牛鲜精、冻精抑制消减文库的构建

摘要

哺乳动物精液的冷冻保存在畜牧生产中起着重要作用。冷冻保存可以提高优秀种公畜的利用效率，降低种公畜的数量，大幅度降低饲养成本；并且可以通过联合育种，使优秀种公畜的遗传基础迅速传播，加快了品种培育的进程；同时对稀有遗传资源的保存也起到一定的作用。但是，目前精液的冷冻保存仍然存在受胎率低等问题。其主要原因为精子在冷冻复苏过程中受到了损伤，导致精子活力降低。很多学者从稀释液、冷冻速率、剂型对精子顶体、膜结构的影响等方面进行了深入细致的研究，但都没有取得理想的结果。精子冷冻损伤的机理成为进一步提高冷冻保存效率的限制因素，即只有深刻揭示精子冷冻损伤的机理，才能为精子的冷冻保存提供理论基础。RNA作为遗传信息传递的中间载体，在精子发生、精子存活、精卵结合过程中都起着重要的作用。通过对转录组的系统研究，可初步确定精子在冷冻复苏过程中基因的表达与否及丰度变化情况，为精子的冷冻损伤提供依据。但是，由于哺乳动物的成熟精子作为精子发生的终末细胞，其形态高度浓缩，核外仅有一层薄薄的细胞膜，细胞质极少，RNA的含量极微，这就为我们研究提出了一个挑战。 本研究针对精子结构和RNA含量特点，对牛精子RNA提取进行了摸索，找到一个针对牛精子RNA提取的方法-热TRIzol法，并通过对持家基因GAPDH的PCR扩增检测，证明了所制备RNA有较好的完整性，同时针对精子较低的RNA含量，采用SUPER SMART技术对所提取的鲜精、冻精转录本进行了等比例扩增，并采用限制性内切酶RsaⅠ对扩增后的cDNA进行了酶切，酶切后的cDNA分成两部分连接上不同的接头，同未连接接头的driver进行连续两轮的杂交，然后通过两轮PCR扩增后将扩增子连接上pGEMTeasy载体并转化到DH5α感受态大肠杆菌体内。经蓝白斑筛选，正库得到1248个克隆，反库得到672个克隆，随机在正库和反库中各挑取300个克隆进行测序，将所得到的序列去载后，通过BLAST进行数据比对。发现大多数的序列都没有找到同源基因。这可能由于牛的EST还很不完善所致，这样可以通过对一些新的EST进行研究，从而不断充实数据库，并且找到一些与冷冻损伤有关转录本，为精子的冷冻损伤机理的研究提供试验依据和理论基础。

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第一章 绪论

1.1冷冻对精子遗传物质的影响

1.1.1冷冻对精子染色体的影响

1.1.2冷冻保存对精子染色质的影响

1.1.3冷冻对精子转录本的影响

1.2.精子中mRNA研究方法的进展

1.2.1差别筛选(Differential Screening)

1.2.2消减杂交(Subtractive Hybridization)

1.2.3 mRNA差异显示技术(Differential Display RT-PCR，DD RT-PCR)

1.2.4 RNA任意引物PCR(RNA arbitrarily primed PCR，RAP PCR)

1.2.5代表性差示分析(Representational Differential Analysis，RDA)

1.2.6 DNA微阵列技术(DNA microarray)

1.2.7基因表达系列分析技术(SAGE)

1.2.8抑制消减杂交技术(SSH)

第二章 材料和方法

2.1材料

2.1.1主要酶类及试剂

2.1.2主要仪器

2.1.3牛精液样品及组织样品来源

2.2方法

2.2.1引物设计

2.2.2试剂的配制

2.2.3传统TRIzol法提取牛组织RNA

2.2.4精液样本计数、体细胞的去除及洗涤

2.2.5传统TRIzol法和热TRIzol法对精子细胞裂解效果比较

2.2.6热Trizol法提取牛精子RNA

2.2.7总RNA中基因组DNA污染的去除

2.2.8精子总RNA的琼脂糖凝胶电泳检测分析

2.2.9精子总RNA定量分析

2.2.10精子总RNA完整性、基因组DNA污染和体细胞污染的检测

2.2.11 cDNA第一条链的合成

2.2.12色谱柱纯化

2.2.13 LD PCR扩增cDNA

2.2.14 Super Smart扩增产物的酚仿抽提

2.2.15RsaI酶切

2.2.16接头的连接

2.2.17第一轮杂交

2.2.18第二轮杂交

2.2.19PCR扩增

2.2.20消减cDNA文库的构建

2.2.21阳性克隆的挑选与PCR扩增验证

2.2.22cDNA文库的测序、序列分析

第三章 结果与分析

3.1精子洗涤结果

3.2传统TRIzol法和热TRIzol法对精子细胞裂解的结果

3.3热Trizol法提取精子RNA结果

3.4精子总RNA的定量结果

3.5精子总RNA完整性、体细胞污染和DNA污染检测结果

3.6 LD PCR优化图谱结果

3.7 RsaI酶切结果

3.8经过两轮杂交后二次PCR效果检测

3.8消减cDNA文库构建及菌体PCR检测结果

3.9消减文库的测序及分析结果

第四章 讨论与结论

4.1精子总RNA提取相关讨论分析

4.2 super smart技术对精子RNA扩增的分析

4.3测序结果的分析

4.4结论

参考文献

致 谢

作者简历

附录