一种蔓越莓中原花青素提取物的制备方法

摘要

本发明公开了一种蔓越莓中原花青素提取物的制备方法，包括以下步骤：步骤（1）：取蔓越莓果实，粉碎；和步骤（2）：加入pH值为1.0-3.0、质量分数为65-85%的乙醇溶液，30-60℃下逆流提取4-6h，过滤后合并收集滤液，浓缩，得蔓越莓原花青素提取物。本发明采用逆流提取法，能够更加充分地对原花青素成分进行提取，与现有技术方法相比具有原料处理更加容易、节省溶剂、提取效率高、成本低等特点，适于工业化生产。

说明书

技术领域

本发明涉及植物有效成分提取技术，特别涉及一种蔓越莓中原花青素 提取物的制备方法。

背景技术

原花青素(Proanthocyanidins，PACs)是植物王国中广泛存在的一大类多 酚化合物的总称，起初统归于缩合鞣质或黄烷醇类，随着分离鉴定技术的 提高和对此类物质的深入研究，现已成为独树一帜的一大类物质，并称之 为原花青素。原花青素(PACs)是黄烷-3-醇(flavan-3-ols)或黄烷-3，4-二醇的 聚合物，也称缩合鞣质。即黄烷单体通过C-C键和C-O酯键连接成的聚合 物。在可食用植物中，黄烷单体之间主要通过B型键合(B-type  linkage)[C4-C8，和C4-C6]和A型键合(A-type linkage)[C4-C8和C2-O-C7] 方式连接聚合，聚合度可为二聚体、三聚体、直至十聚体以上。原花青素 (PAs)已被证实具有多种生物学功能，如抗细菌黏附性、抗氧化性、抗肿瘤 性等，具有广阔的应用前景。

原花青素广泛存在于天然植物中，如葡萄、沙棘、松树皮及越橘类植 物中。目前报道的原花青素分离提取方法多针对我国产量较高的植物，如 葡萄、松树皮等。其中蔓越莓虽原产于北美，但目前已在我国培育成功， 其产业化种植指日可待；另外我国也有其他越橘类植物的天然资源，因此 从越橘类植物，尤其是蔓越莓中提取原花青素有广阔的市场前景。并且越 橘类植物中的原花青素由于其独特的结构，尤其是其所具有的A型键合 (A-type linkage)结构，使具有较强的抗黏附作用。但目前针对越橘类植物， 尤其是蔓越莓，提取分离原花青素的报道较少，已有的也要经过复杂的分 离提取过程。如发明专利(专利号96192723.2)和文献(Phytochemistry， 2005(66)：2281.)所述，前者使用蔓越莓果粉分离原花青素，需经过繁琐的 原料处理过程，二者都需经两次柱层析，成本高、过程复杂。

发明内容

本发明的所要解决的技术问题是提供一种蔓越莓中原花青素提取物 的制备方法，本发明采用逆流提取法，能够更加充分地对原花青素成分进 行提取，与现有技术方法相比具有原料处理更加容易、节省溶剂、提取效 率高、成本低等特点，适于工业化生产。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种蔓越莓中原花青 素提取物的制备方法，包括以下步骤：

步骤（1）：取蔓越莓果实，粉碎；和

步骤（2）：加入PH值为1.0-3.0、质量分数为65-85%的乙醇水溶液， 30-60℃下逆流提取4-6h，过滤后合并收集滤液，浓缩，得蔓越莓原花青素 提取物。

本文所述“浓缩”为低温真空浓缩，其温度控制在10~20℃。浓缩的 程度是：使所得最终的蔓越莓原花青素提取物的固形物含量控制在其重量 的0.4%~1%。

优选地，在所述步骤（2）中，加入PH值为1.0、质量分数为85%乙 醇水溶液，在40℃下逆流提取6小时。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：

（1）本发明采用逆流提取法，能够更加充分地对原花青素成分进行 提取，与现有技术方法相比具有原料处理更加容易、节省溶剂、提取效率 高、成本低等特点，适于工业化生产。

