一种基于一步PCR技术进行凡纳滨对虾遗传性别鉴定的方法

摘要

本发明是一种通过一步PCR技术即可实现对虾性别鉴定的方法，包括对虾DNA的提取、一步PCR性别鉴定引物设计、一步PCR性别鉴定PCR扩增体系建立、PCR产物检测及遗传性别的鉴定。本实验确立了用于性别鉴定的PCR引物和最佳条件，一步PCR性别鉴定引物在雌性个体会有扩增产物，而雄性个体无扩增产物，因此可以直接通过脂糖凝胶电泳即可对雌雄个体进行鉴定。本发明方法是一种快速、简便、低成本的性别鉴定方法，鉴定中不需要昂贵的基因分型仪器，仅需要PCR仪和电泳仪，并且分析的时间快、成本低，适合大规模推广。

说明书

技术领域

本发明属于水产生物技术中的对虾性别鉴定技术，具体地说，是一种时间 快、成本低、方法简便的对虾性别遗传鉴别方法，适合在实验室和育种基地进 行大规模推广。

背景技术

凡纳滨对虾原产于中南美洲，野生种群分布在从墨西哥到智利的太平洋沿 岸海域，自1988年由中国科学院海洋研究所的张伟权研究员从美国夏威夷引进 后，因其适应性好,生长快,抗病力强,养殖速度发展很快,已成为我国沿海和内陆 包括淡水地区的主要养殖品种(李刚(2007).凡纳滨对虾选择育种效应与生长规 律的研究硕士,西北农林科技大学；于洋(2014).凡纳滨对虾分子标记的开发 及其在遗传育种中的应用博士,中国科学院研究生院(海洋研究所))。在对虾 养殖过程中，主要影响对虾产量的是生长速度和抗病力，为了提高凡纳滨对虾 的生长速度，科研人员进行了选择育种、多倍体育种、雌核发育、单性化群体 培育等方面的研究，(Farafidy(安迪).凡纳滨对虾体重和体尺性状的遗传参数 和选择育种效果研究硕士,西北农林科技大学,2011.；朱春华,冉维亮,邓思 平，李广丽.环境因子对凡纳滨对虾性别分化的影响.水生生物学报2011,03: 414-422；张彬,韦嫔媛,熊建华,谢达祥,赵永贞，陈晓汉.凡纳滨对虾胚胎发 育进程及诱导染色体加倍时间确定.南方农业学报,2014,04:664-670.)，由于对 虾雌雄性别的异质性，雌虾的生长速度显著快于雄虾，因此在生产中培育全雌 的对虾群体能够显著提高对虾产量。

为了培育对虾全雌群体，需要首先明确对虾的遗传性别，并且需要在对虾 处于幼虾阶段时就要进行性别的分析和鉴定，另外在全雌群体的培育试验中， 需要进行大量的性别鉴定，因此需要建立一种快速、准确、成本低廉的对虾性 别分子鉴定方法。

PCR技术是一种非常成熟的分子生物学技术，也是用于分子鉴定的常用技 术，本发明利用雌雄对虾差异的DNA序列，合理设计引物，使得仅在雌性个体 中能够扩增出条带，而在雄性个体中无条带，利用这种特点，可以直接通过琼 脂糖凝胶电泳的方法进行检测，不需要贵重的基因分型仪器，结果重复性好， 鉴定快、成本低。

发明内容

本发明的目的是针对凡纳滨对虾批量性别分子鉴定的需要，通过设计特异 性PCR引物，优化反应体系，通过琼脂糖凝胶电泳，即可实现凡纳滨对虾遗传 性别的分子鉴定。

为实现以上目的，本发明采用的方案为：

提取对虾的基因组DNA，使用一步PCR进行性别鉴定的引物进行扩增，PCR 产物进行电泳检测，最后根据电泳结果进行对虾性别鉴定。

所述的对虾基因组DNA提取方法采用天根植物基因组提取试剂盒中的说明 书进行。

一步PCR进行性别鉴定的引物对序列为：

LvSDASF：AAGACAATGATTTTGAAG

LvSDASR：AAGAAACCGTGGGGGAAG。

所述的PCR扩增体系为：脱氧核苷酸混合物(10mmol/L)0.4μL，10×ExTaq  DNA聚合酶缓冲液(TAKARA,日本)2.5μL，ExTaq DNA聚合酶(2.5U/μL) 0.5μL,LvSDPF和LvSDPR(10μmol/L)各0.5μL，基因组DNA模板(50ng/μL) 2μL，双蒸水补足20μL。

