通过用正电性有机添加剂处理来降低蛋白质制剂中蛋白质-污染物复合物和聚集物水平的方法

摘要

通过以低浓度的正电性有机添加剂(例如依沙吖啶、氯己定或聚乙烯亚胺)与酰脲(例如尿素、尿酸或尿囊素)或有机调节剂(例如非离子有机聚合物、表面活性剂、有机溶剂或酰脲)的组合的处理来降低抗体和其他蛋白质制剂中的聚集物水平的方法。本发明的一些方面涉及用于降低细胞培养物收获物的聚集物水平并使其澄清的方法。其还涉及将这些能力与另一些纯化方法整合，以达到期望的最终纯化水平。

说明书

技术领域

本发明涉及用于增强包含抗体在内的蛋白的纯化的方法。其特别 涉及用于降低细胞培养物收获物的聚集物水平并使其澄清的方法。其 还涉及将这些能力与另一些纯化方法整合，以达到期望的最终纯化水 平。

发明背景

有研究表明，来源于宿主细胞的污染物与体外细胞培养法产生的 重组蛋白质之间自发形成非天然的异质结合(Shukla等，Biotechnol. Progr.(2008)24:1115-1121；Luhrs等，J.Chromatogr.B(2009) 877:1543-1552；Mechetner等，J.Chromatogr.B(2011)879:2583-2594； Gagnon等，J.Chromatogr.A,(2011)1218:2405-2412；Gagnon, Bioprocessing J.(2010)9(4):14-24)。这些异质结合可在两个方面视作 非天然的：1)组成型污染物常常是非人源的，由活的非人宿主细胞分 泌至培养基中或当非人宿主细胞在死亡后裂解时释放至培养基中。在 活人体内，这样的非人污染物不存在；以及2)与快速消除死细胞组 分的人体内系统相比，组成型污染物积累至高浓度。因此，重组产物 暴露于一般不出现在活系统中的浓度的高水平强相互作用性污染物。 同时，重组蛋白质的高表达水平使它们成为与这些非人污染物非特异 性结合的合适底物，倾向于形成不期望的多种组合物的异质结合，包 括复合物和聚集物。

通过直接靶向污染性蛋白质(Shukla等和Gagnon等，见上文) 以及间接通过靶向与污染性蛋白质有关的相应DNA组分(Luhrs等和 Gagnon，间上文)，在一定程度上克服了异质聚集物中的污染性蛋白 含量。当一些复合物解离时，指示抗体聚集水平的降低(Shukla等、 Mechetner等和Gagnon，见上文)。公开了阴离子交换剂降低抗体-污 染物复合物水平的的能力(Luhrs等和Gagnon等，见上文)，但是没 有指示阴离子交换处理能够完全消除异质聚集物。已经尝试使用了尺 寸排阻色谱、阳离子交换色谱和疏水相互作用色谱来降低异质聚集物， 但是这些技术一般不如阴离子交换(Gagnon等，见上文)。

用可期望使异质聚集物解离的试剂处理抗体制剂一般被证明是无 效的。例如，使用高浓度尿素、盐或这两者的组合基本不使IgM-污染 物的异质聚集物解离(Gagnon等，见上文)。有研究表明，以尿素、 醇和表面活性剂进行洗脱前洗涤的蛋白A亲和色谱比不进行洗涤更有 效地降低异质聚集物水平(Shukla等，见上文)，组合尿素、盐和EDTA 以及蛋白G亲和色谱的洗脱前洗涤的亦有此效果(Mechetner等，见 上文)。有研究表明，以尿素进行洗脱前洗涤的阴离子交换色谱比没有 尿素洗涤更有效地减少异质聚集物(Gagnon等，见上文)。还有研究 表明，以EDTA进行洗脱前洗涤的阳离子交换色谱比不进行洗涤更有 效地减少异质聚集物(Gagnon等，见上文)。最后，以尿素和/或盐进 行洗脱前洗涤的羟磷灰石层析也比不进行这样的洗涤更有效地减少异 质聚集物(Gagnon，见上文)。尽管有这些发现，但是一般而言，在 对结合至色谱柱的抗体进行洗脱前洗涤中使用解离试剂仅取得了中度 的成功。

有研究指示了正电性有机添加剂用于酸性蛋白质沉淀(Farhner 等，美国专利申请No.20080193981；Ma等，J.Chromatogr.B(2010) 878:798-806；Peram等，Biotechnol.Progr.,(2010)26:1322-1326；Glynn, in U.Gottschalk(编写),Process Scale Purification of Antibodies,J.T. Wiley和Sons,(2009)Hoboken,309-324)，以及用于DNA和内毒素沉 淀(Glynn，见上文；Cordes等，Biotechnol.Progr.,(1990)6:283-285； Dissing et al.,Bioseparation,(1999)7221:9-11)和病毒失活(Bernhardt， 美国专利5,559,250)。还有研究表明，多价金属阳离子从一些蛋白制 剂去除DNA和内毒素(Akcasu等，Nature,(1960)187:323-324； Matsuzawa等，Nucl.Acids Res.,(2003)3(3):163-164；Christensen等， Prot.Expr.Purif.,(2004)37:468-471；Kejnovsky等，Nucl.Acids Res., (1997)25:1870-1871；Ongkudon等，Anal.Chem.,(2011)83391:13-17)。

发明概述

在某些实施方案中，本发明提供了用于通过以正电性有机添加剂 处理样品来降低包含所需蛋白质种类的样品(例如蛋白质制剂)中产 物-污染物复合物和聚集物的量的方法。在某些实施方案中，以超低水 平的正电性有机添加剂实现复合物和/或聚集物的减少。在某些实施方 案中，本发明特别降低包含染色质残余物(例如核小体和/或组蛋白和 /或DNA)的聚集物的含量。在某些实施方案中，在升高的电导率值 (盐浓度)下处理所述样品。在某些实施方案中，以未溶解的酰脲额 外处理所述样品，并收集包含所需蛋白质的上清。在某些实施方案中， 替选地或额外的用诸如非离子有机聚合物、有机溶剂、表面活性剂或 酰脲的其他有机添加剂处理所述样品，以增强复合物或聚集物中与所 需蛋白质结合的污染物的解离。在某些实施方案中，随后将经处理的 样品暴露于携带化学部分的固体材料，所述化学部分从所述所需蛋白 质选择性去除正电性有机添加剂以及其他可能的化学实体。

发明详述

提供了用于蛋白质纯化的方法和试剂盒。在某些实施方案中，本 发明提供通过使抗体或其他蛋白质与正电性有机添加剂接触来从抗体 或其他蛋白质的制剂中减少蛋白质-污染物复合物和聚集物。在某些实 施方案中，本发明可以在从所谓生理学条件至最高3倍或更多倍这样 的生理学条件的电导率值的电导率水平范围内实施；这样的升高的电 导率水平可抑制所需蛋白质或靶蛋白的沉淀。在某些实施方案中，本 发明可以超低浓度的正电性有机添加剂来实施，例如是这样的添加剂 用于介导沉淀目的时的浓度的1/10或1/100的水平。在某些实施方案 中，本发明提供了以下优点，降低针对为目的蛋白定制的要求开发要 求的需要、改进目的蛋白的回收、改进纯化方法的重现性并降低去除 聚集物的额外处理步骤的需要。

本文公开的实施方案提供了降低包含所需蛋白质的样品的聚集物 含量的方法，所述方法包括使所述样品与正电性有机添加剂和未溶解 的酰脲接触。

在一些这样的实施方案中，在15mS/cm或更高的电导率值下降低 包含所需蛋白质的样品的聚集物含量的方法，所述方法包括以0.1％或 更低浓度添加正电性有机添加剂。

在前述实施方案中的一个或多个中，降低包含所需蛋白质的样品 的聚集物含量的方法，所述样品具有5mS/cm或更高电导率值，所述 方法包括在一种或多种有机添加剂的存在下以0.1％或更低的浓度添 加正电性有机添加剂，以减少沉淀形成，其中所述一种或多种有机添 加剂选自酰脲、有机溶剂或表面活性剂。

在前述实施方案的一个或多个中，降低包含所需蛋白质的样品的 聚集物含量的方法，所述方法包括提供包含聚集物的样品，以及使所 述样品与正电性有机添加剂接触，其中所述所需蛋白质溶解于所述样 品中。

