一种基于分子调控的鲜切莲藕褐变控制方法

摘要

本发明公开了一种基于分子调控的鲜切莲藕褐变控制方法，所述基于分子调控的鲜切莲藕褐变控制方法筛选出介导鲜切莲藕褐变的关键PAL、POD和PPO，进一步通过早期的基因表达分析对鲜切莲藕褐变控制技术的效果进行评价，对大批量应用于鲜切莲藕褐变控制技术方法的快速筛选。本发明个人据不同的褐变控制技术处理鲜切莲藕，提取相应的RNA，设计与鲜切莲藕褐变度相关性高的PAL，POD和PPO基因表达分析引物，分析上述PAL，POD和PPO基因在各样品中的表达量，进一步评价不同褐变控制技术对鲜切莲藕的效果，方法简单，操作方便。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种基于分子调控的鲜切莲藕褐 变控制方法。

背景技术

莲藕是我国栽培最广、销售量和销售范围最大的水生蔬菜。鲜切莲藕在贮 藏过程中肉质极易发生褐变，直接影响莲藕的感官品质和内在质量，影响产品 销售和出口。国内研究者较多关注莲藕采后褐变机制的生理机制以及防褐变的 方法研究，研究表明莲藕的褐变主要是酶促褐变的参与，目前报道与酶促褐变 有关的酶主要包括：苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶 (PPO)。PAL是苯丙烷类物质代谢途径中重要的酶之一，催化L-苯丙氨酸解氨生 成反式肉桂酸，再经过一系列转变形成各种酚、木质素、花青素、生物碱等， 形成的酚为褐变反应提供底物。许传俊等研究发现蝴蝶兰叶片外植体褐变过程 中PAL基因的表达变化与其褐变进程相一致。李正国等研究发现奉节脐橙PAL2 基因表达与果皮褐变有着密切相关性。POD是广泛存在于植物的铁卟啉金属有 机催化剂，POD在H₂O₂存在的情况下，能将酚类物质和类黄酮氧化聚合而形成 褐色物质引起褐变，蒋益虹等研究发现百合在贮藏过程中POD活性与褐变度呈 正相关，且POD活性变化是引起百合褐变的主要因素。PPO是果蔬褐变最重要 的酚酶。许多植物PPO基因相继被克隆。番茄中克隆得到7个多酚氧化酶基因， 马铃薯中存在7个多酚氧化酶基因。而关于莲藕褐变的分子生物学机制甚少， 莲藕中关于PPO的报道为仅克隆到7个cDNA片段和1个cDNA全长。PAL,POD 和PPO参与其褐变的分子生物学机制涉及较少。

鲜切莲藕褐变控制方法一直是科学研究者关注的热点，然而常规的鲜切莲 藕褐变控制方法评价方法都是基于常规的生理生化指标分析，往往存在耗时耗 人力且相对滞后的缺点，而基于分子调控的鲜切莲藕褐变控制方法，技术简单 且使用性广泛，特别适用于大批量的技术效果评价，同时适用于其他果蔬品质 控制技术评价。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于分子调控的鲜切莲藕褐变技术评价方法， 旨在解决常规的鲜切莲藕褐变控制方法评价方法存在耗时耗人力且相对滞后的 缺点；基于分子调控的鲜切莲藕褐变控制方法技术简单的问题。

本发明是这样实现的，一种基于分子调控的鲜切莲藕褐变控制方法，所述 基于分子调控的鲜切莲藕褐变控制方法筛选出介导鲜切莲藕褐变的关键PAL、 POD和PPO，利用该基因进一步通过早期的基因表达分析对鲜切莲藕褐变控制 技术的效果进行评价，对大批量应用于鲜切莲藕褐变控制技术方法的快速筛选。 该技术同时可应用于其他鲜切果蔬的褐变控制技术评价与筛选，效率高，周期 短，操作简单。

进一步，所述基于分子调控的鲜切莲藕褐变控制方法包括以下步骤：

步骤一，明确不同温度对鲜切莲藕褐变影响：通过褐变度和色差结合感官 分析明确4℃，10℃，15℃，20℃对鲜切莲藕褐变的影响，褐变最严重和褐变最 轻的用于后面的RNA-seq；