PCR反应程序为95℃预变性10min，扩增35个循环(95℃30sec，53℃30 sec，72℃30sec)最后72℃延伸10min。

所述的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，步骤如下：

首先制备1％琼脂糖凝胶，并在琼脂糖凝胶中加入DuRed(北京泛博生物化 学有限公司)核酸染料。

在PCR产物中加入6X的上样缓冲液，之后将PCR产物加入到琼脂糖凝胶 孔中，Marker选择DL2000(TAKARA，日本),100V电压电泳20分钟。

电泳后的胶块使用BioRed凝胶成像系统查看电泳结果，使用Quantity One (BioRed，美国)软件获得电泳结果(如附图2所示)。

所述的对虾性别鉴定方法如下：根据电泳结果，如果电泳显示个体在350bp 处有一特异性条带，则该个体为雌性个体，如果电泳显示个体在350bp处无条 带，则该个体为雄性个体。

该方法的优点：

该方法仅通过一步PCR后进行琼脂糖电泳即可实现对虾性别的鉴定，操作 简单，成本低廉，基本的实验室及育种基地即配备鉴定所需要的仪器设备，利 于该方法的广泛推广。另外该方法的重复性好，鉴定准确率高，是一种准确方 便的鉴定方法。

附图说明

图1：一步PCR扩增进行性别鉴定结果，箭头所示的350bp处的条带为雌 性个体特异性条带，其中个体2、3、4、9、10、11、12、18、19、20鉴定为雌 性，其余个体鉴定为雄性。

图2：一种基于一步PCR技术进行对虾性别鉴定的方法。图中电泳结果中 雌性个体均在350bp处有一条带，而在雄性个体中350bp处没有条带。

具体实施方式

实施例1：一种基于一步PCR技术进行对虾性别鉴定的方法

具体步骤如下：

1.对待分析的24个对虾样品进行取样，取附肢或者肌肉组织30mg，并对每 个个体的组织进行标记。

2.使用天根植物基因组DNA提取试剂盒提取上述样品的DNA并标记，操 作方法参考说明书。提取的DNA使用Nanodrop1000(Thermol)测定DNA浓度。

3.将提取的DNA使用如下引物进行PCR扩增：

LvSDPF：AAGACAATGATTTTGAAG

LvSDPR：AAGAAACCGTGGGGGAAG。

其中的PCR扩增反应的总体积为25μL，扩增反应体系为：脱氧核苷酸混 合物(10mmol/L)0.4μL，10×ExTaq DNA聚合酶缓冲液(TAKARA,日本)2.5μL， ExTaq DNA聚合酶(2.5U/μL)0.5μL,LvSDPF和LvSDPR(10μmol/L)各0.5μL， 基因组DNA模板(50ng/μL)2μL，双蒸水补足20μL。PCR反应程序为95℃ 预变性10min，35个扩增循环(95℃30sec，53℃30sec，72℃30sec)最后 72℃延伸10min。

4.对上述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，步骤如下：

首先制备1％琼脂糖凝胶，并在琼脂糖凝胶中加入DuRed(北京泛博生物化 学有限公司)核酸染料。

在PCR产物中加入6X的上样缓冲液，之后将PCR产物加入到琼脂糖凝胶 孔中，Marker选择DL2000(TAKARA),100V电压电泳20分钟。

电泳后的胶块使用BioRed凝胶成像系统查看电泳结果，使用Quantity One (BioRed，美国)软件获得电泳结果如附图1所示。

5.按照图中所示，仅有一条带的为雌性个体，没有条带的为雄性个体，因此 图1中标示的个体2、3、4、9、10、11、12、18、19、20为雌性，其余个体为 雄性。