治疗和预防创伤性脑损伤性神经元损害的组合物和方法

摘要

本申请提供了用于治疗、抑制和预防创伤性脑损伤的方法和化合物。方法包括施用7,8-二羟黄酮及其衍生物。

说明书

政府利益

本发明荣获美国国立卫生研究院资助，资助号NS072631。政府对本发明具有一定 的权利。

背景技术

创伤性脑损伤(TBI)是导致死亡及儿童和年轻人残疾的主要原因(Aitken等,2009； McCarthy等,2006)。TBI诱发脑内(包括海马和皮质区域)的神经元死亡。TBI不仅 能通过直接组织缺损引起原发性损伤(Hall等,2004；Hall等,2005b；Singh等,2006)， 还通过该原发事件在存活的细胞中引发继发性损伤(Faden等,1989；Fujimoto等, 2004b；Hall等,2005b；Marion等,1997)。损伤广泛存在于脑组织中，如大脑皮层和海 马区域，此损伤在人类(Ariza等,2006；Bigler等,1997；Isoniemi等,2006；Tate和Bigler, 2000；Umile等,2002；Wilde等,2007)和实验动物(Bonislawski等,2007；Hall等,2005b； Lowenstein等,1992；Saatman等,2006a)中均可见，且导致认知、感觉以及运动功能的 缺损(Greve和Zink,2009；Hall等,2005b；Singh等,2006)。目前尚未出现FDA批准的 针对TBI后症状的有效治疗。

文献已表明在实验性TBI后会诱发细胞兴奋性毒性，后者导致了损伤后细胞的快 速死亡(Palmer等,1993)。细胞兴奋性毒性可引起细胞凋亡还是坏死取决于起始刺激的 强度和细胞群体的特性(Ankarcrona等,1995；Bonfoco等,1995；Martin等,1998)。在小 鼠TBI模型中，大多数的神经元死亡发生于TBI后24小时内，此后，细胞死亡持续在 一个较低水平至少另外两周(Zhou等,2012)。大部分死亡的细胞并未显示出凋亡的形态 学特征，且凋亡标记只在小部分死亡细胞亚群中为阳性。与之相对，大多数的细胞死 亡为坏死性死亡，此结果提示，中度TBI诱发的主要是快速坏死性细胞死亡。

脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是生长因子家族的 成员之一。它在成年大脑内广泛分布且活跃，包括海马和皮层(Egan等,2003；Huang等, 1999；Hyman等,1991)。BDNF对神经元起多种重要的作用，例如有助于成熟神经元 (Barde,1994；Ghosh等,1994；Lindholm等,1996；Shulga等,2008)和未成熟神经元 (Gao和Chen,2009；Kirschenbaum和Goldman,1995；Liu等,2003)的生存。此外，无论 对成熟啮齿类动物或人类皮层，BDNF都是海马发育过程中最丰富的营养因子 (Maisonpierre等,1990；Timmusk等,1994；Webster等,2002)。若在海马发育阶段敲除 bdnf基因，BDNF表达的减少会加重TBI后的神经元死亡(Gao和Chen,2009)。此结果 说明，BDNF参与调控了神经元的生存，并有望用于保护神经元，使其在TBI后免于 死亡。7,8-二羟黄酮(7,8-dihydroxyflavone，DHF)是一个仿BDNF的小分子，已有研 究表明该小分子能保护野生型神经元免于凋亡(Jang等,2010)。对于啮齿类动物的压力 (Andero等,2012)、抑郁(Liu等,2010)、高龄(Zeng等,2012a；Zeng等,2012b；Zeng等, 2011)和阿尔兹海默病模型(Devi和Ohno,2012)，DHF处理有助于改善其神经功能。

发明内容

在此公开的信息为，DHF减少了TBI后的神经元死亡(坏死性死亡为主)。用DHF 处理TBI小鼠，促进了其BDNF受体——酪氨酸相关激酶B(Tyrosine-related kinase B， TrkB)的磷酸化(Yan等,1997)，同时显著减少了TBI后24小时内海马的神经元死亡 和皮层的组织缺损。另一方面，抑制BDNF信号通路可削弱DHF的神经保护作用。

本发明包括了创伤性脑损伤的治疗方法和组合物。具体而言，在此公开的方法抑 制和/或防止创伤性脑损伤后神经元死亡的方法。在一个实施方案中，治疗TBI的方法 包括对TBI发生后的受试对象给予DHF或其衍生物。DHF或其衍生物也可在临床环 境下给药，其中受试对象在TBI后被带至临床机构。在一个实施方案中，DHF或其衍 生物通过腹腔注射的方式在受试对象的损伤侧给药。