步骤二，明确介导鲜切莲藕褐变的相关基因PAL、POD和PPO基因，基于 选择不同温度处理下褐变程度不一致的两个样品用于RNA-seq测序，基于测序 结果分析褐变相关基因PAL、POD和PPO表达量与褐变程度相关性，挑选出与 鲜切莲藕褐变相关性高的关键基因，用于后期的鲜切莲藕褐变控制技术评价中；

步骤三，基于筛选出来的与鲜切莲藕褐变度相关性高的PAL、POD和PPO 基因用于后期其他鲜切莲藕褐变控制技术的效果评价中，设计与鲜切莲藕褐变 度相关性高的PAL、POD和PPO基因表达分析引物，提取不同的褐变控制技术 作用于鲜切莲藕样品RNA，分析上述PAL、POD和PPO基因表达，进一步评 价不同的褐变控制技术对鲜切莲藕的效果。

进一步，所述明确不同温度对鲜切莲藕褐变影响方法为：结合鲜切莲藕在 不同温度贮藏下褐变度和色差分析感官评价不同温度对鲜切莲藕褐变的影响， 其中褐变度的测定方法为取样品研磨碎，取0.5g放入10ml离心管，并用移液 枪取5ml蒸馏水注入离心管放入冰上；使用匀浆机在4000r/min转速下均质2 min；离心机10000r/min转速下离心2min；取4ml上清液于10ml离心管，使 用分光光度仪在波长410nm条件下测吸光值，褐变度用A410*10表示，每一组 做3次平行。

进一步，所述明确介导鲜切莲藕褐变的相关基因PAL、POD和PPO基因采 用了RNA-seq的方法来筛选参与鲜切莲藕褐变的相关基因PAL、POD和PPO， 进一步基于RNA-seq分析褐变相关基因PAL、POD和PPO表达量与褐变程度 相关性。

进一步，所述基于筛选出来的与鲜切莲藕褐变度相关性高的PAL、POD和 PPO基因用于后期其他鲜切莲藕褐变控制技术的效果评价中，应用Bio-Rad的 iQ5仪器完成。采用20μl体系：其中10μl2×SsofastEvaGreenSupermix，1.0 μl上游引物(10μM)，1.0μl下游引物(10μM)，2.0μl稀释的cDNA和6.0μl H₂O。PCR反应程序为：94℃，10min；45个循环的94℃10s和60℃30s。

本发明的另一目的在于提供一种使用所述基于分子调控的鲜切莲藕褐变控 制方法实现鲜切苹果品质控制方法筛选。

本发明的另一目的在于提供一种使用所述基于分子调控的鲜切莲藕褐变控 制方法实现鲜切山药品质控制方法筛选。

本发明的另一目的在于提供一种使用所述基于分子调控的鲜切莲藕褐变控 制方法实现鲜切山药品质控制技术评价与筛选。

本发明的另一目的在于提供一种使用所述基于分子调控的鲜切莲藕褐变控 制方法实现鲜切豆角品质控制技术评价与筛选

本发明提供的基于分子调控的鲜切莲藕褐变控制方法技术简单且使用性广 泛，特别适用于大批量的技术效果评价，同时适用于其他果蔬品质控制技术评 价与筛选。

附图说明

图1是本发明实施例提供的基于分子调控的鲜切莲藕褐变控制方法流程图。

图2是本发明实施例提供的不同温度下鲜切莲藕褐变度变化示意图。

图3是本发明实施例提供的不同温度下鲜切莲藕色差变化示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例， 对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以 解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明基于RNA-Seq技术，筛选出介导鲜切莲藕褐变的关键PAL、POD和 PPO，进一步通过早期的基因表达分析对鲜切莲藕褐变控制技术的效果进行评 价。本方法同时适用于其他果蔬品质控制技术评价。