在前述实施方案中的一个或多个中，所述酰脲是尿囊素。

在前述实施方案中的一个或多个中，所述酰脲以约0.5％重量/体 积至约2％重量/体积的范围存在。

在前述实施方案中的一个或多个中，所述正电性有机添加剂包含 选自依沙吖啶、氯己定、聚乙烯亚胺、亚甲蓝和苯扎氯铵中的一种。

在前述实施方案中的一个或多个中，在添加正电性有机添加剂之 前添加所述酰脲。

在前述实施方案中的一个或多个中，添加盐至基本防止所需蛋白 质形成沉淀的水平。

在前述实施方案中的一个或多个中，所述所需蛋白质包含选自抗 体、因子VIII、生长激素和重组蛋白质中的一种。

在前述实施方案中的一个或多个中，添加所述正电性有机添加剂 至1％重量/体积或更低重量/体积的水平。

在前述实施方案中的一个或多个中，添加所述正电性有机添加剂 至0.1％重量/体积或更低重量/体积的水平。

在前述实施方案中的一个或多个中，添加所述正电性有机添加剂 至0.01％重量/体积或更低重量/体积的水平。

在前述实施方案中的一个或多个中，添加所述正电性有机添加剂 至0.001％重量/体积或更低重量/体积的水平。

在前述实施方案中的一个或多个中，所述正电性有机添加剂以 0.02％至0.03％的浓度范围存在。

在前述实施方案中的一个或多个中，存在多种正电性有机添加剂。

在前述实施方案中的一个或多个中，所述多种正电性有机添加剂 的总浓度是1％重量/体积或更低重量/体积。

在前述实施方案中的一个或多个中，所述多种正电性有机添加剂 的总浓度是0.1％重量/体积或更低重量/体积。

在前述实施方案中的一个或多个中，所述多种正电性有机添加剂 的总浓度是0.01％重量/体积或更低重量/体积。

在前述实施方案中的一个或多个中，所述多种正电性有机添加剂 的总浓度是0.001％重量/体积或更低重量/体积。

在前述实施方案中的一个或多个中，所述未溶解的酰脲是尿囊素。

在前述实施方案中的一个或多个中，尿囊素以约0.56％重量/体积 至约1％重量/体积的浓度范围存在。

在前述实施方案中的一个或多个中，尿囊素以约1％重量/体积至 约2％重量/体积的浓度范围存在。

在前述实施方案中的一个或多个中，尿囊素以约2％重量/体积至 约5％重量/体积的浓度范围存在。

在前述实施方案中的一个或多个中，尿囊素以约5％重量/体积至 约10％重量/体积的浓度范围存在。

在前述实施方案中的一个或多个中，尿囊素以约10％重量/体积至 约15％重量/体积的浓度范围存在。

在前述实施方案中的一个或多个中，在添加所述正电性有机添加 剂之前向所述样品中添加酰脲。

在前述实施方案中的一个或多个中，将所述样品的电导率调节至 足够高的水平以抵消所述所需蛋白质因沉淀而造成的大量损失。

在前述实施方案中的一个或多个中，将所述样品的电导率调节至 比抵消所述所需蛋白质的大量损失所需水平更高的水平。

在前述实施方案中的一个或多个中，将所述样品的电导率调节为 高至生理学电导率的两倍。

在前述实施方案中的一个或多个中，将所述样品的电导率调节为 高至生理学电导率的三倍过更高。

在前述实施方案中的一个或多个中，降低所述样品的电导率，但 保持足够高以抵消所述所需蛋白质的大量损失。

在前述实施方案中的一个或多个中，在添加所述正电性有机添加 剂之前调节所述样品的电导率。

在前述实施方案中的一个或多个中，存在有机溶剂。

在前述实施方案中的一个或多个中，所述有机溶剂包括选自乙醇、 异丙醇、乙二醇、丙二醇、三(正丁基)磷酸酯和甘油中的一种。

在前述实施方案中的一个或多个中，所述有机溶剂包括约0.01％ 重量/体积至约20％重量/体积范围的浓度。

在前述实施方案中的一个或多个中，所述有机溶剂包括约0.01％ 至约1％浓度范围的乙二醇、丙二醇、甘油、乙醇、异丙醇或三(正丁 基)磷酸酯。

在前述实施方案中的一个或多个中，所述有机溶剂包括约1％至约 5％浓度范围的乙二醇、丙二醇、甘油、乙醇或异丙醇。

在前述实施方案中的一个或多个中，所述有机溶剂包括约5％至约 10％浓度范围的乙二醇、丙二醇、甘油、乙醇或异丙醇。

在前述实施方案中的一个或多个中，所述有机溶剂包括约10％至 约20％浓度范围的乙二醇、丙二醇或甘油。

在前述实施方案中的一个或多个中，存在有机溶剂，并且其包含 选自乙醇、异丙醇和三(正丁基)磷酸酯中的一种。

在前述实施方案中的一个或多个中，所述有机溶剂的浓度小于 1％。

在前述实施方案中的一个或多个中，所述有机溶剂的浓度小于 0.1％。

在前述实施方案中的一个或多个中，所述有机溶剂的浓度小于 0.01％。

在前述实施方案中的一个或多个中，存在可溶酰脲。

在前述实施方案中的一个或多个中，所述可溶酰脲是尿素。

在前述实施方案中的一个或多个中，所述可溶酰脲以约0.5M至 约1M的浓度范围存在。

在前述实施方案中的一个或多个中，所述可溶酰脲以约1M至约 2M的浓度范围存在。

在前述实施方案中的一个或多个中，所述可溶酰脲以约2M至约 4M的浓度范围存在。

在前述实施方案中的一个或多个中，所述可溶酰脲以约4M至约 8M的浓度范围存在。

在前述实施方案中的一个或多个中，存在表面活性剂。

在前述实施方案中的一个或多个中，所述表面活性剂包括非离子 表面活性剂。

在前述实施方案中的一个或多个中，所述表面活性剂包括选自吐 温和Triton中的一种。

在前述实施方案中的一个或多个中，所述表面活性剂包括两性离 子表面活性剂。

在前述实施方案中的一个或多个中，所述两性离子表面活性剂包 括选自CHAPS、CHAPSO和十八烷基葡糖苷(octaglucoside)中的一 种。

56.如权利要求51至55中任一项所述的方法，其中所述表面活 性剂以低于1％的非零浓度存在。

在前述实施方案中的一个或多个中，所述表面活性剂以低于0.1％ 的非零浓度存在。

在前述实施方案中的一个或多个中，所述表面活性剂以低于 0.01％的非零浓度存在。

在前述实施方案中的一个或多个中，存在螯合剂。

在前述实施方案中的一个或多个中，所述螯合剂带正电。

在前述实施方案中的一个或多个中，所述带正电的螯合剂包括三 (2-氨基乙基)胺或去铁胺。

在前述实施方案中的一个或多个中，所述螯合剂以低于100mM 的非零浓度存在。

在前述实施方案中的一个或多个中，所述螯合剂以低于50mM的 非零浓度存在。

在前述实施方案中的一个或多个中，所述螯合剂以低于20mM的 非零浓度存在。

在前述实施方案中的一个或多个中，所述螯合剂以低于10mM的 非零浓度存在。

在前述实施方案中的一个或多个中，所述螯合剂以低于5mM的 非零浓度存在。

在前述实施方案中的一个或多个中，存在以下物质中的多种：(a) 有机溶剂，(b)有机聚合物，(c)可溶酰脲，(d)表面活性剂，(e)螯 合剂和(f)盐。

在前述实施方案中的一个或多个中，所述被接触的样品暴露于一 种或多种固体，以在随后的使所述所需蛋白质与残余的污染物分离的 处理步骤之前除去至少一种正电性有机添加剂。

提供了用于实施前述实施方案中任一项所述方法的试剂盒。

在某些实施方案中，本发明提供了用于降低具有比所需蛋白质更 高分子量的聚集物(例如同质聚集物)水平的方法，还提供了用于降 低流体动力学尺寸仅中度大于所需蛋白质的聚集物(例如异质聚集物) 的水平的方法。在某些实施方案中，聚集物包括所需蛋白质与污染物 的异质聚集物，并且在某些这样的实施方案中，所述污染物是核酸、 核苷酸、内毒素、金属离子、蛋白质、脂质或细胞培养基组分。在某 些实施方案中，基本消除存在的所需蛋白质的同质聚集物。在某些实 施方案中，基本消除存在的所需蛋白质与污染物的异质聚集物。

在某些实施方案中，本发明还提供了与聚集物的减少一起的诸如 DNA、内毒素和病毒等污染物水平的降低。在某些实施方案中，通过 额外包括抗病毒剂来实施本发明。

在某些实施方案中，目的蛋白质种类(例如待纯化的所需蛋白质) 是重组来源的，并且蛋白质制剂可包括：包含细胞的细胞培养物收获 物、细胞培养物上清、澄清的细胞培养物上清、色谱柱的洗脱物或得 自之前纯化步骤的包含蛋白质的溶液。在某些实施方案中，所述蛋白 质制剂包含抗体，并且在某些这样的实施方案中，所述抗体是IgG、 IgM或其片段形式，或者抗体或抗体片段的融合蛋白，例如Fc融合蛋 白质。在某些实施方案中，所述所需蛋白质可为凝血蛋白，例如因子 VIII。在某些实施方案中，所述所需蛋白质可为肽激素，例如人生长 激素。

在某些实施方案中，使所述样品的电导率处于基本避免所述所需 蛋白质从所述样品中沉淀的足够高的水平来实施本发明。可根据本领 域已知的方法通过添加盐或稀释剂来调节电导率。在某些实施方案中， 所述电导率比确定为避免所述所需蛋白质大量沉淀所需的水平高5m S/cm、10mS/cm、15mS/cm或20mS/cm。在某些实施方案中，所述 电导率大于20mS/cm、25mS/cm、30mS/cm、35mS/cm、40mS/cm、 45ms/cm或大于45mS/cm。在升高的电导率下去除重要的污染物亚群 的方法的能力是本发明的令人意想不到的特征之一，因为已知在升高 的电导率下这些系统中的电荷相互作用降低。例如，在25mS/cm和更 高的电导率下，已知仅少数带负电的蛋白质结合至正电性表面。除了 本方法之外，制备IgG抗体的大多数正电性试剂的应用在低于5mS/cm 的电导率下进行，并且通常具有附加的碱性pH运行要求。本方法不 要求这样的运行pH。对本领域技术人员将显而易见的是，升高的电导 率可具有弱化聚集物中内部静电结合的效果，并因此提高本方法实现 解离聚集物和/或去与所需蛋白质结合的污染物的能力。