在一个实施方案中，治疗TBI的方法包括预防性给予DHF或其衍生物，由此DHF 或其衍生物在TBI的发生前给药。TBI在一些运动和职业中很常见，比如在橄榄球、 足球、拳击、冰球和武术等运动中，头部损伤时常发生。在许多情况中，TBI是由于 头部的反复撞击引起。因此，一个实施方案包括在运动进行前或者途中将DHF或其衍 生物给予运动员。

在一个实施方案中，本文提供了DHF或其衍生物、或其药学上可接受的盐、酯类、 溶剂化物、互变异构体、光学异构体、包合物、水合物、多晶或前体药物在制备用于 在TBI可能发生之前预防或抑制TBI后的神经元死亡的药物或用于治疗TBI后的受试 对象的药物中的用途。

在一个实施方案中，本文提供了DHF或其衍生物、或其药学上可接受的盐、酯类、 溶剂化物、互变异构体、光学异构体、包合物、水合物、多晶或前体药物，其用于在 TBI可能发生之前预防或抑制TBI后的神经元死亡或用于治疗TBI后的受试对象。

在一个实施方案中，本文提供了用于在TBI可能发生之前预防或抑制TBI后的神 经元死亡或用于治疗TBI后的受试对象的组合物，其包含有效量的DHF或其衍生物、 或其药学上可接受的盐、酯类、溶剂化物、互变异构体、光学异构体、包合物、水合 物、多晶或前体药物。在一个方面，所述组合物为药物组合物或者饮料，比如运动饮 料。

附图说明

图1显示体外DHF保护神经元免于谷氨酸/甘氨酸介导的细胞兴奋性毒性死亡。(a) 明场图显示DMSO处理的对照组细胞。(b)PI染色检测DMSO处理的对照组细胞的 细胞死亡。(c)a图和b图的叠加。(d)明场图显示经谷氨酸和甘氨酸处理诱导细胞兴 奋性毒性的细胞给予DMSO预处理作为对照组。(e)PI染色检测经谷氨酸和甘氨酸 处理和DMSO预处理对照组的细胞死亡。(f)d图和e图的叠加。(g)明场图显示经 谷氨酸和甘氨酸处理诱导细胞兴奋性毒性的细胞给予DHF预处理。(h)PI染色检测经 谷氨酸/甘氨酸处理以及DHF预处理的细胞死亡。(i)g图和h图的叠加。(j)明场显 示未经谷氨酸和甘氨酸处理诱导细胞兴奋性毒性而给予DHF处理的细胞。(k)PI染色 检测未经谷氨酸和甘氨酸处理而用DHF处理的细胞死亡。(l)j图和k图的叠加。(m) DMSO组、谷氨酸/甘氨酸处理组、谷氨酸/甘氨酸/DHF组和DHF组的细胞死亡计数。 (n)对不同浓度的DHF处理的组的细胞死亡计数，以评估DHF的剂量对经谷氨酸/ 甘氨酸诱导细胞兴奋性毒性的细胞保护作用的影响。

图2显示DHF处理减轻了TBI后皮层的损伤。小鼠在TBI造模前接受在DMSO 中的DHF的预处理或接受无DHF的DMSO(作为对照)的预处理。(a)无DHF的 DMSO预处理的损伤中心脑片的焦油紫染色。(b)DHF预处理的损伤中心脑片的焦油 紫染色。(c)损伤侧与对侧皮层的缺损面积比例对照。

图3显示DHF处理减少了TBI后海马的细胞死亡。TBI造模后24小时，脑片经 FJB染色以检测海马内的细胞死亡。(a)假手术组的小鼠脑片，片中可见海马齿状回。 脑片经DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)复染呈蓝色以显示细胞核。(b)TBI造模而不给 予DHF处理的小鼠，FJB染色以检测该组小鼠海马齿状回中的FJB阳性细胞(绿色)。 脑片经DAPI复染呈蓝色以显示细胞核。(c)TBI造模前接受DHF预处理的小鼠，FJB 染色以检测该组小鼠海马齿状回中的FJB阳性细胞(绿色)。脑片经DAPI复染呈蓝色 以显示细胞核。(d)TBI造模前接受DMSO预处理的小鼠，FJB染色以检测该组小鼠 海马齿状回中的FJB阳性细胞(绿色)。脑片经DAPI复染呈蓝色以显示细胞核。(e) 对海马中不同分区的FJB阳性细胞的计数结果。