下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。

如图1所示，本发明实施例的基于分子调控的鲜切莲藕褐变控制方法包括 以下步骤：

S101：明确不同温度对鲜切莲藕褐变影响：通过褐变度和色差结合感官分 析明确不同温度(4℃，10℃，15℃，20℃)对鲜切莲藕褐变的影响，褐变最严 重和褐变最轻的用于后面的RNA-seq；

S102：明确介导鲜切莲藕褐变的相关基因PAL、POD和PPO基因，基于选 择不同温度处理下褐变程度不一致的两个样品用于RNA-seq测序，基于测序结 果分析褐变相关基因PAL、POD和PPO表达量与褐变程度相关性，挑选出与鲜 切莲藕褐变相关性高的关键基因，用于后期的鲜切莲藕褐变控制技术评价中；

S103：基于筛选出来的与鲜切莲藕褐变度相关性高的PAL、POD和PPO基 因用于后期其他鲜切莲藕褐变控制技术的效果评价中，设计与鲜切莲藕褐变度 相关性高的PAL、POD和PPO基因表达分析引物，提取不同的褐变控制技术作 用于鲜切莲藕样品RNA，分析上述PAL、POD和PPO基因表达，进一步评价 不同的褐变控制技术对鲜切莲藕的效果。

所述步骤明确不同温度对鲜切莲藕褐变影响方法为：结合鲜切莲藕在不同 温度贮藏下褐变度和色差分析感官评价不同温度对鲜切莲藕褐变的影响。其中 褐变度的测定方法为取样品将其研磨碎，取0.5g放入10ml离心管，并用移液 枪取5ml蒸馏水注入离心管放入冰上。使用匀浆机在4000r/min转速下均质2 min。离心机10000r/min转速下离心2min。取4ml上清液于10ml离心管，使 用分光光度仪在波长410nm条件下测吸光值，褐变度用A410*10表示，每一组 做3次平行。

所述明确介导鲜切莲藕褐变的相关基因PAL、POD和PPO基因采用了 RNA-seq的方法来筛选参与鲜切莲藕褐变的相关基因PAL、POD和PPO，进一 步基于RNA-seq分析褐变相关基因PAL、POD和PPO表达量与褐变程度相关 性。

所述基于筛选出来的与鲜切莲藕褐变度相关性高的PAL、POD和PPO基因 用于后期其他鲜切莲藕褐变控制技术的效果评价中，应用Bio-Rad的iQ5仪器完 成。采用20μl体系：其中10μl2×SsofastEvaGreenSupermix，1.0μl上游引 物(10μM)，1.0μl下游引物(10μM)，2.0μl稀释的cDNA和6.0μlH₂O。 PCR反应程序为：94℃，10min；45个循环的94℃10s和60℃30s。

下面结合具体实施例对本发明的阴影里作进一步的描述。

实施例1：明确不同温度对鲜切莲藕褐变影响：

步骤一，样品处理：选择新鲜、带泥、大小、形状一致的莲藕清洗去皮， 切成5mm左右的薄片，取约300片置于水中浸泡5min，每个托盘中放入两片 进行托盘包装。实验室处理过后的鲜切藕片迅速放入4、10、15、20℃恒温箱中， 下一步实验用。该部分均在经过2小时处理的臭氧杀菌操作室进行操作。

褐变度测定：取样品将其剪碎，取0.5g放入10ml离心管，并用移液枪取 5ml蒸馏水注入离心管放入冰中。使用匀浆机在4000r/min转速下均质2min。 离心机10000r/min转速下离心2min。取4ml上清液于10ml离心管，使用分 光光度仪在波长410nm条件下测吸光值，褐变度用A410*10表示，每一组做3 次平行。

色差测定：L、a、b色空间是1976年制定的系统，被称为均匀色立体表示 系统。中轴L代表明度轴，上白下黑，中间是不同亮色的灰色过渡。L称为明 度指数，L＝0代表黑色，L＝100代表白色。L值可表示褐变程度，若L值越大， 则代表颜色越白，褐变就越轻。L值代表样品表面的亮度。若样品表面亮度越大， 则L值就越大；反之，样品表面亮度越小，L值就越小。色差测定用用色差仪 进行。首先分光测色仪通过白板进行校正，然后用小孔板进行测定藕片的色差 值，每片3个重复，其中L值取平均值。

