用柑橘皮制备抗真菌果胶低聚糖的方法及其应用和柑橘保鲜方法

摘要

本发明公开了一种用柑橘皮制备抗真菌果胶低聚糖的方法，包括原料预处理果胶的提取和酶法水解果胶，酶法水解果胶的最佳条件为：用pH4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液配制质量浓度为1.0-1.1％的果胶溶液，加入果胶酶P21，果胶酶的加入量为1.0-1.1U/mL，40-50℃水浴搅拌反应20-50min，然后再在沸水浴中灭酶活5-15min。本发明的制备方法制得的果胶低聚糖主要为二糖和三糖，得率大于52％。具有明显的抗真菌效果。对常见的四种病原真菌具有良好的抑制作用。将本发明的果胶低聚糖配成低聚糖复合膜液，用于柑橘保鲜中，有助于延长柑橘果实贮藏时间，为进一步利用果胶低聚糖奠定基础。提高柑橘的附加值，还能减少环境的污染，做到取之于柑橘用之于柑橘。

说明书

技术领域

本发明涉及一种果胶低聚糖的制备方法，特别涉及一种用柑橘皮制备抗真 菌果胶低聚糖的方法，本发明还涉及该果胶低聚糖的应用和柑橘保鲜方法。

背景技术

随着人们生活水平的不断提高，食品安全意识也日益增强，天然安全的食 品保鲜剂将会受到更多消费者的青睐。

我国柑橘产量逐年增加，作为生产柑橘汁副产物的柑橘渣利用便成为一个 极具开发潜力的课题。每年有大量的柑橘皮渣亟待处理。作为一种高附加值产 品，果胶低聚糖是开发利用柑橘皮渣的有效途径之一，然而，其深加工工艺在 国内却鲜有报道。关于用柑橘皮制备的果胶低聚糖的抗真菌效果目前也没有报 道。

发明内容

针对现有的问题，本发明的目的在于提供一种用柑橘皮制备抗真菌果胶低 聚糖的方法。本发明的第二目的在于提供该种果胶低聚糖的应用，第三目的在 于提供柑橘保鲜的方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：一种用柑橘皮制备抗真菌果胶低 聚糖的方法，其特征在于：按照如下步骤完成：

(1)原料预处理

选择无霉变柑橘皮，摘除桔梗，清水冲洗干净，加水浸泡以软化组织，然后 破碎，在沸水中煮沸5-8min灭酶活，沥干，用乙醇快速洗涤晾干，将所得滤渣 水洗除醇，然后烘干得到柑橘皮渣粉；

(2)果胶的提取

将上述柑橘皮渣粉放入容器中，加入蒸馏水充分搅拌，并在90-100℃条件下 加热搅拌提取果胶，提取液经离心回收上清液，残渣再重复提取，合并上清液， 浓缩至上清液体积的七分之一到五分之一，然后加入乙醇，沉淀，离心后回收 沉淀物，沉淀物再加入无水乙醇进一步脱水，离心，回收沉淀物，沉淀物再用 丙酮洗脱，抽滤，将沉淀干燥粉碎，得到果胶粉；

(3)酶法水解果胶

用pH4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液配制质量浓度为1.0-1.1％的果胶溶液，加入 果胶酶P21，果胶酶的加入量为1.0-1.1U/mL，40-50℃水浴搅拌反应20-50min， 然后再在沸水浴中灭酶活5-15min，冷却后先用纱布过滤，然后抽滤，滤液离 心，取上清液于65-75℃、真空度0.1Mpa下旋蒸至原体积的五分之一到三分之 一，再离心，取上清液于65-75℃、真空度0.1Mpa下旋蒸至原体积的九分之一 到七分之一，加入乙醇在1-6℃静置沉淀去除醇不溶性的未水解果胶大分子，离 心取上清液，再加入乙醇沉淀去除醇不溶性的盐分，离心取上清液，最后旋蒸， 干燥得到白色针状产品。