（2）本发明制备得到的蔓越莓原花青素提取物在减少嗜酸粒细胞方 面显示出较好的效果，即其可以有效地用于预防和治疗由过多的嗜酸粒细 胞而引起的各种疾病。

（3）本发明制备得到的蔓越莓原花青素提取物可以作为细胞凋亡诱 导剂、抗过敏、抗炎和保健食品。

附图说明

图1是乙醇的质量百分数（%）与浸出液原花青素含量(mg)的关系图。

图2是接触时间（h）与浸出液原花青素含量(mg)的关系图。

图3是温度(℃)与浸出液原花青素含量(mg)的关系图。

图4是本发明一种蔓越莓中原花青素提取物的制备方法使用的装置的 示意图。

具体实施方式

一、提取工艺条件考察

1、浸出条件实验

（1）乙醇质量百分数对原花青素化合物浸出效果的影响

工业生产中，由于原料中常含有一定的水分，乙醇经循环使用后亦含 有一定水分，乙醇质量百分数对原花青素化合物的浸出存在很大的影响， 故以不同质量百分数乙醇水溶液对原花青素物质进行浸出实验，以原花青 素含量跟踪分析。在乙醇质量百分数对从原料中浸出原花青素的影响实验 中,分别取5份原料，每份50.00g,进行实验,以不同质量百分数、PH值为 1.0的乙醇水溶液各200.00ml,浸提6h,比较所得原花青素的量；同时比较 乙醇质量百分数对浸出后的固液分离及渣含量的影响，其结果如图1和表 1所示。

由图1可知，相同条件下，浸出能力强弱依次为85％>80％>75％>70 ％>65％，因此，选择85％乙醇水溶液作为浸出剂。

（2）接触时间对原花青素化合物浸出效果的影响

分别取6份原料，每份50.00g，各加入质量百分数为85％、PH值为 1.0的乙醇水溶液200.00ml进行浸出，接触时间分别为1h，2h，3h，4h， 5h，6h，其浸出结果如图2所示。

由图2可知，室温下（26℃），浸出时间为6h，浸出反应基本达到平 衡；延长浸出时间，浸出率基本不变。

（3）温度对原花青素化合物浸出效果的影响

分别取6份原料粉料，每份50.00g，各加入200.00ml质量百分数为 75％、PH值为1.0的乙醇水溶液，在不同的温度下浸出，浸出时间为2h， 取样检测浸出液中蔓越莓原花青素含量，结果如图3所示。

由图3可知，随着浸出温度的增加，原花青素的浸出率也相应的增加； 在温度达到40℃时，增加温度，原花青素的浸出率增加趋于缓慢。

2、四段逆流渗漉法（工艺简图见图4）

共安装了6根ф25.4mm×1000mm玻璃括口管，做为四段逆流渗漉浸 出实验的浸出器(浸出柱)，其中四根运行，两根做周转用。每根柱中装入 150.00g蔓越莓原料粉碎料（简称原料，以下同），用计量泵将浸出剂 （65-85%乙醇水溶液），以约5ml·min^-1的流量打入第一根浸出柱中，乙醇 液以约1cm·min^-1速度渗漉，当第一柱流出450ml浸出液后，将第一柱与 第二柱接通。计量泵打入的新浸出剂经第一柱，流出进入第二柱；与上相 同，当第二柱流出450ml黑色浸出液后，将第二柱与第三柱接通。依此类 推，等到第四根柱流出450ml流出液后，将第四根柱与第五根柱接通。同 时，将计量泵出口管从第一柱上端移至第二柱上端与第二柱接通（第一柱 从系统中撤出）。此时，新的浸出剂，经计量泵进第二柱，经三、四、五 柱后，从第五柱流出，同样取450ml浸出液；此后，新浸出剂进第三柱， 从第六柱出浸出液。依此类推，不断循环进行四段逆流渗漉浸出实验至达 到浸出平衡。本试验中第九柱开始至第十二柱止，这四根柱流出的浸出液 已近似平衡时的浸出液，故当新的浸出剂从从第九根柱进，经十、十一、 十二柱，而从第十二柱下流出450ml黑色浸出液后，停止浸出试验。将九、 十、十一、十二柱流出的浸出液取样，送检，测定原花青素的含量。（注： 柱体均为循环使用，九，十，十一，十二仅代表标号，不具实际意义）