图4显示DHF处理增加了TBI后海马内新生未成熟神经元的数量。造模后24小 时，用DCX特异性抗体进行免疫染色，以展示小鼠海马齿状回中的新生未成熟神经元。 (a)假手术组小鼠的海马齿状回中的Dcx阳性新生未成熟神经元(红色)。脑片经DAPI 复染呈蓝色以显示细胞核。(b)TBI损伤组小鼠的海马齿状回中的Dcx阳性新生未成 熟神经元(红色)。脑片经DAPI复染呈蓝色以显示细胞核。(c)DHF预处理的TBI 损伤组小鼠的海马齿状回中的Dcx阳性新生未成熟神经元(红色)。脑片经DAPI复染 呈蓝色以显示细胞核。(d)DMSO预处理的TBI损伤组小鼠的海马齿状回中的Dcx阳 性新生未成熟神经元(红色)。脑片经DAPI复染呈蓝色以显示细胞核。

详细说明

定义

术语“联合”指的是把一种或多种治疗性试剂加入DHF或其衍生物中给药，包括同 时给药或以任何顺序相继给药。

术语“7,8-二羟黄酮”或者“DHF”指的是7,8-二羟基-2-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮，其 是下式化合物：

DHF是一种酪氨酸激酶受体B(TrkB)激动剂，它结合该受体的胞外结构域 (Kd＝320nM)，促进受体二聚体化和自磷酸化。

对于处理或治疗的目的，术语“哺乳动物”指的是任何被定义为哺乳动物的动物， 包括人类、家畜、以及动物园、体育类或者宠物类的动物，如犬、马、猫、奶牛等。 优选地，哺乳动物是人类。

术语“处理”或“治疗”是一种用于获得有益或者期望的临床结果的手段。在本文中， 有益或者期望的的临床结果包括(但不仅限于)临床症状的减轻、疾病程度的减轻、 病情的稳定(不恶化)、延迟或减慢病程的发展、改善或缓解疾病状态、以及缓和(部 分或全部)，无论可检测或不可检测。在本文中，“治疗”不包括“防止”、“避免”或“预防”。

术语“化合物”指的是DHF或其衍生物、或药学上可接受的盐、酯类、溶剂化物、 互变异构体、光学异构体、包合物、水合物、多晶或前体药物，同时也包括了其保护 性的衍生物。化合物可以包含一个或多个手性中心和/或双键，因此，以下列形式存在： 立体异构体例如双键异构体(即，几何异构体)、对映异构体或者非对映异构体。根据 本发明，在本文中提到的化学结构，包括本发明的化合物，包括所有相应化合物的对 映体、非对映体和几何异构体，也就是说，无论是立体化学纯的形式(如：几何异构 体纯、对映异构体纯、或非对映异构体纯的形式)和异构体混合物(如：几何异构体、 对映异构体和非对映异构体混合物)。在一些情况下，一种对映异构体、非对映异构体 或几何异构体会比其他异构体具有更好的活性或改善的毒性或动力学特征。在这种情 况下，本发明的化合物的这些对映异构体、非对映异构体和几何异构体则成为优选。

术语“多晶”指的是本问所公开的化合物或其复合物的固体晶体形式。同一种化合 物的不同多晶体可表现出不同的物理、化学和/或光谱性质。不同的物理性质包括(但 不仅限于)稳定性(如：对热或光的稳定性)、可压缩性和密度(在配制和产品制造中 很重要)、以及溶解率(这可影响生物利用度)。稳定性的差异可以由于化学反应性的 变化(如：差异性氧化，使得由一种多晶体形成的剂型比由另一种多晶体形成的剂型 褪色更迅速)或机械特性(如：随着动力学有利的多晶体转变成热力学更稳定的多晶 体，片剂在储存时破碎)或两者(如：单多晶体的片剂更容易在高湿度下破裂)导致。 多晶体的不同物理性质可影响其加工。比如，一种多晶体可能比另一种多晶体更可能 形成溶剂化物，或者更难以过滤、洗涤掉杂质，因为它们颗粒形状或粒度分布不同。