在上述方案中：步骤(1)中，柑橘皮破碎至3-5mm，烘干在60℃条件下烘 干。有利于果胶的提取。

在上述方案中：步骤(2)中，在提取果胶时，加入的蒸馏水的体积为橘皮 渣粉的体积的10倍，在沉淀时，加入的乙醇的量为浓缩后浓缩液体积的2倍。 有利于果胶的提取。

在上述方案中：步骤(3)中，在第一次加入乙醇沉淀时，乙醇的量为浓缩 液的体积的一半；在第二次加入乙醇沉淀时，乙醇的量为浓缩液体积的90％。 更有利于杂质的去除。

本发明发明人通过实验比较酶的种类和用量、酶解时间、pH、反应温度等条 件对果胶低聚糖聚合度及得率的影响，得到了本发明的用柑橘皮制备果胶低聚 糖的最佳条件，使得果胶低聚糖的得率大于52％，并且主要为二糖和三糖，具 有抗病原真菌的效果。

本发明的第二目的是这样实现的：权利要求1-4任一项所制得的抗真菌果胶 低聚糖在抗真菌方面的应用。

在上述方案中：所述真菌为胶胞炭疽杆菌、柑橘链格孢霉菌、指状青霉和意 大利青霉。

其抑菌原理

1破坏细胞壁和细胞膜

该果胶低聚糖作用于菌体后，直接而迅速破细胞壁和细胞膜体系的完整 性从而影响细胞及细胞器的能量代谢以及对物质的选择透性，阻止营养物质以 及代谢产物正常穿过细胞膜，使微生物失去营养而致其生长停滞，达到抑菌抗 菌的目的。

2破坏蛋白质和遗传物质结构

该果胶低聚糖通过破坏细胞膜后，与细胞内的极性物质结合，阻止蛋白质的 合成，使DNA无法复制，通过改变遗传物质或遗传因子的合成来影响微生物 体内酶或功能性蛋白的活性，从而抑制其生长。

3抑制呼吸作用

该果胶低聚糖还能够通过抑制致病菌的呼吸作用，使代谢活动受阻，不能维 持正常的动态膜结构，导致细胞自溶。

本发明的第三目的是这样实现的：将权利要求1-4任一项所得到的抗真菌果 胶低聚糖与壳聚糖配制成低聚糖复合膜液，用蒸馏水清洗柑橘，沥干，然后将 柑橘放入该低聚糖复合膜液中浸涂，取出即可。

优选的：在低聚糖复合膜液中，壳聚糖的质量浓度为1.26％，果胶低聚糖的 质量浓度为2％。柑橘在低聚糖复合膜液中浸涂后，在其表面形成一层保护膜， 能有效阻止微生物的浸入，起到保鲜的作用，延长贮藏时间。

本发明的有益效果是：本发明的制备方法制得的果胶低聚糖主要为二糖和三 糖，得率大于52％。具有明显的抗真菌效果。对柑橘常见的四种病原真菌具有 良好的抑制作用。将本发明的果胶低聚糖配成低聚糖复合膜液，用于柑橘保鲜 中，有助于延长柑橘果实贮藏时间，为进一步利用果胶低聚糖奠定基础。提高 柑橘的附加值，还能减少环境的污染，做到取之于柑橘用之于柑橘。

附图说明

图1为实施例2中在对照组和浓度分别为0.5％、1.0％的果胶低聚糖条件下柑橘 常见四中病原真菌的菌落生长状况图。

图2为不同浓度的果胶低聚糖对四种病原真菌的抑制效果。

图3为果胶低聚糖对温州蜜柑贮藏过程中的抗菌效果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的描述：

实施例1

用柑橘皮制备抗真菌果胶低聚糖的方法，按照如下步骤完成：

1、原料预处理

选择无霉变柑橘皮，摘除桔梗，清水冲洗干净，加水浸泡以软化组织，然后 破碎至3-5mm，在100℃沸水中煮沸5-8min灭酶活，沥干，用少量乙醇快速洗 涤晾干，将所得滤渣水洗除醇，然后在60℃下烘干得到柑橘皮渣粉。