在某些实施方案中，所述正电性有机添加剂是依沙吖啶、9-氨基 吖啶(氨吖啶)、3,6吖啶二胺(原黄素)、吖啶琐辛、吖啶氯(酚吖啶)、 吖啶橙、喹吖因、乐杀螨(acricide)、吖啶酮、吖啶-9-羧酸、氯甲氧 吖啶(1-[(6-氯-2-甲氧基-9-吖啶基)氨基]-3-(二乙基氨基)-2-丙醇二盐酸 盐)、酚藏花红、酚噁嗪、吩噻嗪、吖啶黄(氯化3,6-二氨基-10-甲基 吖啶和3,6-吖啶二胺)、聚乙烯亚胺(聚(亚氨基亚乙基))、氯己定或聚 氨基酸。在某些实施方案中，所述正电性有机添加剂是依沙吖啶、聚 乙烯亚胺或氯己定，或其盐。

在某些实施方案中，以基本为足以促进期望的聚集物减少程度的 最低浓度来提供所述正电性有机添加剂。在某些实施方案中，所述正 电性有机添加剂的浓度为低于(基于重量/体积)0.1％、0.05％、0.04％、 0.025％或0.001％。在某些实施方案中，以0.01％至0.04％或0.02％至 0.025％的浓度提供所述正电性有机添加剂。在某些这样的实施方案中， 所述正电性有机添加剂是依沙吖啶、聚乙烯亚胺(PEI)或氯己定。所 述方法在所述正电性有机添加剂低于0.1％浓度的情况下实现有用效 果的能力凸显了所述方法的另一个意想不到的特征：除了以升高的电 导率并且无需碱性pH要求运行外，所述方法可为高度有效的而不引 起显著的沉淀量。正电性有机添加剂通常用于介导酸性蛋白质、DNA 和病毒等污染物的沉淀。因此，可以以例如1％或更高的高浓度来使用 它们。本发明的目的是解离聚集物，或弱化聚集物内部的结合，或除 去使聚集物稳定的非产物污染物。在许多实施方案中，本方法的第二 目的是使沉淀最小化或避免沉淀，或者使去除沉淀的需要最小或避免 该需要，这是低的正电性有机添加剂浓度和高运行电导率的原因。

在某些实施方案中，本发明可在选择的pH下实施，以在降低样 品中聚集物的量的同时避免或限制所需蛋白质的沉淀。可通过常规方 法调节pH水平，并且可结合电导率的选择来选择pH水平。在某些实 施方案中，所述样品的pH为约4至约9、约5至约8、或约6至约7.5。 这再次凸显了使用正电性有机添加剂的该不寻常的性质。

在某些实施方案中，优选基本在添加所述正电性有机添加剂的同 时，使所述样品还与抗病毒剂接触。在某些这样的实施方案中，所述 抗病毒剂本身是正电性有机分子，例如苯扎氯铵或亚甲蓝。也可使用 电中性或非离子抗病毒剂，例如三(正丁基)磷酸酯。抗病毒剂可以低 于约1％(w/v)、低于约0.1％(w/v)或低于约0.01％(w/v)或低于 约0.001％的量存在。在蛋白质不耐受通过在低pH下处理来进行病毒 失活的情况下，这样的试剂可为特别有用的。

在某些实施方案中，所述方法包括使所述样品与足以使酰脲不在 所述样品中溶解的量的酰脲接触的步骤。然后可使包含所述所需蛋白 质的上清从包含经沉淀的污染物的样品平衡中分离。在某些这样的实 施方案中，在使所述样品与所述正电性有机添加剂接触的步骤之前提 供所述酰脲，在另一些实施方案中，在使所述样品与所述正电性有机 添加剂接触的步骤的基本同时提供所述酰脲，并且在另一些实施方案 中，在使所述样品与所述正电性有机添加剂接触的步骤之后提供所述 酰脲。在某些这样的实施方案中，所述酰脲可为任意的以下物质：尿 酸、乙内酰脲(咪唑啉啶-2,4-二酮)、尿囊素(2,5-二氧-4-咪唑烷基) 脲、尿囊素氯羟铝、尿囊素羟铝、hemocane、脲基乙内酰脲、5-脲基 乙内酰脲)、乙醛酰基酰脲、乙醛酸二酰脲、2,5-二氧-4-咪唑烷基脲、 咪唑基啶基脲和嘌呤。在某些实施方案中，所述酰脲是尿囊素，并且 在一些这样的情况下，所述尿囊素以高于0.56％(w/v)、1％、1.5％、 2％或更高的浓度存在。在某些实施方案中，所述酰脲是尿酸，并且在 一些这样的情况下，所述尿酸以高于0.0025％(w/v)、0.005％、0.01％、 0.05％、0.1％、1％或更高的浓度存在。

在某些实施方案中，所述方法还包括使所述样品与使酰脲完全溶 解的量的酰脲接触。在某些这样的实施方案中，所述可溶酰脲可为尿 素、咪唑基啶基脲或其他酰脲。在某些实施方案中，所述酰脲是尿素， 并且在一些这样的情况下，所述尿素以高于0.5M，或高于1M，或高 于2M，或高于4M，或高于6M，或高于8M的浓度存在。这再次 凸显了所述方法的该出乎意料的性质，其中避免蛋白质沉淀是所述方 法的特定目的。诸如尿素等高度可溶的酰脲具有使许多化合物的溶解 度升高的一般效果，换言之，其的存在抵抗沉淀的形成。对本领域技 术人员将显而易见的是，高度可溶的酰脲的存在可具有弱化聚集物中 内部疏水和/或氢键键合结合的效果，并因此提高本方法实现解离聚集 物和/或去与所需蛋白质结合的污染物的能力。

在某些实施方案中，通过以下事实增强了本发明的效用，其还加 速了细胞培养物收获物中的细胞碎屑的沉淀，并显著降低所存在的 DNA、内毒素和病毒的水平。实验数据表明，一些酰脲倾向于与聚集 物、内毒素和病毒相互作用的能力对这些结果有贡献，并且与不存在 酰脲的情况下用正电性有机添加剂相比，低水平溶解的酰脲可贡献它 们所支持的更高的抗体回收率。本发明与非正电性的抗病毒剂的添加 相容，后者可进一步扩展本发明的效用。在处理后，可通过沉淀或过 滤去除固体材料，留下上清中基本不含聚集物的蛋白质。这提供了本 发明的另一个优点，即，经处理的材料为光学澄清的并且没有颗粒， 而通过其他方法处理的材料通常是浑浊并且不透明的。

在某些实施方案中，本发明可通过使所述样品与诸如非离子有机 聚合物、有机溶剂、表面活性剂或酰脲等可溶有机调节剂接触的附加 步骤来实施。在某些这样的实施方案中，在使所述样品与所述正电性 有机添加剂接触步骤之前进行使所述样品与所述有机调节剂接触的步 骤。在另一些实施方案中，在使所述样品与所述正电性有机添加剂接 触步骤的基本同时进行使所述样品与所述有机调节剂接触的步骤。在 另一些实施方案中，在使所述样品与所述正电性有机添加剂接触步骤 之后进行使所述样品与所述有机调节剂接触的步骤。在某些实施方案 中，所述有机调节剂是非离子有机聚合物，例如聚乙二醇、聚丙二醇 和聚丁二醇，并且在某些这样的实施方案中，所述非离子有机聚合物 的平均分子量为约1000D或更低、500D或更低、250D或更低或者 100D或更低。在某些实施方案中，所述有机调节剂是有机溶剂，例 如乙二醇、丙二醇、丁二醇、二甲基亚砜、乙醇或苯氧乙醇。在某些 实施方案中，以约1％(w/v)或更高的浓度提供所述有机调节剂。在 某些实施方案中，所述有机调节剂是表面活性剂，例如吐温、triton、 CHAPS、CHAPSO或辛基葡糖苷，并且在某些这样的实施方案中，以 约1％(w/v)或更低、约0.1％或更低或者约0.02％(w/v)或更低的 浓度提供所述表面活性剂。在某些实施方案中，所述有机调节剂是以 亚饱和量提供的酰脲，并且在某些这样的实施方案中，所述酰脲是尿 素、乙内酰脲或尿囊素。这再次凸显了本发明的该不同寻常的性质， 其中在降低或消除显著量的沉淀形成的条件下使用正电性有机添加 剂。除了异常低浓度的正电性有机添加剂外，高的运行电导率、对碱 性pH的非依赖性以及公知的尿素增溶效果、有机溶剂和表面活性剂 的存在，都具有弱化某些优选的正电性有机添加剂与蛋白质污染物或 其他污染物之间的疏水相互作用的效果。这尤其适用于疏水性的正电 性有机添加剂，例如依沙吖啶或其类似物，或者适用于氯己定或苯扎 氯铵。对本领域技术人员将显而易见的是，诸如所述的有机添加剂的 存在可具有弱化聚集物中内部化学结合的效果，并因此提高本方法实 现解离聚集物和/或去与所需蛋白质结合的污染物的能力。

在某些实施方案中，本发明提供了用于降低溶液中包含所需蛋白 质的样品的聚集物含量的方法，其中使所述样品与正电性有机添加剂 接触。在某些实施方案中，所述样品的电导率处于基本避免所述所需 蛋白质从所述样品中沉淀的足够高的水平。在某些实施方案中，所述 电导率高于15mS/cm，或者所述电导率高于30mS/cm。