术语“水合物”是指本文所公开的化合物或其盐，其进一步包括化学计量或非化学 计量量的通过非共价分子间力结合的水。

术语“包合物(clathrate)”是指呈晶格形式的本文公开的化合物或其盐，所述晶格 包含空间(例如，通道)，在其中具有捕获的客体分子(例如，溶剂或水)。

术语“前体药物”是指本发明的化合物的药物分子，其是无生物学活性的直到被代 谢过程激活。前体药物包括化合物的衍生物，其可在生物条件下(体外或体内)水解、 氧化或以其他方式反应以提供本发明的化合物。前体药物经在生物条件下进行所述反 应后可具有活性，或者它们以其未反应形式存在时可具有活性。可用于本发明的前体 药物的实例包括(但不限于)本文所公开的化合物的类似物或衍生物，其包含可生物 水解部分，如可生物水解酰胺、可生物水解的酯、可生物水解的氨基甲酸酯、可生物 水解的碳酸酯、可生物水解的酰脲和可生物水解的磷酸盐类似物。前体药物的其它实 例包括本文所公开的化合物的含有--NO、--NO₂，--ONO或--ONO₂部分的衍生物。前 体药物通常可以使用众所周知的方法制备。

术语“TBI高发场景”是指其中创伤性脑损伤可能发生的事件、情形或意外。运动是 一个TBI高发场景。举个例子，TBI高发于足球运动中的头部碰撞。运动包括比赛和 练习。另一种TBI高发场景为军事行动。还有一个高发场景常见于老人，原因通常为 步态不稳。

创伤性脑损伤

在最基本的定义中，创伤性脑损伤(TBI)简而言之是由于外伤对大脑造成损伤。 TBI分成穿透性伤和非穿透性伤。非穿透性伤可包括头部受到冲击，从而导致脑在颅 骨中一次或多次撞击而损伤。下列因素可造成头部冲击：摔倒(如摔下楼梯，老人在 浴室中滑倒)、车祸撞击、运动撞击(橄榄球、足球(例如争顶)、冰球(例如推挡)、 拳击、武术、曲棍球、滑板运动等)和军事行动(如爆破、肉搏等)。

TBI导致的损伤可从轻度到重度。轻度的损伤只造成细胞暂时性的功能紊乱。然 而重度的损伤则会导致组织撕裂、出血和神经元死亡。起初，TBI造成的细胞死亡发 生于大脑皮层，随后发生于海马(Fujimoto等,2004a；Hall等,2005a；Saatman等, 2006b)。这种细胞死亡(包括神经元死亡)是坏死性死亡。TBI后的死亡细胞显著表现 出坏死的标记物而非凋亡的标记物。TBI和神经元死亡会导致认知障碍(如学习、记 忆等)、感觉障碍(如视觉、手眼协调等)、交流障碍(如构音障碍、失语等)以及行 为/情绪失调(如抑郁、焦虑、易怒等)。

DHF的给药方法

在一个实施方案中，治疗TBI的方法包括将DHF或其衍生物在TBI发生后给药。 DHF或其衍生物可在医疗机构中给药，其中受试对象遭遇TBI后被带至医疗机构。在 一个实施方案中，DHF或其衍生物也可在受伤地点给药。受伤地点可为家中、商业现 场、比赛现场或者战场。

在一个实施方案中，治疗TBI的方法包括预防性施用DHF或其衍生物，由此DHF 或其衍生物在TBI的发生前给药。TBI在一些运动和职业中可能发生。比如，在橄榄 球、足球、拳击、冰球和武术等运动中，头部损伤时常发生。在许多情况下，TBI是 由于头部的反复撞击所引起。因此，在一个实施方案中，DHF或其衍生物在头部损伤 可能发生的比赛或者练习之前给运动员给药。同样，军队服役人员在最近的冲突中频 繁暴露于爆炸装置之下。步兵可在巡逻、护航或任何其他军事行动前接受DHF或其衍 生物给药。

除此之外，DHF或其衍生物还可与一种或多种其它化合物联合或交替给药。TBI， 特别是钝性外伤，会产生炎症反应。在一个实施方式中，DHF或其衍生物可与利尿剂 联合给药，该利尿剂被施用来降低颅内压。利尿剂包括(但不仅限于)呋塞咪、氢氯 噻嗪、美托拉宗、依普利酮等。损伤后最初的几个星期，中度和重度TBI的患者癫痫 发作的风险增高。在一个实施方式中，DHF或其衍生物可与抗癫痫药物联合使用。抗 癫痫药物的实例包括(但不仅限于)加巴喷丁、卡马西平、苯妥英、奥卡西平、双丙 戊酸钠、氯硝西泮、托吡酯和丙戊酸。

