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法律状态
2018-04-03
授权
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2017-12-26
著录事项变更 IPC(主分类):C07K7/06 变更前: 变更后: 申请日:20150213
著录事项变更
2017-12-26
专利申请权的转移 IPC(主分类):C07K7/06 登记生效日:20171207 变更前: 变更后: 申请日:20150213
专利申请权、专利权的转移
2015-09-30
实质审查的生效 IPC(主分类):C07K7/06 申请日:20150213
实质审查的生效
2015-09-02
公开
公开
技术领域
本发明涉及功能乳品领域,特别涉及两条牦牛乳乳清蛋白源ACE抑制肽及其制备方法。
技术背景
随着社会的进步与发展,人们生活水平逐渐提高,饮食中脂肪与热量的比重逐渐加大,再加上运动量的减少,我国心血管疾病的发病率快速上升,其中高血压占主要地位。
高血压是指在未使用降压药物的情况下,收缩压 140mmHg和(或)舒张压90mmHg。目前,常用于抗高血压药物治疗的有6种主要的降压药物,它们分别是利尿剂、α-受体拮抗剂、钙通道阻滞剂、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂、α-肾上腺素受体阻滞剂和血管紧张素转化酶抑制剂。这些降血压药物能显著的降压,但却存在一定的毒副作用,如咳嗽、过敏性血管水肿及肾功能不全加重等。
血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽是经过蛋白水解后形成的小分子多肽,它具有显著的降血压作用,更有效的是它与其它普通降压药物比较发现,ACE抑制肽无毒副作用,并且对正常的血压无影响。ACE在血压调节中起重要作用,经碳端两个氨基酸(His-Leu)的切除,能够把原本无活性的血管紧张素Ⅰ转变为具有活性的血管紧张素Ⅱ,引起血管收缩,使血压上升;ACE还会使具有血管舒张功能的舒缓激肤失活,同样又引起血压上升的情形,ACE抑制肽能够阻断ACE引起的两种生化反应过程,起到降血压的作用。
ACE抑制肽一般以无活性的形式存在于蛋白质序列中,但当蛋白质通过热、酸碱的降解、酶制剂的水解或微生物的发酵等,无活性的蛋白质中可以释放出具有降压作用的ACE抑制肽。ACE抑制肽的制备方法主要有5种:化学降解法、酶解法、微生物发酵法、化学合成法和基因工程法,现在研究最多的是酶解法和微生物发酵法。相对于微生物发酵法,酶法反应迅速,制备ACE抑制肽的活性高,且原料广泛,主要有乳类蛋白、植物类蛋白及动物类蛋白,目前乳源ACE抑制肽主要是以牛乳为原料。
发明内容
本发明基于现有的技术,酶解牦牛乳乳清蛋白制备ACE抑制肽,为降血压提供无副作用药物做出了很大的贡献。
为了达到上述目的,本发明采取的技术方案为:
一种牦牛乳乳清蛋白源血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽,所述ACE抑制肽包括两条肽,分别为八肽MENSAEPE和五肽LDTDY。
一种牦牛乳乳清蛋白源血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽的制备方法,所述制备方法包括以下步骤:
步骤1:牦牛乳经过脱脂、酸凝沉淀得到上清,将上清液用1M NaOH调节pH值5.2,加热温度达80-90℃,使之沉淀即为乳清蛋白,冻干得到乳清蛋白冻干粉。
步骤2:将牦牛乳乳清蛋白冻干粉制成乳清蛋白溶液,用中性蛋白酶进行水解反应2~4 h,酶与乳清蛋白的比为1500~2000 U/g,调整乳清蛋白的温度40℃~50 ℃和pH值6.5~7.5,水解2~4h,得到酶解液;