2、果胶的提取

将上述柑橘皮渣粉放入容器中，加入10倍于其体积的蒸馏水充分搅拌，并在 90-100℃条件下加热搅拌提取果胶1h，提取液经离心(4200r/min)回收上清液， 残渣再重复提取3-4次，合并每次上清液，浓缩上清液体积的七分之一到五分之 一，然后加入2倍于浓缩液体积的95％的乙醇，在4℃下沉淀过夜，离心后回 收沉淀物，沉淀物再加入2倍于其体积的无水乙醇进一步脱水，离心，回收沉 淀物，沉淀物再用2倍于其体积的丙酮洗脱，抽滤，将滤渣在通风处常温干燥 粉碎得到果胶粉。

3、酶法水解果胶

用pH4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液配制质量浓度为1.0-1.1％的果胶溶液，加入 果胶酶P21，果胶酶的加入量为1.0-1.1U/mL，40-50℃水浴搅拌反应20-50min， 然后再在沸水浴中灭酶活5-15min，冷却后先用纱布过滤，然后布氏漏斗抽滤， 滤液离心(4200r/min，15min)，取上清液于65-75℃、真空度0.1Mpa下旋蒸至 原体积的五分之一到三分之一，再离心(4200r/min，15min)，取上清液于65-75 ℃、真空度0.1Mpa下旋蒸至原体积的九分之一到七分之一，加入浓缩液体积一 半的乙醇在1-6℃静置沉淀去除醇不溶性的未水解果胶大分子，离心(4200r/min， 15min)取上清液，再加入浓缩液体积的90％的乙醇沉淀去除醇不溶性的盐分， 离心(4200r/min，15min)取上清液，最后65℃旋蒸，真空干燥得到白色针状 产品。得率52％，主要为二糖和三糖。

实施例2

抑制真菌试验

配制马铃薯(PDA)培养基(培养霉菌)，高压灭菌(121℃,30min)。试验组 的平板培养基(Φ9mm)中加入不同浓度的果胶低聚糖(0.5％、1％)，对照组不加 果胶低聚糖，然后均接种上不同菌种(柑橘炭疽杆菌、柑橘链格孢霉菌、指状 青霉和意大利青霉)的菌饼。每个处理对各菌种做3个平行试验，倒置培养， 霉菌于28℃恒温培养箱内培养40h，取出测量试验组和对照组菌丝直径并记录， 最后算出抑菌率。

抑菌效果评价方法

实验得出，所得的果胶低聚糖在浓度仅为1％时能完全抑制柑橘炭疽杆菌、 柑橘链格孢霉菌、指状青霉和意大利青霉四种柑橘采后真菌病原菌的生长。结 果见图1和2。

实施例3

柑橘果实贮藏实验

用蒸馏水清洗柑橘，随机分成4组，处理方法见表1。1组为对照组，在 蒸馏水中浸泡5min后用电风扇吹干。2组用四种柑橘真菌孢子悬浮液(胶胞 炭疽杆菌、链格孢霉菌、指状青霉菌和意大利青霉菌)浸泡5min后用电风扇 吹干。3组在壳聚糖膜液(配比为壳聚糖1％)中浸涂15s后用电风扇吹干然 后分别接上四种菌液。4组在低聚糖复合膜液(配比为壳聚糖1.26％，果胶低聚 糖2％)中浸涂15s后用电风扇吹干然后分别接上四种菌液。然后置于常温下 贮藏，每隔5d进行一次取样分析。

表1柑橘果实抗菌贮藏实验

图3中的初步实验结果显示，15d后对照组和菌液处理组有明显的菌落生 长，3组的柑橘也被微生物所浸染，而试验组(4组)果实依然没有微生物侵染。 然后继续放置，实验组(4组)在两个月后依然没有被微生物浸染。

实施例4

柑橘储藏方法：

将实施例1得到的抗真菌果胶低聚糖与壳聚糖配制成低聚糖复合膜液，在低 聚糖复合膜液中，壳聚糖的质量浓度为1.26％，果胶低聚糖的质量浓度为2％。 用蒸馏水清洗柑橘，沥干，然后将柑橘放入该低聚糖复合膜液中浸涂，取出即 可储藏。

本发明不局限于上述实施例，应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性 劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技 术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实 验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。