可药用盐

在化合物具有足够的酸碱度以形成稳定、无毒的酸性盐或碱性盐的情况下，化合 物可适合作为可药用盐施用。可药用盐包括源自可药用的无机或有机碱和酸的那些盐。 合适的盐包括由碱金属如钾和钠、碱土金属如钙和镁，以及其他药物领域众所周知的 酸衍生物。特别是，可药用盐的实例是与酸形成的有机酸加成盐，形成生理上可接受 的阴离子，比如：甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、丙二酸盐、酒石酸盐、 琥珀酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐、α-酮戊二酸和α-甘油磷酸盐。也可以形成合适的 无机盐，包括硫酸盐、硝酸盐、碳酸氢盐和碳酸盐。

可药用盐可通过标准的、公知的制备方法获得，例如通过将足够碱性的化合物(例 如胺)与合适的酸反应，形成生理上可接受的阴离子。还可以制备羧酸的碱金属(例 如，钠、钾或锂)或碱土金属(例如钙)盐。

组合物

基于DHF或可药用盐的组合物可以以对于本文描述的任何指征而言治疗有效量与 药学可接受的添加剂、以任何载体或赋形剂联合制备。治疗有效量可根据待治疗的病 症、其严重程度、所采取的治疗方案、药剂的药代动力学以及患者个体情况而变化。

一方面，DHF被优选于与可药用载体制成混合物。在一般情况下，优选以可口服 给药的形式施用药物组合物，但制剂也可以通过肠胃外、静脉内、肌肉内、经皮、口 腔、皮下、栓剂或其它途径给药。静脉内和肌内制剂优选在无菌盐水中给药。在不会 使本发明的组合物不稳定或影响其治疗活性的情况下，本领域普通技术人员可在本说 明书的教导下调整制剂以提供用于具体施用途径的多种制剂。更具体来说，例如，对 期望的化合物进行调整以使其在水中或其他赋形剂中更稳定，可以通过常规调整(盐 配方、酯化等)而简单实现。

包含在药学活性制剂中的化合物的量是用于治疗TBI中的神经元死亡的有效量。 在一般情况下，本发明化合物在药物剂型中的治疗有效量通常为约0.1mg/kg至约 100mg/kg或更高，取决于所使用的化合物、创伤性脑损伤的程度、以及给药途径。对 于本发明目的，根据本发明的组合物的预防或防止有效量落入上述对于治疗有效量所 描述的相同范围内并通常与上述有效量相同。

DHF或其衍生物的施用可以为连续(静脉点滴)至每天若干次口服给药(例如， QID，BID，等)，并且可以包括口服，局部，肠胃外，肌内，静脉内，皮下，经皮(其 可以包括渗透增强剂)，口腔和栓剂给药以及其他给药途径。肠溶口服片剂也可以用于 增强通过口服途径给药的化合物的生物利用度和稳定性。最有效的剂型将取决于所选 择的特定试剂的药物动力学，以及患者中创伤性脑损伤的严重程度。口服剂型是特别 优选的，因为易于给药和利于患者依从性。

为治疗根据本发明的药物组合物，优选将治疗有效量的一种或多种本发明的化合 物与可药用的载体按照常规的定量药物混配技术进行混合。载体可以采取多种形式， 这取决于给药所需的制剂形式，例如，口服或肠胃外给药。在制备口服剂型的药物组 合物时，任何常用的药物介质都可以使用。因此，对于液体口服制剂如混悬剂、酏剂 和溶液，合适的载体和添加剂包括水、二醇、油、醇、调味剂、防腐剂、着色剂和类 似物可被使用。对于固体口服制剂如散剂、片剂、胶囊，以及固体剂型如栓剂，适合 的载体和添加剂包括淀粉，糖载体如葡萄糖、甘露醇、乳糖和相关载体，稀释剂，成 粒剂，润滑剂，粘合剂，崩解剂和类似物可被使用。如果需要的话，片剂或胶囊可以 通过标准技术进行肠溶包衣用于缓释。使用这些剂型可显著影响在患者中化合物的生 物利用度。

对于肠胃外制剂而言，载体通常包括无菌水或氯化钠水溶液，尽管其它成分，包 括那些分散助剂，也可以被包括在内。当将使用无菌水或保持无菌水的无菌状态时， 所述组合物和载体也必须灭菌。也可被制备成注射用悬浮液，在这种情况下，适当的 液体载体、悬浮剂等也可使用。

在实施方案中，化合物和组合物用于治疗、预防或延缓TBI相关的神经元死亡。 优选地，为治疗、预防或延缓神经元死亡，组合物以口服剂型以下列的量给药：约250 微克至约1克或更多，至少每天一次，或一天达四次。化合物优选口服给药，但也可 以以肠胃外给药、局部给药或栓剂等形式。