在某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中所述正电性 有机添加剂的浓度低于约0.1％(w/v)。在某些实施方案中，所述正电 性有机添加剂选自依沙吖啶、9-氨基吖啶(氨吖啶)、3,6吖啶二胺(原 黄素)、吖啶琐辛、吖啶氯(酚吖啶)、吖啶橙、喹吖因、乐杀螨(acricide)、 吖啶酮、吖啶-9-羧酸、氯甲氧吖啶(1-[(6-氯-2-甲氧基-9-吖啶基)氨 基]-3-(二乙基氨基)-2-丙醇二盐酸盐)、酚藏花红、酚噁嗪、吩噻嗪、 吖啶黄(氯化3,6-二氨基-10-甲基吖啶和3,6-吖啶二胺)、聚乙烯亚胺、 氯己定和聚氨基酸。在某些实施方案中，本发明提供了这样的方法， 其中所述正电性有机添加剂是依沙吖啶、聚乙烯亚胺或氯己定，或其 盐。在某些实施方案中，本发明提供这样的方法，其中所述正电性有 机添加剂以约0.01％至约0.05％的量存在，或以低于约0.01％的量存 在，或以低于约0.005％的量存在，或以低于约0.001％的量存在。

在某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中所述样品的 pH为约4至约9、约5至约8或约6至约7.5。

在某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，减少的聚集物包 括所需蛋白质的同质聚集物，在另一些实施方案中，减少的聚集物包 括所需蛋白质与污染物的异质聚集物，并且在另一些实施方案中，所 述聚集物包括同质聚集物和异质聚集物二者。在某些实施方案中，本 发明提供了这样的方法，其中基本消除样品中聚集物。在某些实施方 案中，减少的聚集物具有与所需蛋白质基本相同的流体动力学尺寸。 在某些实施方案中，减少的聚集物是异质聚集物，包括核酸、核苷酸、 内毒素、金属离子、蛋白质、脂质或细胞培养基组分。

在某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中所需蛋白质 是抗体或抗体片段。在某些实施方案中，所述样品是细胞培养物收获 物、细胞培养物上清、来源于细胞培养物的包含抗体的溶液或来源于 之前的蛋白质纯化阶段的包含抗体的溶液。

在某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中所述样品是 来源于之前的蛋白质纯化阶段的包含所需蛋白质的溶液。在某些实施 方案中，所述样品是来自色谱柱的洗脱物。

在某些实施方案中，本发明提供了其中还使所述样品与抗病毒剂 接触的方法。在某些实施方案中，所述抗病毒剂选自苯扎氯铵、亚甲 蓝和三(正丁基)磷酸酯。在某些实施方案中，所述抗病毒剂以低于约 1％(w/v)的量存在，或以低于约0.1％(w/v)的量存在，或以低于 约0.01％(w/v)的量存在。

在某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其包括以下附加 步骤：使所述样品与足以使酰脲不在所述样品中溶解的量的酰脲接触， 并且从所述样品的部分分离包含所需蛋白质的上清。

在某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中在使所述样 品与所述正电性有机添加剂接触步骤之前进行使所述样品与所述酰脲 接触的步骤。

在某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中在使所述样 品与所述正电性有机添加剂接触步骤的基本同时进行使所述样品与所 述酰脲接触的步骤。

在某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中在使所述样 品与所述正电性有机添加剂接触步骤之后进行使所述样品与所述酰脲 接触的步骤。

在某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中所述酰脲选 自尿素、尿酸、乙内酰脲、尿囊素、尿囊素氯羟铝、尿囊素羟铝、 hemocane、脲基乙内酰脲、5-脲基乙内酰脲、乙醛酰基酰脲、乙醛酸 二酰脲、2,5-二氧-4-咪唑烷基脲和嘌呤。

在某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中所述酰脲是 尿囊素。在某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中所述尿 囊素以高于0.5％(w/v)的量存在。在某些实施方案中，本发明提供 了这样的方法，其中所述尿囊素以高于约1％(w/v)的量存在。

在某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中所述酰脲是 尿酸。在某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中所述尿酸 以高于0.0025％(w/v)的量存在。在某些实施方案中，本发明提供了 这样的方法，其中所述尿酸以高于约0.01％(w/v)的量存在。在某些 实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中所述尿酸以高于约0.1％ (w/v)的量存在。在某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其 中所述尿酸以高于约1％(w/v)的量存在。

在某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中所述方法包 括使所述样品与选自有机聚合物、有机溶剂、表面活性剂和酰脲的有 机调节剂接触的额外步骤。在某些实施方案中，本发明提供了这样的 方法，其中在使所述样品与所述正电性有机添加剂接触步骤之前进行 使所述样品与所述有机调节剂接触的步骤。在某些实施方案中，本发 明提供了这样的方法，其中在使所述样品与所述正电性有机添加剂接 触步骤的基本同时进行使所述样品与所述有机调节剂接触的步骤。在 某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中在使所述样品与所 述正电性有机添加剂接触步骤之后进行使所述样品与所述有机调节剂 接触的步骤。

在某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中所述有机调 节剂是选自聚乙二醇、聚丙二醇和聚丁二醇的非离子有机聚合物。在 某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中所述非离子有机聚 合物的平均分子量为约500D或更低。

在某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中所述有机调 节剂是选自乙二醇、丙二醇、丁烯醇、二甲基亚砜、乙醇和苯氧乙醇 的有机溶剂。在某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中以 约1％(w/v)或更高的浓度提供所述有机调节剂。

在某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中所述有机调 节剂是选自吐温、triton、CHAPS、CHAPSO和辛基葡糖苷的表面活性 剂。在某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中以约1％(w/v) 或更低的浓度提供所述表面活性剂。在某些实施方案中，本发明提供 了这样的方法，其中以约0.1％(w/v)或更低的浓度提供所述表面活 性剂。在某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中所述有机 调节剂是以亚饱和量提供的酰脲。在某些实施方案中，本发明提供了 这样的方法，其中所述酰脲选自尿素、乙内酰脲和尿囊素。

在某些实施方案中，本发明提供了为方便地实施本文所公开的任意方 法提供的试剂盒，所述试剂盒包含正电性有机添加剂和足以使所述样 品过饱和的量的至少一种酰脲、有机调节剂以及抗病毒剂抗病毒剂， 其中以对于提供试剂盒所针对的样品足以方便地实施本发明的量来提 供所提供的材料。

在某些实施方案中，本发明提供了用于方便地实施本发明某些方 法的试剂盒。这样的试剂盒可提供用于实施本发明的可用试剂，例如 一种或多种多价有机阳离子、酰脲、有机调节剂、抗病毒剂，以及用 于调节电导率的试剂。所述试剂盒可提供适于实施本发明用于蛋白质 纯化的量和浓度的材料。这样的试剂盒可适用于某些蛋白质，例如IgG 抗体或IgM抗体，并且可适于适合某些级别的蛋白质制备和纯化的量。 材料可提供为即用的溶液形式、适于稀释的浓缩溶液或由使用者制备 溶液来使用的固体形式，用于实施本发明的方法。

在某些实施方案中，本发明之后可使所述样品与固体材料接触， 目的是所述固体具有在其他处理之前从所述样品选择性去除所述正电 性试剂或其他样品组分的效果。

在某些实施方案中，本发明可与常规的蛋白质纯化方法组合，以 达到更高的纯化水平或去除其他污染物。例如，本发明可结合包括沉 淀、色谱、和液体-液体萃取法在内的常规纯化方法来实施。可使这样 的其他方法与本发明组合成它们在本发明的方面之前、期间或之后进 行。本领域技术人员能够开发适于这些方法的条件，并且使其与本文 描述的发明整合以实现对产品进行期望的纯化。

在某些实施方案中，本发明允许在色谱纯化开始前降低聚集物水 平，消除后续处理步骤的负荷。可与减少聚集物一起降低DNA、内毒 素和病毒水平，这进一步减少了下游纯化步骤的负荷。在某些实施方 案中，使用有机调节剂组合正电性有机添加剂防止形成大量沉淀，并 且潜在地使根据本发明处理的样品可以直接应用于色谱柱，而无需中 间处理步骤来除去固体。这样的实施方案还可与添加非正电性有机添 加剂抗病毒试剂相容。

在某些实施方案中，运行条件可相对于pH和/或由存在的螯合剂、 有机聚合物或溶剂、表面活性剂、离液剂以及多种盐而变化，以调节 聚集物减少到的程度并且所需蛋白质保持于溶液中。

本发明的其他目的和优点将部分地记载于下面的描述中，以及部 分地通过该描述而显而易见，或者可通过实施本发明来知晓。通过权 利要求中规定的元素和组合将使本发明的目的和优点被认知和得到。

应理解，前述的一般描述和下面的详细描述二者都仅是示范性的 和解释性的，并且不限制要求保护的本发明。

发明详述

定义

定义术语以更容易地理解本发明。另一些定义记载于详细描述中。

“聚集物”是指在生理学条件下稳定的并且可在宽pH范围和电导 率条件下稳定的两个或更多个分子的结合物。聚集物常常包含至少一 种生物分子，例如蛋白质、核酸或脂质，以及另一种分子或金属离子。 所述结合通过任意类型的化学相互作用或化学作用的任意组合来发 生。抗体聚集物可分为两大类：“同质聚集物”是指两个或更多个抗体 分子的稳定结合；“异质聚集物”是指一种或多种抗体分子与一种或多 种非抗体分子的稳定结合。非抗体组分可由选自核酸、内毒素、金属 离子、蛋白质、脂质或细胞培养基组分的一种或多种实体组成。

