲜精和冻精差异蛋白的软件分析

第五章结论

参考文献

附录

致谢

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