在一个实施方案中，DHF或其衍生物可以配制成饮料的一部分，包括运动饮料(例 如，)、能量饮料(如，红牛Red)、营养饮料(例如，)或任 何类型的补充或添加维生素、电解质和类似物的饮料。这种饮料可以帮助预防或抑制 由于运动伤害、军事或其他事件造成的TBI导致的神经元死亡。实施方案包括在TBI 高发场合之前、之后或期间使受试对象引用或向其给予包含DHF或其衍生物的饮料。

实施例

实施例1：DHF在体外实验中可从细胞兴奋性毒性中保护神经元。

这个实施例是为了检测DHF在细胞兴奋性毒性损伤中的神经保护作用，以及在体 外细胞中的最佳剂量。

海马细胞培养和体外TBI造模。对C57BL/6小鼠(出生后当天(P0))的脑子进行 解剖，去除脑膜，分离出海马。海马组织用木瓜蛋白酶消化，单细胞被收集、平铺与 赖氨酸预处理的盖玻片上，用B27Neurobasal^TM无血清培养基(Brewer等,1993)培养。 为了模仿体内创伤，离体5天的细胞(DIV5)给予100μM的谷氨酸与20μM甘氨酸处 理，一组细胞给予同体积DMSO作为对照，处理时间为60分钟，然后静置24小时。

DHF处理。在谷氨酸和甘氨酸处理前30分钟，给予细胞DHF(溶于DMSO，终 浓度为500nM)处理，或者给予DMSO处理作为对照。

碘化吡啶(PI)染色和细胞计数。处理后，细胞与PI(10μg/mL)孵育24小时。 在37℃潮湿孵箱中30分钟后，用PBS洗涤，然后用2％的多聚甲醛固定。固定后的细 胞用相差或荧光显微镜观察。每个玻片随机选取5个视野，用连接相机的倒置显微镜 分别采集20倍下明场和PI染色的图像，倒置显微镜为配备Apotome的Zeiss Axiovert 200M，相机为Zeiss Axio Cam MRc5，所用软件为AxioVision,v4.0。所采集的照片用 Photoshop 7.0整合和标记。每个实验组取三张玻片，对其上的PI染色阳性细胞计数并 计算出PI阳性细胞的比例。

统计分析。所有数据以平均值±标准误描述，其后附上每组的样本数。数据用 Student’s t检验或者One-way ANOVA分析。

结果

为了评估DHF在谷氨酸/甘氨酸诱导损伤下对神经元存活的影响，DHF(溶于 DMSO，浓度为500nM)和DMSO在损伤前30分钟注入细胞。损伤后24小时，进行 PI染色来检测死亡细胞。在空白对照组中(只给了DMSO)，6.45％±1.06％的神经元 被PI标记(图1a-c,m)。谷氨酸/甘氨酸造成了大量的神经元死亡(46.92％±2.53％, P＝0.0001vs.空白对照组)(图1d-f和m)。DHF处理显著减少了PI阳性细胞，使其只 有20.15％±1.09％，暗示着DHF有效地在谷氨酸/甘氨酸诱导的细胞死亡中保护了57.05％ 的神经元(图1g-I和m)。对未经谷氨酸/甘氨酸处理的健康细胞，短时间的DHF处理 并没有影响细胞死亡(6.56％±1.28％)(图1j-l和m)。这些结果表明，在体外实验中， DHF可以从谷氨酸/甘氨酸所引导的细胞死亡中保护神经元。

为了检测DHF神经保护的最佳剂量，DIV5的神经元与不同浓度的DHF一起孵育 (0-5000nM，图1n)，时间点为谷氨酸/甘氨酸处理前的30分钟。处理后24小时，进 行PI染色检测死亡细胞。没有DHF处理的组，有46.92％±2.53％的神经元为PI染色 阳性。即使在低浓度的DHF(10nM)处理组中，细胞死亡都被降至了37.11％±1.33％， 说明DHF在低浓度下就表现出了神经保护作用。随着DHF浓度的增加，神经保护作 用也随之增强。DHF浓度为100nM的时候，谷氨酸/甘氨酸所诱导的细胞死亡已经降 至23.13％±3.28％，DHF为500nM时，细胞死亡率降至17.05％±1.96％。然而，在500nM 的浓度，神经保护效果到达了顶峰，当浓度继续上升至1.0μM时，细胞死亡率为14.26％ ±1.52％，浓度上升至5.0μM时，细胞死亡率为12.72％±0.57％。在500nM以上，细 胞死亡率并没有因为DHF的浓度上升而显著性下降，因此，DHF对体外细胞的神经保 护作用的最佳浓度为500nM。