“抗体”是指免疫球蛋白、复合物或其片段化形式。该术语可包括 但不限于衍生自人其他哺乳动物细胞系的IgA、IgD、IgE、IgG和IgM 类型的多克隆抗体或单克隆抗体，包括天然形式或遗传改造形式，例 如人源化、人、单链、嵌合、合成、重组、杂合、突变、移植以及体 外生成的抗体。“抗体”还可包括复合物形式，包括但不限于包含免疫 球蛋白部分的融合蛋白。“抗体”还可包括抗体片段，例如Fab、F(ab')₂、 Fv、scFv、Fd、dAb、Fc以及其他组合物，无论其是否保留抗原结合 功能。

“内毒素”是指在裂解后从细胞释放的存在于革兰氏阴性细菌外膜 中的有毒的热稳定的脂多糖物质。

“非离子有机聚合物”是指天然存在的或合成的包含连接重复有机 亚单位的烃，其不含带电基团。其可为直链的、主要直链带有一些分 枝的或主要分枝的。适于实施本发明的实例包括但不限于聚乙二醇 (PEG)、聚丙二醇和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。PEG具有结构式 HO-(CH₂-CH₂-O)_n-H。实例包括但不限于平均聚合物分子量范围低于 100道尔顿至高于1000道尔顿的组合物。

“正电性有机添加剂”是指携带至少一个正电荷并且可包含多个正 电荷的有机分子、阳离子或者天然的盐或合成来源的盐。所述正电性 有机添加剂还可携带负电荷，但是在这种情况下，在使用其的工作条 件下，其仍然保持净正电荷。在所述正电性有机添加剂为净正电的情 况下，其可与抗衡离子(阴离子)一起提供，例如氯离子、溴离子、 硫酸根、有机酸、乳酸根、葡糖酸根或不与所述方法相抵触的任何其 他阴离子。在某些实施方案中，由胺、亚胺或其他氮部分提供正电性 有机添加剂的某些正电荷。正电性有机添加剂还可包括疏水残基、金 属亲和残基、氢键键合残基、其他官能部分，和/或其可具有参与其他 类型的化学相互作用的能力。在某些实施方案中，正电性有机添加剂 的实例包括但不限于二氨基酸、二肽、三肽或更大的均聚或异聚肽， 例如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚组氨酸、聚鸟氨酸；聚乙烯亚胺；聚烯 丙胺；聚苄菊酯(polydimethrine)、聚甲基丙烯酰胺基丙基三甲基氨； 聚二烯丙基二甲基氨；聚乙烯基苄基三甲基氨；聚乙烯基胍；聚(N- 乙基-4-乙烯基吡啶)；DEAE-葡聚糖；DEAE-纤维素；依沙吖啶(CAS 号442-16-0；7-乙氧基吖啶-3,9-二胺)；三(2-氨基乙基)胺；胍；氯己 定；阿来西定；citricidal、鱼精蛋白；精胺；亚精胺；鲑精蛋白、壳 聚糖；以及前述物质的变体和衍生物。例如，依沙吖啶的变体和衍生 物被理解为包括9-氨基吖啶(氨吖啶)、3,6吖啶二胺(原黄素)、吖啶琐辛、 吖啶氯(酚吖啶)、吖啶橙、奎吖因、乐杀螨、吖啶酮、吖啶-9-羧酸、氯甲 氧吖啶(1-[(6-氯-2-甲氧基-9-吖啶基)氨基]-3-(二乙基氨基)-2-丙醇二盐酸 盐)、酚藏花红、吩噁嗪、吩噻嗪、吖啶黄(氯化3,6-二氨基-10-甲基吖啶 和3,6-吖啶二胺)，以及其盐(例如，氯化物、溴化物、硫酸盐、乳酸盐、 葡糖酸盐)。

“有机溶剂”是指天然存在的或合成的以液体状态存在的有机化合 物。适于实施本发明的实例包括但不限于乙二醇、丙二醇、二甲亚砜、 乙醇和苯氧乙醇。

“有机聚合物”是指有机单体的天然存在的或合成的聚合物。实例 包括但不限于聚乙二醇、聚丙二醇、葡聚糖或纤维素等。

“多核苷酸”是指由链中共价结合的多个核苷酸单体组成的聚合物。 DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)是多核苷酸的实例。

“蛋白质”是指包含碳、氢、氧、氮以及常常包含硫并且主要包含 通过肽键连接的一条或多条氨基酸链的复合有机大分子群的任意一 种，。蛋白质可为天然来源的或重组来源的。蛋白质可由非氨基酸部分 修饰，例如通过糖基化、聚乙二醇化或与另一些化学部分缀合。蛋白 质的实例包括但不限于抗体、凝血因子、酶和肽类激素。

“未溶解的酰脲”是指在特定蛋白质制备中常用的条件下包含超过 酰脲最大溶解度的量的酰脲的溶液。在某些实施方案中，本发明以高 于酰脲在样品中的溶解度的量提供具有酰脲的样品，使这样的样品处 于这样的酰脲中的一部分在样品中以未溶解的形式存在的条件下。

“表面活性剂”包括“表面活性的试剂”，例如一类一般体现疏水部 分和亲水部分的有机分子，这使其被称为两性分子。在水溶液中足够 浓度下，表面活性剂可自结合成簇，其中疏水部分浓缩于中央从而最 小程度地与水的接触，并且亲水部分向外辐射从而最大化程度地与水 接触。在存在生物学制剂尤其是包含具有疏水性质或具有疏水性面积 的材料的生物学制剂的情况下，表面活性剂的疏水部分倾向于自发地 与疏水材料的一部分结合，并通过表面活性剂亲水部分的影响来提高 所述制剂的溶解度。它们还可用于调节溶解于水性溶剂中的两种不同 疏水材料之间的发生的疏水相互作用。适于实施本发明某些实施方案 的表面活性剂实例包括但不限于，非离子表面活性剂，例如聚山梨醇 酯表面活性剂(例如，吐温20，聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯以 及吐温80，聚氧乙烯(20)山梨醇酐单油酸酯)和Triton(例如，聚乙 二醇对(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚)；以及两性离子表面活性剂，例 如CHAPS(3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲基胺基]-1-丙烷磺酸盐)，CHAPSO (3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲基胺基]-2-羟基-1-丙烷磺酸盐)，以及辛基 葡糖苷(例如，(2R,3S,4S,5R,6R)-2-(羟甲基)-6-辛氧基环氧乙烷-3,4,5- 三醇)。

“病毒”或“病毒体”是指仅在主要为细菌、植物和动物的活宿主的 细胞内复制的超显微(直径约20nm至300nm)的代谢惰性的传染剂， 其包含RNA或DNA核心、蛋白质外壳，以及(在更复杂的类型中) 周围的包膜。

在根据某些实施方案准备使用本发明的情况下，将必须选择正电 性有机添加剂。实验数据揭示，作为一般物质，正电性有机添加剂的 疏水性越低，则目的蛋白质的回收率越高。此外，疏水性越低，则可 施用正电性有机添加剂以达到有效的聚集物减少而不显著损失蛋白质 的浓度范围越宽并且越高。因此，弱疏水的PEI可视为比更疏水的依 沙吖啶或疏水性高得多的氯己定更好的候选物。然后，还必须将比产 品回收率更重要的其他问题纳入考虑。PEI体现出公知的细胞毒性， 并且难以以足够的灵敏度来检测它，以容易地验证其从通过纯化方法 路线的蛋白质制剂中去除。可优选依沙吖啶，因为其在血浆蛋白质分 级领域中以及作为抗病毒剂具有悠久的历史。此外，其亮黄色和固有 荧光有助于在给定样品中灵敏地测量其含量，从而帮助证明在实施本 方法后除去了依沙吖啶。不同的正电性有机添加剂可体现不同的二级 化学官能性，使其具有介导期望作用的能力。例如，PEI被视为主要 通过静电相互作用和氢键来结合DNA。依沙吖啶为这两种相互作用提 供较少的机会，但是已知其插入DNA。这样的差异可在一种正电性有 机添加剂的相对适用性与另一种的相对适用性之间催生微小但是有用 的差异，其凸显的点在于，评价可能表面上看起来非理想的候选物可 具有实际益处。

在评价正电性有机添加剂用于某些实施方案的使用的过程中，用 于施用所述正电性有机添加剂的条件可按照以下来研究。正电性有机 添加剂的使用对可用于实施某些实施方案中的方法的条件施加了一些 限制。例如，可期望采用基本防止正电性有机添加剂与目的蛋白质之 间强相互作用的条件。一种得到该条件的近似条件的简单方法是将目 的蛋白质施用至阴离子交换剂，并在盐梯度中进行洗脱。刚刚高于所 述蛋白质主要洗脱所处的阈值的盐浓度鉴定为可最有效实施所述方法 的最小电导率。该浓度将受到pH的影响，这可通过相同的方法来建 模。如果该方法应用于细胞培养物上清，对于IgG抗体可不需要添加 盐或改变pH以避免显著的损失。对于IgM抗体可需要添加盐，甚至 添加至是电导率接近30mS/cm(约为生理学电导率的2倍)。在某些 涉及使用未溶解的酰脲和正电性有机添加剂的实施方案中，可在低于 生理学电导率的条件下进行IgG的应用，潜在地包括1mS/cm或更低 的值，在这种情况下，可结合解离聚集物来去除大量宿主蛋白质。这 样的使用可要求正电性有机添加剂的浓度提高至弥补通过结合至宿主 蛋白质而损失的量。在这样的环境下，更低的运行电导率还可提高对 DNA、内毒素和病毒的去除。在某些实施方案中，本发明将一般支持 高于95％，并且常常为98％至99％的抗体回收率。通常应在添加酰脲 或正电性有机添加剂之前建立样品的电导率和pH条件。