步骤二，明确介导鲜切莲藕褐变的相关基因PAL、POD和PPO基因:

选择不同温度处理下褐变程度不一致的两个样品用于RNA-seq测序，基于 测序结果分析褐变相关基因PAL、POD和PPO表达量与褐变程度相关性，挑选 出与鲜切莲藕褐变相关性高的关键基因。

步骤三，基于筛选出来的与鲜切莲藕褐变度相关性高的PAL、POD和PPO 基因用于后期其他鲜切莲藕褐变控制技术的效果评价中:用不同的褐变控制技术 处理鲜切莲藕，提取相应的RNA，设计与鲜切莲藕褐变度相关性高的PAL、POD 和PPO基因表达分析引物，分析上述PAL、POD和PPO基因表达在各样品中 的表达量，进一步评价不同的褐变控制技术对鲜切莲藕的效果。

下面结合实验对本发明的应用效果作详细的说明。

实验1：不同温度处理对鲜切莲藕褐变的影响；

(一)实验方法

样品处理：选择新鲜、带泥、大小、形状一致的莲藕清洗去皮，切成5mm 左右的薄片，取约300片置于水中浸泡5min，每个托盘中放入两片进行托盘包 装。实验室处理过后的鲜切藕片迅速放入4、10、15、20℃恒温箱中，下一步实 验用。该部分均在经过2小时处理的臭氧杀菌操作室进行操作。

褐变度测定：取样品将其剪碎，取0.5g放入10ml离心管，并用移液枪取 5ml蒸馏水注入离心管放入冰中。使用匀浆机在4000r/min转速下均质2min。 离心机10000r/min转速下离心2min。取4ml上清液于10ml离心管，使用分 光光度仪在波长410nm条件下测吸光值，褐变度用A410*10表示，每一组做3 次平行。

色差测定：L、a、b色空间是1976年制定的系统，被称为均匀色立体表示 系统。中轴L代表明度轴，上白下黑，中间是不同亮色的灰色过渡。L称为明 度指数，L＝0代表黑色，L＝100代表白色。L值可表示褐变程度，若L值越大， 则代表颜色越白，褐变就越轻。L值代表样品表面的亮度。若样品表面亮度越大， 则L值就越大；反之，样品表面亮度越小，L值就越小。色差测定用用色差仪 进行。首先分光测色仪通过白板进行校正，然后用小孔板进行测定藕片的色差 值，每片3个重复，其中L值取平均值。

(二)实验结果

实验结果显示不同温度下(4、10、15、20℃)的鲜切莲藕的贮藏结果表明， 在一定温度范围内，贮藏温度越高，莲藕褐变越严重(附图2和附图3)。

实验2：介导鲜切莲藕褐变的相关基因PAL、POD和PPO基因的筛选：

(一)实验方法

选择不同温度处理下褐变程度不一致的两个样品用于RNA-seq测序，基于 测序结果分析褐变相关基因PAL、POD和PPO表达量与褐变程度相关性，挑选 出与鲜切莲藕褐变相关性高的关键基因。

(二)实验结果

选择不同温度处理下褐变程度不一致的样品用于RNA-seq测序，大部分褐 变相关基因PAL、POD和PPO表达量与褐变程度正相关，褐变程度较高的样品 PAL、POD和PPO基因表达较高(表1)。

附表1鲜切莲藕的RNA-Seq数据分析

实验3：基于筛选出来的与鲜切莲藕褐变度相关性高的PAL、POD和PPO 基因用于后期其他鲜切莲藕褐变控制技术的效果评价中

(一)实验方法

用不同的褐变控制技术处理鲜切莲藕，提取相应的RNA，设计与鲜切莲藕 褐变度相关性高的PAL、POD和PPO基因表达分析引物，分析上述PAL、POD 和PPO基因表达在各样品中的表达量，进一步评价不同的褐变控制技术对鲜切 莲藕的效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发 明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明 的保护范围之内。