另一方面，在高浓度(5.0μM，10倍于最佳浓度)的DHF处理下，神经元表现出 健康的形态：胞体为圆形，附件良好，无肿胀或萎缩。说明DHF的细胞毒性很小。

实施例2：DHF减少了TBI后皮层的缺损

DHF是一个小分子(分子量为254.25g/mol)，可以穿过血脑屏障到达大脑区域，从 而影响TBI的损伤(Andero等,2011)。这里DHF用腹腔注射的方式给药，以检测DHF 给药是否能在体内模型里减少TBI后皮层神经元的死亡。

方法

动物。雄性C57BL/6小鼠(The Jackson Laboratories,Bar Harbor,ME)给予12/12- 小时光照/黑暗周期环境，并能够获得充分的食物和水。造模选取8-10周龄的小鼠。所 有的程序都依照印第安纳大学的动物护理和使用委员会的协议进行。

TBI造模。8-10周龄的C57BL/6小鼠被用于进行TBI造模。小鼠被固定在立体定 位仪上，剪开头皮，以前后囟门的连线和中缝与颞肌连线的交点为圆心，在左侧颅骨 上钻开一个4mm直径的洞，小心地掀开颅帽(不要损伤硬脑膜)。撞击杆被设定在于 脑子垂直的角度，设定撞击速度为3.0m/s，撞击深度为1.0mm。假手术组的小鼠也被 去除颅帽，但不接受撞击造模。手术和复苏期间，小鼠的中心体温维持在36-37℃。

DHF或者对照处理。在造模1小时前，小鼠按照组别分别给予DHF(5mg/kg，溶 于DMSO)或者DMSO腹腔注射处理。

组织处理。造模后24小时，小鼠深度麻醉后，用0.9％的生理盐水经心脏灌注， 随后以4％的多聚甲醛固定。脑组织被取出，置于4％的多聚甲醛中过夜后固定，然后 转移到30％的蔗糖溶液中。48小时后，脑组织被取出，进行冰冻切片(厚度为30μm)， 切片被保存在-20度冰箱。所用冰冻切片机为Microm HM 500M。

皮层损伤面积测量。为了评估残存的皮层面积，脑组织每隔5片取1片(也就是 每相隔180μm取一片)进行尼氏染色(Gao和Chen,2011)。脑片健侧和损伤侧的轮廓 都被勾勒出来，进行三维重建，所用显微镜为Olympus BX60，所用软件为系统(Microbrightfield Inc.,Colchester,VT)。皮层损伤的程度通过测量皮层的空洞来计 算，以空洞面积占皮层面积的百分比来表示。计算公式为：(健侧皮层面积-患侧皮层 面积)/健侧皮层面积x100％。

统计分析。所有数据用均值±标准误来表示，其后有每组小鼠的样本量。不同组间 的数据用t检验或者One-way ANOVA分析。

结果

假手术组尽管没有经过DHF或者DMSO处理，它们的皮层无论是患侧还是健侧 都未出现空洞。然而，DMSO处理的TBI小鼠，对比起无损伤的健侧，患侧损伤后24 小时的大脑皮层缺损率为16.75％±1.46％％(图2a)。DHF处理的TBI小鼠，皮层缺 损率降至12.43％±0.74％(图2b)，相比DMSO处理组皮层缺损率减少了25.8％。统 计学分析表明此差异有显著性意义。因此，结果表明DHF处理在体内TB模型是具有 神经保护作用的。

不仅如此，对照组和DHF组并未见明显的行为学改变，主要观测指标为a)麻醉 后苏醒时间；b)运动功能；c)疼痛反应。这些结果表明，DHF在体内未见明显副作 用。

实施例3：DHF减少了TBI后未成熟神经元的死亡，增加了海马内新生的未成熟 神经元

DHF在海马的效果被证实后，DHF在皮层的保护作用也被证实了。为了检测DHF 在皮层组织缺损方面的作用，尼氏染色后脑片被用于测量皮层空洞的面积。

方法

动物：同实施例2。

TBI造模：同实施例2。

动物经DHF或者对照处理：同实施例2，造模前一个小时给予DHF或者DMSO 处理。

组织处理：同实施例2，造模后24小时，小鼠被麻醉，经心脏灌注后用4％的多 聚甲醛固定，脑组织取出后放置于4％多聚甲醛中过夜，然后转移到30％的蔗糖中。48 小时后用于冰冻切片，切片保存在-20度。