在某些实施方案中，与由离子相互作用介导的大多数过程相反， 建议对实施本发明的条件评价具体包括并且潜在地倾向于基本高于实 际最小值的电导率值。显著低于生理学电导率的条件，特别是当施用 于诸如细胞培养物上清等粗制品，可促使正电性有机添加剂与酸性蛋 白质的强相互作用，这潜在地产生至少两种不期望的结果，一种是这 样的条件可促使沉淀形成。另一种是，正电性有机添加剂的子群体被 酸性蛋白质和/或沉淀螯合将降低剩余的正电性有机添加剂的有效浓 度，具有限制本发明降低聚集物含量的潜在效果。作为一个一般问题， 高至3倍生理学值的电导率值将支持有效聚集物的减少，并且抗体回 收率高于90％。

在某些实施方案中，并且与针对由离子相互作用(尤其是生物分 子和正电性有机添加剂之间的离子相互作用)介导的大多数过程的建 议相反，可降低pH，甚至降至低至4或更低的值。这样的极限条件几 乎是不必需的，并且可能比中性pH值要求更高的电导率以维持的蛋 白质溶解度。

在某些实施方案中，一种评价用于经澄清的包含IgG单克隆抗体 的细胞培养物上清的条件的有效方法是覆盖0.005％至0.05％正电性有 机添加剂的范围，以及从生理学值至2倍生理学值范围的电导率。所 述范围还可按需要进一步扩展或缩窄。在这些范围内观察到沉淀的情 况下，经常可通过将电导率提高至高至3倍生理学值而不降低聚集物 的减少。这对应于约45mS/cm。更高的电导率也可起作用。在添加正 电性有机添加剂之前调节样品的电导率一般将是有利的。

在某些实施方案中，用于根据本发明开发针对经澄清的细胞培养 物上清的纯化方法的适当起点是使用0.02％依沙吖啶。未澄清的包含 细胞的收获物将很可能受益于使用更高浓度，因为细胞可结合至足够 的正电性有机添加剂，从而降低可用于异质聚集物解离的量。在应用 于包含细胞的制剂的情况下，本发明的第二益处是其大幅加快了细胞 和碎屑的沉淀，利于它们的去除。在本发明应用于包含细胞的制剂的 情况下，可建议维持近生理学条件以避免过量的细胞死亡率和/或细胞 内容物释放至制剂中。

在某些实施方案中，通过在添加正电性有机添加剂之前将有机调 节剂分散于细胞制剂中来起始可为有利的，因为该实践可改善抗体回 收率。在添加正电性有机添加剂之前进行长时间孵育使不必要的；15 分钟或更短即足够，尽管长时间孵育未表现出缺点。实验数据一般显 示，当在正电性有机添加剂之前以约1％过度饱和的量添加尿囊素提高 IgG的回收率。

在某些实施方案中，建议在将正电性有机添加剂添加于样品前， 将所述正电性有机添加剂阳离子溶解于例如水或缓冲液中，以利于其 快速遍布于蛋白质制剂中。应警惕避免持续的局部过量，例如通过将 溶解的正电性有机添加剂逐渐灌注至充分混合的混悬剂中。孵育时间 应至少为15分钟，优选30分钟，但长于60分钟的时间未表现出显著 的益处。

所述方法一般可在环境温度下实施，但是还可在更高或更低的温 度下进行，例如4℃至37℃。实验数据显示，温度基本不改变所得结 果，这将使蛋白质的稳定性要求成为选择运行温度的决定因素。

在某些实施方案中，将正电性有机添加剂溶解或分散于例如水或 缓冲液中，并且在将其添加至样品前调解pH。这是因为，某些正电性 有机添加剂，尤其包括阳离子组合物，是极度碱性的，并且具有以未 预料到的方式大幅改变实验条件的可能性。

在某些涉及使用超饱和酰脲和正电性有机添加剂二者的实施方案 中，一般可有利的是，通过在添加正电性有机添加剂之前将所述酰脲 分散于细胞制剂中来起始可为有利的，因为使用酰脲尿囊素的经验显 示该实施可改进抗体回收率。在添加正电性有机添加剂之前进行长时 间孵育是不必要的；15分钟或更短即足够，尽管长时间孵育未表现出 缺点。

在某些实施方案中，期望选择有机调节剂和正电性有机添加剂以 开始确定哪种组合或运行条件将最适于具体的应用的方法。可通过以 下知识来辅助所述选择：所述正电性有机添加剂的特性至少部分的确 定最适有机调节剂，或有机调节剂的工作浓度，和/或反之亦然。在一 般情况中，针对某些实施方案，正电性有机添加剂越疏水，则对具有 强的弱化疏水相互作用的能力的有机调节剂的要求越高，或者以更高 的浓度使用较低疏水的调节剂。这过于简单化，因为调节还涉及氢键， 并且可预期到不同的正电性有机添加剂和不同的有机调节剂具备疏水 相互作用和氢键键合能力的不同平衡，但是这仅是举例说明该设想。 因此，在一些例子中，弱疏水的PEI可为优选的，因为其使用最小浓 度的温和有机调节剂得到良好的结果，但是由于其已知的细胞毒性以 及难以以足够的灵敏度检测PEI来容易地验证通过纯化方法的过程从 蛋白质制剂中去除，所以PEI较低优选。在一些例子中，强疏水性的 依沙吖啶可为较低优选，因为其倾向于使与其相互作用的材料沉淀， 但是，依沙吖啶可为优选，因为其在血浆蛋白质分级领域中以及作为 抗病毒剂的悠久历史。此外，其亮黄色和固有荧光有助于在指定样品 中灵敏地测量其含量，从而帮助证明在实施本方法后除去了依沙吖啶。 可通过适当浓度的合适有机调剂来弥补依沙吖啶的结合/沉淀倾向。氯 己定的更高疏水性将还需要更高程度的调节，但是该选择可因其在 280nm处的强UV吸收而不被鼓励。

存在多种选择用于监测通过所述方法实现的聚集物的解离或去 除，无论是在研发方法时还是在生产中。最简单的是在具有合适选择 性的柱子上进行分析性体积排除色谱，并在280nm UV波长处进行监 测。这可揭示HMW(高分子量)聚集物，因为它们常常具备适度符 合非聚集产物的多种尺寸的流体动力学尺寸。异质聚集物通常被该方 法所忽视，因为它们的流体动力学尺寸可仅比非聚集产物的流体动力 学尺寸高一点点。在这种情况下，可通过计算254nm处的UV吸收度 与280nm处的吸收度的比率来揭示聚集物的异质组合物，然后将该值 与被视为完全不含结合的污染物的经纯化的蛋白质的吸收度比率进行 比较。将通过升高的254/280比率来揭示包含例如DNA等的异质聚集 物。如果色谱提供相应能力的话，可同时在365nm处监测依沙吖啶含 量。这可有助于证明通过后续的纯化方法来去除依沙吖啶。还可使用 多波长监测与其他色谱方法相结合。

在某些实施方案中，可使本发明与在后续纯化之前去除样品中的 正电性有机添加剂和可能的其他组分的处理整合。这样的处理可包括 使样品暴露于携带性质与正电性有机添加剂的性质互补的化学部分的 固体，以期它们使正电性有机添加剂从样品剩余物除去。

在某些实施方案中，可使本发明与一种或多种纯化方法整合，所 述纯化方法包括蛋白A和其他形式的生物学亲和色谱、阴离子交换色 谱、阳离子交换色谱、疏水相互作用色谱、固定化的金属亲和色谱、 羟磷灰石或其他混合模式的色谱，和/或非色谱法，例如沉淀和液体- 液体萃取。处于本领域技术人员的视界范围内的是，开发适于所述多 种方法的条件，并且使其与本发明整合以达到特定抗体的必需纯化。

在某些实施方案中，必须选择至少一种酰脲用于评价其在实施本 发明中的用途。尿酸是几乎不溶的，其优点是在去除未溶解的尿酸后， 经处理的蛋白质制剂中几乎不存在尿酸，但是溶解的尿囊素表现出调 节正电性有机添加剂的效果，并且通常支持更高的抗体回收率。对于 正电性有机添加剂的选择，依沙吖啶提供了几个引人注意的特征，特 别是其在血浆蛋白分级领域以及作为抗病毒剂的悠久历史。其还插入 DNA，并强结合至内毒素。此外，其亮黄色和固有荧光有助于在指定 样品中灵敏地测量其含量，从而帮助证明在实施本方法后除去了依沙 吖啶。

在某些实施方案中，酰脲和正电性有机添加剂的期望浓度将受到 其所用于处理的蛋白制剂的组成的影响。对于澄清的细胞培养物上清， 便利的起始点是1％尿素和0.02％依沙吖啶。这两者皆可实验性地改 变，以微调提供期望结果的量。本发明在包含细胞的细胞培养物收获 物中的应用将很可能需要更大量的酰脲和正电性有机添加剂二者。实 验数据特别指示，在某些实施方案中，可需要更高量的尿囊素以达到 过饱和，并且可需要更高量的依沙吖啶以弥补细胞表面上损失的量。 实验可有助于鉴定该二者的适当的有效量。在某些实施方案中，本发 明提供了有价值的益处，通过解离聚集物而非除去聚集物来提高抗体 的回收率，在非常高细胞密度的培养物产生大比例的聚集抗体的情况 下尤其有益。这进而使得能够从极度高产的细胞培养物中纯化蛋白质， 其结果大幅改善了产量以及生产/纯化方法的总体经济效益。本发明的 另一个益处是，其大幅加速了细胞核碎屑的沉淀，有利于它们的去除。