步骤3:将步骤2所得酶解液在90 ℃水浴中保持15 min使酶失活,使用高速离心机在9000 rpm的条件下离心20 min,除去未水解的乳清蛋白,得到酶解产物;
步骤4:对步骤3所述酶解产物进行一级超滤,收集滤液,得到一级滤液;
步骤5:对步骤4所得的一级滤液进行二级超滤,初步得到具有ACE抑制活性的滤液;
步骤6:将步骤5所述超滤膜滤过液的多肽组分进一步分离分析其活性功能组分,样品经层析柱分离(Sephadex G-25,凝胶柱2.6×80cm,超纯水0.6 mL/min 洗脱,波长检测215 nm),多肽中的组分按分子量大小依次分离,按分离峰的时间范围收集洗脱液,分别命名为E1-E6组分;
步骤7:将步骤6所述E1-E6组分冷冻干燥保存,配置成多肽溶液,测定ACE抑制活性值;
步骤8:经层析分离后获得的E2、E4和E5组分ACE抑制活性高于其他组分,E5组分含量占凝胶过滤后收集多肽总量的33.5 %,高于E2和E4组分,我们选择E5组分进一步分离,半制备反相液相色谱柱分离E5,将不同洗脱时间范围的洗脱液分为5个组分,多次重复操作,收集洗脱液,将有机溶剂挥发后冷冻干燥,测定E5a到E5e组分多肽含量,配置相同浓度的溶液测定ACE抑制率,保留时间段分别为24-26.5min和31.9-32.3min的E5b和E5e组分的ACE抑制率均大于70 %;
步骤9:将反相液谱制备柱分离得到的组分E5b和E5e进行液质分析,然后利用串联质谱对一级质谱中的肽段氨基酸序列进行了分析,得到多肽序列。
进一步的,所述牦牛如乳清蛋白冻干粉的制备方法包括以下步骤:
步骤1:将新鲜的牦牛乳高速离心,6000rpm 20min,除去脂肪,得到脱脂乳;
步骤2:将所得脱脂乳在35-50℃范围内的恒温水浴箱中进行保温,采用磁力加热搅拌器进行搅拌,边搅拌边滴加1M HCl溶液,使脱脂乳溶液的pH达到4.6,使酪蛋白进行沉淀,6000 rpm离心20 min后,得到上清液;
步骤3:将上清液用采用磁力搅拌器进行搅拌,边搅拌边滴加1M NaOH调节pH值5.2,再加热至80-90 ℃,使乳清蛋白沉淀,6000 rpm离心20 min后,得沉淀的乳清蛋白,将其冷冻干燥24 h后得到牦牛乳乳清蛋白的冻干粉。
进一步的,步骤3中所述的一级超滤处理的条件为:
采用MWCO为10 kDa的超滤膜进行一级超滤:乳清蛋白降血压多肽浓度5 %,溶液pH 7.0,操作压力0.15 MPa,温度45℃,超滤时间2 h。
进一步的,步骤4中所述的二级超滤处理的条件为:压力0.15 MPa,温度45℃,pH 值7.0。
采用MWCO为6 kDa的超滤膜对一级滤液,进行超滤1~3h。
进一步的,步骤5中所述层析柱为SephadexG-25凝胶层析柱。
进一步的,所述凝胶层析的条件为:Sephadex G-25,凝胶柱2.6×80cm,超纯水0.6 mL/min 洗脱,波长检测215 nm。
本发明相比现有技术的有益效果为:
本发明采用酶解牦牛乳乳清蛋白制备出两条有效地ACE抑制肽,以新鲜牦牛乳为原料,选材纯天然,营养价值高,牦牛乳乳清蛋白还具有多种生理功能,且含有人体生长发育所必需的氨基酸,酶解后可制备大量的ACE抑制肽,该产品具有用量小、无毒副作用、性质温和、生理功能强的特点。
附图说明
图1为凝胶层析分离多肽示意图。
具体实施方式
实施例1
一种牦牛乳乳清蛋白源血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽,所述ACE抑制肽包括两条肽,分别为八肽MENSAEPE和五肽LDTDY。
一种牦牛乳乳清蛋白源血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽的制备方法,所述制备方法包括以下步骤:
步骤1:将新鲜的牦牛乳高速离心,6000rpm 20min,除去脂肪,得到脱脂乳;