FJB染色标记死亡细胞为了检测海马中FJB阳性细胞的密度，脑组织每6片取一 片(每片厚度为30μm，相隔180μm)，对前述的不同分区进行计数(CA1；CA3；颗粒细 胞层,GCL；分子层,ML；门区)(Amaral和Witter,1989)。对FJB阳性细胞的计数在40x 镜下进行，采取双盲的计数方法，所用显微镜为Zeiss Axiovert 200M，所用软件为 AxioVision,v4.0。FJB阳性细胞在单位面积上的密度乘以脑片厚度(30μm)以求得单 位体积密度，描述为细胞数/mm³。

免疫组化。组织切片在PBS中洗涤3词，用封闭液(10％驴血清溶于PBS，内含 0.3％triton)封闭2小时(4℃中进行)。然后一抗孵育48小时，所用一抗为：绵羊抗 小鼠p-TrkB(phospho Y816),1:20,ab74841,Abcam；小鼠抗小鼠NeuN,1:100,MAB377, Chemicon；豚鼠抗小鼠双皮质素(DCX),1:1000,Millipore,ab2253。48小时后，用PBS 润洗三次，加抗羊二抗(Alexa488IgG,1:1000,A11015,Invitrogen)4℃孵育1小时，再 在山羊抗小鼠(cy3IgG,1:400,A10521,Invitrogen)和山羊抗豚鼠(cy5IgG,1:200,A21450, Invitrogen)的二抗中4℃孵育1小时。以DAPI复染细胞核2分钟，用PBS润洗。最后 用水润洗后贴到载玻片上，干燥后封片。用显微镜采集图像。

统计分析所有数据用均值±标准误来表示，其后有每组小鼠的样本量。不同组间 的数据用t检验或者One-way ANOVA分析。

结果

DHF(溶于DMSO，剂量为5mg/kg)或者DMSO经腹腔注射在造模前1小时给 药，小鼠在造模后24小时取材。脑片被挑出来，进行FJB染色来评估细胞死亡。死亡 细胞会被FJB染成绿色。在假手术组中，未见FJB阳性细胞(图3a)，然而在TBI造 模的小鼠中，海马区域均可观察到FJB阳性细胞。大多数FJB阳性细胞都位于海马齿 状回的内侧1/3处(图3b)。这里同时也是未成熟神经元所在的位置。之前的研究已经 表明，FJB阳性细胞里大部分都是未成熟神经元(Gao,2008),且大部分细胞都是坏死 (Zhou,2012)。细胞计数结果显示，在TBI组小鼠中，齿状回的FJB细胞密度为25,395 ±2598/mm³(图3d)，DHF处理组中，齿状回的FJB阳性细胞显著减少，计数显示在 DHF处理组中，FJB阳性细胞密度降至19,505±600/mm³(图3d)，比起TBI组细胞 死亡率降了23.2％。DMSO处理的对照组中，细胞死亡并没有明显下降，且死亡细胞 多为非成熟颗粒神经元。

虽然大多数的FJB阳性细胞都在海马齿状回中，依然有少量的神经元死亡发生在 海马的其他区域，如CA1、CA3和门区。在假手术组，这三个区域的FJB阳性细胞密 度分别为233±146/mm³(CA1)、3863±1045/mm³(CA3)和1643±771/mm³(门区)，在 DHF处理组，这三个区域的FJB阳性细胞密度分别为308±53/mm³(CA1)、3808± 504/mm³(CA3)和1257±226/mm³(门区)，仅有轻微的改变。

为了进一步检测DHF在TBI后对未成熟神经元的神经保护作用，我们对海马齿状 回的未成熟神经元进行了计数。造模24小时后的小鼠和假手术组的小鼠脑组织被用于 评估。损伤中心的脑片被挑出来进行免疫染色，所选抗体为DCX，是一个针对新生未 成熟神经元的特异性抗体(Korzhevskii等,2006；Mullen等,1992)。齿状回内的新生神 经元被染成红色(图4)。在假手术组中，未成熟的新生神经元数目为187±14(图4a， 4e)。在没有任何处理的情况下，TBI后24小时，未成熟神经元减少至76±4(图4b， 4e)，表明有59.4％的细胞减少率。然而，在DHF处理组中，未成熟神经元的数目为 142±9(图4c，4e)，对比假手术组只有24.1％的减少率。没有DHF处理的组比DHF 处理的组多了35.3％的死亡细胞，且多数为坏死。这些数据表明DHF的单次注射可以 保护TBI后的非成熟神经元。