来自差示扫描量热的数据指示，35mM(近饱和的)尿囊素对IgG 具有降低IgG热转变温度的效果，其量为用35mM尿素降低热转变温 度的量的约一半。这指示，具有尿囊素的蛋白质变性的风险是零。还 指示，与仅用正电性有机添加剂实现的那些病毒失活水平相比，尿囊 素与正电性有机添加剂的组合可提高病毒失活水平，其中除了由未溶 解的酰脲结合病毒之外，还表现出发生这样的病毒失活。

实施例

实施例1.用于减少HMW聚集物和解离异质聚集物的正电性有 机添加剂的比较。通过在200mM精氨酸、10mM EDTA、50mM MES、 pH 6.5的缓冲液中进行体积排除色谱来分析包含单克隆IgM的澄清的 细胞培养物上清。所述材料包含11％HMW聚集物，并且IgM峰值表 现出0.506的254/280比率，这指示存在大量异质聚集物。通过添加氯 化钠将上清的电导率提高至20mS/cm。用0.01％、0.05％和0.1％的 PEI-1200；0.01％、0.05％和0.1％的依沙吖啶；以及0.01％、0.05％和 0.1％的氯己定处理9个样品，孵育30分钟，然后通过SEC分析(结 果如下)。在分析前沉淀0.1％氯己定样品。将所述样品孵育30分钟， 然后通过SEC分析。仅依沙吖啶消除HMW聚集物。其还支持有效的 异质聚集物解离。PEI在所有浓度下都提供高于97％的回收率，并且 异质聚集物解离良好，但是异质聚集物的减少不良。氯己定大致在依 沙吖啶与PEI之间。

实施例2.用于减少HMW聚集物和解离异质聚集物的正电性有 机添加剂的比较。用另一种抗体重复实施例1的形式。该抗体表现出 7.5％的HMW聚集物，以及更低的异质聚集物含量。趋势与实施例1 基本相同，但是具有明显差异，这似乎归因于该抗体的性质。参见下 文。

实施例3.更高电导率的影响。在40mS/cm的上清电导率下重复 实施例2的依沙吖啶系列。与在20mS/cm下相比，未处理的对照中 HMW聚集物水平和异质聚集物水平都更低。HMW聚集物倾向于以同 样的方式与依沙吖啶浓度相反，但是异质聚集物倾向于相反方向，同 时回收率更低。

实施例4.确定用于降低包含单克隆IgM的细胞培养物上清中 DNA-抗体异质聚集物的水平的工作浓度。羟磷灰石色谱示出，单克隆 IgM克隆85与DNA重度复合。这通过IgM峰在254nm处的UV吸 收大致等于其在280nm处的UV吸收揭示。不含DNA的IgM的 280/254比率为约2:1。设置了一个实验，其中使10mL包含单克隆IgM 的澄清的细胞培养物上清样品与正电性有机添加剂PEI-1300和酰脲尿 囊素的不同组合进行组合，以确定使DNA从IgM解离的最有效组合。 该样品最初由于存在污染物而呈现棕褐色，并且轻度浑浊，指示存在 沉淀。通过直接添加干燥尿囊素粉末来使所有样品被尿囊素饱和。所 有包含尿囊素的样品在外观上是稠乳状的。通过用乙酸将50％ PEI-1300(Sigma)滴定至pH 7.0并添加水至PEI终浓度为10％来制 备PEI储存溶液。将PEI添加至样品中以得到最终浓度2％、1％、0.5％、 0.025％、0.0125％和0.00625％。制备了不含PEI但包含尿囊素的实验 对照。制备了具有0.05％PEI并且不含尿囊素的另一个对照。在后一 个对照中，浊度仍然未改变，指示PEI-1300不能单独引起DNA或其 他样品组分大幅沉淀。通过0.22μm的膜过滤每批样品。样品容易过 滤，并且在处理后显示为光学澄清的。这是本发明的特别的特征。将 每批样品施加在羟磷灰石柱上(CHT型II，40μm，1mL，5×50mm， 1mL/分钟)，柱子用50mM Hepes，pH 7.0平衡；用50mM Hepes、2 M NaCl、pH 7.0洗涤；重平衡至初始条件；用10倍柱体积(CV)的 线性梯度至pH 7.0的250nM磷酸钠洗脱；然后用pH 7.0的500mM 磷酸盐进行清洗。仅含PEI的样品示出部分解离。在清洗步骤中洗脱 出非常大的DNA峰。仅含尿囊素的样品示出更低的复合DNA减少， 但是在清洗峰中洗脱出非常少的DNA。从所有经PEI/尿囊素处理的样 品洗脱的IgM得到理想的280/254比率，这指示，基本上使所有DNA 从IgM解离，在清洗步骤中仅洗脱出可忽略量的DNA。将从使用1％ PEI的实验中收集的羟磷灰石分级的IgM施用于分析型SEC柱。经估 计，所述IgM纯度高于95％，并且未显示出残余DNA。该实施例举 例说明了本发明能够通过一般因在进料中存在高DNA水平而无效的 方法进行有效的产物捕获的能力。还揭示，正电性有机添加剂与氢供 体/受体的组合可实现在对正电性有机添加剂具有高亲和力的DNA与 对正电性有机添加剂具有高亲和力但是亲和力比DNA低的产物之间 进行精细区分。该实验还得到了对本技术价值的深刻见解和例子。基 于仅PEI处理的DNA峰大致是未处理样品上的DNA峰的两倍大。这 显示，在初始样品中大致一半DNA包含于与蛋白质的异质聚集物中， 并且这凸显了使其解离的重要性。该实例还凸显了本方法实现高度不 同寻常的和期望的达到完全透明的生物学样品的结果。存在许多方法 用于澄清细胞培养物上清，但是所有这些方法都使样品留有不同程度 的浑浊，并且该浑浊经常具有干扰后续纯化方法的可能。用所述方法 处理的溶液的突出的透明度凸显了其与其他方法的不同，尤其在结合 未溶解的尿囊素来进行的情况下更如此。

实施例5.确定优选的添加顺序。进行实验，其中用0.025％的 PEI-1300和饱和尿囊素处理两份实施例4中描述的抗体。在第一个实 验中首先添加PEI，在另一个实验中首先添加尿囊素。如上文所述过 滤样品，并将其施用于羟磷灰石柱。来自先添加尿囊素的处理的IgM 峰大致是来自先添加PEI处理的峰的两倍。这些结果凸显了添加顺序 对使产物回收率最大化的重要性，并且还凸显了尿囊素调节正电性有 机添加剂与蛋白质之间的相互作用的能力。

实施例6.确定孵育时间。进行实验，其中在添加PEI之前使尿囊 素孵育1分钟至30分钟，并且在添加PEI后过滤前孵育1分钟至30 分钟。羟磷灰石柱上IgM峰不表现280/254比率或尺寸方面的趋势。 这提示，DNA解离和去除的动力学是快速的。

实施例7.通过整体柱整体柱上的空间排阻色谱来纯化IgM。如上 文所述，用1％的PEI-1200和饱和尿囊素处理IgM-B07细胞培养物上 清的样品。用50mM Hepes，100mM NaCl，10mM EDTA，10％聚乙 二醇-6000，pH 7.0平衡8mL的羟基整体柱(BIA Separations)。将经 处理的IgM上清施用于10％的PEG；用平衡缓冲液洗涤，然后用3.75 CV线性梯度至50mM Hepes，100mM NaCl，pH 7.0洗脱。随后对未 处理的样品进行色谱，用于参考。未处理的参考样品的洗脱峰宽、拖 尾、稀薄、混乱。经处理的样品的洗脱峰尖锐、对称、压缩、光学清 楚，与聚集物的拖尾峰解析良好。分析型SEC示出，在仅该单一的色 谱步骤后，来自经处理样品的IgM的纯度高于95％，并且不含聚集物。

实施例8.酶促消化的DNA的DNA去除。先用全能核酸酶 (benzonase)处理单克隆IgM克隆A4，以将DNA消化成片段。然后 用饱和尿囊素和0.01％的PEI-1300处理，以使异质聚集物解离。去除 沉淀，并通过空间排阻色谱分级样品。DNA基本不存在于经洗脱的抗 体中，这指示，本发明用于去除小DNA片段的有效性等同于其用于 去除大DNA的有效性。

实施例9.用依沙吖啶替换PEI-1300，重复实施例4的形式。据 发现，依沙吖啶产生相似的结果，但是提供了更窄的动力学范围。抗 体回收率与低至0.00625％的依沙吖啶浓度成反比例。DNA解离的效 率与0.001％至0.00625％的依沙吖啶浓度成比例。