步骤2:将所得脱脂乳在35-50℃范围内的恒温水浴箱中进行保温,采用磁力加热搅拌器进行搅拌,边搅拌边滴加1M HCl溶液,使脱脂乳溶液的pH达到4.6,使酪蛋白进行沉淀,6000 rpm离心20 min后,得到上清液;
步骤3:将上清液用采用磁力搅拌器进行搅拌,边搅拌边滴加1M NaOH调节pH值5.2,再加热至80-90 ℃,使乳清蛋白沉淀,6000 rpm离心20 min后,得沉淀的乳清蛋白,将其冷冻干燥24 h后得到牦牛乳乳清蛋白的冻干粉;
步骤4:将上述步骤所得乳清蛋白冻干粉制成质量浓度为5 %的乳清蛋白溶液100 ml,用中性蛋白酶进行水解反应3 h,酶与乳清蛋白的比为1800 U/g,用恒温水浴箱及1 M NaOH溶液分别调整乳清蛋白的温度45 ℃和pH值7.0,水解3h;
步骤5:将步骤4所得酶解液在90 ℃水浴中保持15 min使酶失活,使用高速离心机在9000 rpm的条件下离心20 min,除去未水解的乳清蛋白,得到酶解产物;
步骤6:对步骤5所述酶解产物进行一级超滤。采用MWCO为10 kDa的超滤膜进行一级超滤:乳清蛋白降血压多肽浓度5 %,溶液pH 7.0,操作压力0.15 MPa,温度45℃,超滤时间2h;
步骤7:采用MWCO为6 kDa的超滤膜对步骤5所述滤过液进行二级超滤处理2 h,初步得到具有ACE抑制活性的滤液;
步骤8:将步骤7所述超滤膜滤过液的多肽组分进一步分离分析其活性功能组分,样品经SephadexG-25凝胶层析柱分离,多肽中的组分按分子量大小依次分离,按分离峰的时间范围收集洗脱液,分别命名为E1-E6组分;
步骤9:将步骤8所述E1-E6组分冷冻干燥保存,配置成0.5 mg/mL的多肽溶液,利用紫外风光光度法测定ACE抑制活性值,E1组分是最先被洗脱下来的成分,平均分子量最大,ACE 抑制率为50.90 ±1.12%,E2和E4组分,具有相近的ACE抑制率,虽然E3组分的含量较高,但其ACE抑制率仅为35.18±3.35%。E5组分ACE抑制率最高,为77.47±1.12 %,该组分洗脱时间长,其平均分子量小于前4个组分。E6组分为分子量更低的肽组分,也具有一定的ACE抑制活性,但该组分含量低;
步骤10:经凝胶层析分离后获得的E2、E4和E5组分ACE抑制活性高于其他组分,E5组分含量占凝胶过滤后收集多肽总量的33.5 %,高于E2和E4组分,我们选择E5组分进一步分离。半制备反相液相色谱柱分离E5,将不同洗脱时间范围的洗脱液分为5个组分,多次重复操作,收集洗脱液,将有机溶剂挥发后冷冻干燥。测定E5a到E5e组分多肽含量,配置相同浓度的溶液测定ACE抑制率。保留时间段分别为24-26.5min和31.9-32.3min的E5b和E5e组分的ACE抑制率均大于70 %;
步骤11:将反相液谱制备柱分离得到的组分E5b和E5e进行液质分析,然后利用串联质谱对一级质谱中的肽段氨基酸序列进行了分析,得到多肽序列;
步骤12:采用化学固相合成法合成多肽,并测定了合成多肽的ACE 酶的体外抑制活性。在合成的这两条多肽八肽MENSAEPE和五肽LDTDY具有较高的ACE抑制率,IC50值分别为27.7μM、112.5μM;
步骤13:以原发性高血压大鼠(SHR)为动物模型,尾脉搏法间接测定大鼠血压收缩,评价牦牛乳乳清蛋白多肽的降血压功能。SHR大鼠连续14日口服1.2 g/kg BW和2.4 g/kg BW剂量的降血压多肽,给药后第4日起,两组SHR大鼠的尾动脉收缩压均显著低于对照组(p<0.05),心率值无差异。停药后1日,多肽组SHR大鼠的血压值仍保持较低的血压,停药后7日,多肽组大鼠血压值与对照组无差异。提示这两条降血压多肽对SHR大鼠有辅助降血压作用。
机译: 从乳清中获得ACE活性肽抑制剂,ECA肽抑制剂和包含它们的食品的优化程序
机译: 由乳清生产ACE抑制肽的方法和由此获得的肽
机译: 由乳清等提供ACE抑制肽的方法