实施例10.用氯己定解离IgM-DNA复合物。将包含IgM 85的经 过滤的细胞培养物上清施用至强的多孔阴离子交换颗粒树脂(EMD  TMAE)和以线性梯度至1M NaCl(pH 7.0)分级。尽管已知具有高 DNA含量，但是DNA峰表现为体现总DNA的约2％。在254nm处 的峰吸收度升高，处于洗脱IgM和DNA之间，示出剩余的DNA存在 于异质聚集物中。用饱和尿囊素处理的IgM 85样品示出异质聚集物量 的小但是明确的降低以及相应的DNA峰升高。以0.001％至1％的水平 将氯己定添加至尿囊素饱和的样品中，并将经处理的样品施用至阴离 子交换剂。异质聚集物解离，并且在0.1％至1.0％的氯己定中DNA被 清除。在低浓度下复合物仅部分解离，并且DNA降低极小。在1％和 0.5％的氯己定中观察到严重的抗体损失。这些结果示出，虽然在存在 饱和尿囊素的条件下氯己定对异质聚集物解离和DNA去除有效，但 是，其有效范围比PEI-1300或依沙吖啶要更高并且更窄。该实施例还 举例说明实现了阴离子交换色谱借助已预先去除DNA的本发明而作 为IgM捕获方法。与实施例4相比，其证实实现了羟磷灰石作为IgM 捕获方法。

实施例11.如通过以上实验揭示，提高正电性有机添加剂的疏水 性，例如在PEI、依沙吖啶、氯己定的系列中，导致窄化可用的动力 学范围，并且提高了目的蛋白质的损失。对与0.02％的依沙吖啶或 0.02％的PEI-1300组合的1％的尿酸和1％的尿囊素进行实验比较。对 于与这两种酰脲组合的PEI，以及对于与尿囊素组合的依沙吖啶，IgM 回收率相等，但是对于尿酸与依沙吖啶组合，IgM回收率降低至约 94％。这些结果解释为指示在未溶解的溶液中的饱和组分尿囊素(约 36mM)修饰依沙吖啶与抗体的相互作用。各处理之间的聚集物的解 离相等。如在上述实验中，SEC还揭示了抗体峰的表观尺寸因处理而 降低。这通过洗脱时间的轻微但是明确的增加来观察到，其通过重叠 谱来清晰地揭示。并行的254/280比率降低指示，尺寸的变化是由于 254为主的污染物与抗体结合的去除。

实施例12.将尿囊素和依沙吖啶添加至包含细胞的液体培养基 中。从震荡烧瓶中收集1.5L杂交瘤液体培养基。将电导率调节至25 mS/cm，并将尿囊素和依沙吖啶添加至液体培养基中，使浓度分别为 1％(w/v)和0.02％(w/v)，并在室温下充分混合20分钟。通过离心 使混合物澄清，并通过分析型SEC分析。在该早期阶段，未观察到异 质聚集物，并且IgM峰的254/280峰高度比为1:2，这显示IgM基本 上不含DNA污染物。该实施例示出，可将DNA去除和聚集物解离与 细胞去除整合。

实施例13.确定用于降低包含单克隆IgM的细胞培养物上清中 DNA-抗体异质聚集物的水平的工作浓度。羟磷灰石色谱示出，单克隆 IgM克隆85与DNA重度复合A。这通过IgM峰在254nm处的UV 吸收大致等于其在280nm处的UV吸收揭示。不含DNA的IgM的 280/254比率为约2:1。设置了一个实验，其中使10mL包含单克隆IgM 的澄清的细胞培养物上清样品与正电性有机添加剂PEI-1300和1M尿 素的不同组合进行组合，以确定使DNA从IgM解离的最有效组合。 该样品最初由于存在污染物而呈现棕褐色，并且轻度浑浊，指示存在 沉淀。通过用乙酸将50％PEI-1300(Sigma)滴定至pH 7.0并添加水 至PEI终浓度为10％来制备PEI储存溶液。将PEI添加至样品中以得 到最终浓度2％、1％、0.5％、0.025％、0.0125％和0.00625％。添加干 燥的尿素至浓度1M。制备不含PEI但是包含1M尿素的实验对照。 制备具有0.05％的PEI但是不含尿素的另一个对照。在后一个对照中 浊度保持不变。通过0.22μm的膜过滤每批样品。将每批样品施加在 羟磷灰石柱上(CHT型II，40μm，1mL，5×50mm，1mL/分钟)， 柱子用50mM Hepes，pH 7.0平衡；用50mM Hepes、2M NaCl、pH 7.0 洗涤；重平衡至初始条件；用10倍柱体积(CV)的线性梯度至pH 7.0 的250nM磷酸钠洗脱；然后用pH7.0的500mM磷酸盐进行清洗。仅 含PEI的样品示出部分的异质聚集物解离，但是在清洗步骤中的非常 大的DNA峰显示，并没有大量的异质聚集物解离。仅含尿素的样品 示出较低的异质聚集物减少，以及在清洗峰中较少的DNA。从所有经 PEI/尿素处理的样品洗脱的IgM得到高于2.0的280/254比率，这指示 基本完全的异质聚集物解离，在清洗步骤中仅有可忽略量的DNA洗 脱。将从使用1％PEI的实验中收集的羟磷灰石分级的IgM施用于分 析型SEC柱。经估计，所述IgM纯度高于95％，HMW聚集物低于 0.2％，并且没有明显的异质聚集物。回收率为98％至99％。该实施例 举例说明了本发明能够通过一般因在进料中存在高DNA水平而无效 的方法进行有效的产物捕获的能力。与为处理的样品相比，这些结果 凸显了重点，即，初始样品中的大部分DNA包含于与抗体和其他蛋 白质的异质聚集物中。

实施例14.确定优选的添加顺序。进行实验，其中用0.025％的 PEI-1300和1M尿素处理两份实施例14中描述的抗体。在第一个实 验中首先添加PEI，在另一个实验中首先添加尿素。如上文所述过滤 样品，并将其施用于羟磷灰石柱。来自先添加尿素的处理的IgM峰大 致是来自先添加PEI处理的峰的两倍。这些结果凸显了添加顺序对使 产物回收率最大化的重要性，并且还凸显了尿素调节正电性有机添加 剂与蛋白质之间的相互作用的能力。

实施例15.通过整体柱上的空间排阻色谱来纯化解复合的IgM。 用1％的PEI-1200和10％的丙二醇处理IgM-B07细胞培养物上清的样 品。用50mM Hepes，100mM NaCl，10mM EDTA，10％聚乙二醇-6000， pH 7.0平衡8mL的羟基整体柱(BIA Separations)。将经处理的IgM 上清施用于10％的PEG；用平衡缓冲液洗涤，然后用3.75CV线性梯 度至50mM Hepes，100mM NaCl，pH 7.0洗脱。随后对未处理的样 品进行色谱，用于参考。未处理的参考样品的洗脱峰宽、拖尾、稀薄、 混乱。经处理的样品的洗脱峰尖锐、对称、压缩、光学清楚。分析型 SEC示出来自经处理样品的IgM纯度高于95％，HMW聚集物低于 0.1％，并且没有明显的异质聚集物。

实施例16.用氯己定解离IgM异质聚集物。将包含IgM 85的经 过滤的细胞培养物上清施用至强的多孔阴离子交换颗粒树脂(EMD  TMAE)和以线性梯度至1M NaCl(pH 7.0)分级。尽管已知具有高 DNA含量，但是DNA峰表现为体现总DNA的仅约2％。在254nm 处的峰吸收度升高，处于洗脱IgM和DNA之间，示出剩余的DNA存 在于异质聚集物中。经1M尿素(无氯己定)处理的IgM 85样品示 出异质聚集物量的小但是明确的降低以及相应的DNA峰升高。以 0.001％至1％的水平将氯己定添加至1M尿素样品中，并将经处理的 样品施用至阴离子交换剂。在0.1％至1.0％的氯己定中异质聚集物解 离并且DNA被清除。在低浓度下异质聚集物仅部分解离，并且DNA 降低极小。在0.5％和1％的氯己定中观察到严重的抗体损失。这些结 果示出，虽然氯己定对HMW聚集物的去除以及异质聚集物的解离有 效，但是，其有效范围比PEI-1300或依沙吖啶要更高并且更窄。该实 施例还举例说明实现了阴离子交换色谱借助已预先去除DNA的本发 明而作为IgM捕获方法。与实施例14相比，其证实实现了羟磷灰石 作为IgM捕获方法。

实施例17.病毒和DNA的减少。用1％的尿囊素和0.025％的依沙 吖啶处理包含鼠白血病病毒(MuLV)、小鼠微小病毒(MVM)和中国 仓鼠卵巢(CHO)细胞活样品的细胞培养物。所有实验在生理学条件 下进行。MuLV减少了1.6log。MVM减少了3.1log。CHO培养物中 的DNA减少了2.1log。经0.025％依沙吖啶不含尿囊素处理的样品的 平行系列更低效，MuLV降低1.3log，MVM降低1.4log，并且DNA 降低1.6log。

本领域技术人员将理解，如何将来自例如上面的实施例中描述的 实验的结果按比例放大或按比例缩小至所需体积以满足其具体需求。

文中引用的所有文献都通过引用整体并入，并用于所有目的，其 程度跟具体地并且单独地指定每个单独的出版物或专利或专利申请过 引用整体并入用于所有目的一样。在通过引用并入的出版物和专利或 专利申请与本说明书中包含的内容相抵触的情况下，本说明书意图替 代这样的抵触材料和/或比其优选。

表达成分的量、色谱条件的所有数字及其因此在说明书和权利要 求中的使用应被理解为在所有情况下都由术语“约”所修饰。因此，除 非另有说明，否则记载于说明书以及所附权利要求书中的数字参数是 可根据由本发明意图得到的期望性能而变化的近似值。

对本领域技术人员显而易见的是，可对本发明进行多种改造和变 化而不脱离其精神和范围。仅以示例的方式提供本文描述的具体实施 方案，并且这些实施方案不旨在以任何方式进行限制。意图将说明书 和实施例视为仅示例性的，本发明的真实范围由所附权利要求指示。