3、四段逆流渗漉浸出试验结果

如上述的逆流法进行试验。每份样品为150.0g，以85%乙醇为浸出液， 40℃下浸提6h，液固比为5。取九、十、十一、十二柱流出的浸出液进行 测定，其结果如表1所示。

表1四段逆流渗漉浸出试验结果

从表1可知，蔓越莓中原花青素平均得率为0.05%（以原花青素计）。

原花青素检测方法为：

采用HPLC法检测，标准品为儿茶素，色谱柱为C18亲脂性柱，流动 相A项为0.4％磷酸、B项为95％甲醇和5％0.4％磷酸，流量为1ml/min， 进样量为10μl，柱温为30℃，检测波长为280nm；

洗脱梯度为：

0—38min：79％A21％B到35％A65％B的双溶剂线性梯度；

38—60min：35％A65％B；

60-70min：100％的甲醇。

二、实施例：以下通过具体实施例，对本发明作进一步的详细描述。

实施例1：

取蔓越莓果实500g，粉碎，加入PH值为3.0、质量分数为65%的乙 醇溶液2.5L，30℃下逆流提取4h，过滤后合并收集滤液，浓缩，得蔓越莓 原花青素提取物61.56g。

实施例2：

取蔓越莓果实500g，粉碎，加入PH值为1.0、质量分数为75%的乙 醇溶液2.5L，40℃下逆流提取6h，过滤后合并收集滤液，浓缩，得蔓越莓 原花青素提取物62.37g。

实施例3：

取蔓越莓果实500g，粉碎，加入PH值为1.0、质量分数为85%的乙 醇溶液2.5L，60℃下逆流提取6h，过滤后合并收集滤液，浓缩，得蔓越莓 原花青素提取物61.47g。

实施例4嗜酸粒细胞性细胞凋亡诱导试验和MBP激酶活性实验

嗜酸粒细胞性细胞凋亡诱导试验：试验根据Vermes等的方法(Journal of  Immunological Methods184卷39-51页1995年)进行。使嗜酸粒细胞性细 胞HL-60细胞悬浮于RPMI1640培养基中，细胞浓度为1-3×10⁶细胞/ml。 向该细胞悬浮液500μl中添加被检测物质(上述实施例1-3中最后收集得到 的蔓越莓原花青素提取物)或培养基，使蔓越莓原花青素提取物在细胞悬浮 液中的浓度为100μg/ml，在37℃、5%CO₂的条件下培养6小时或24小时。 离心洗净后，加入磷脂酞结合蛋白(Annexin)V缓冲液，然后添加5ul磷脂 酞结合蛋白V-FITC。通过流动血细胞计数法，以磷脂酞结合蛋白V阳性细 胞作为细胞凋亡诱导细胞，用相对总细胞数的百分比评价。

MBP激酶活性试验：试验根据De Souza等的方法(Blood99卷3432-3438 页2002年)进行。将嗜酸粒细胞性细胞HL-60细胞悬浮于RPMI1640培养 基，细胞浓度为1-3×10⁶细胞/ml。该细胞悬浮液500μl中添加被检测物质 或培养基，使浓度为100μg/ml，在37℃、5%CO₂的条件下培养6小时或 24小时。离心洗净后，添加可溶解缓冲液，溶解细胞，使用含有MBP5mg/ml 的凝胶进行电泳。凝胶经脱变性、再变性处理后，用³²P-ATP标记，实施3 小时的磷酸化反应。凝胶干燥后，使用图象分析仪解析放射活性。在36kDa 生长出标记带时，记做MBP激酶活化阳性(+)。

蔓越莓原花青素提取物在HL-60细胞中观察到了浓度依赖性的细胞凋 亡诱导。另外进行凝胶MBP激酶分析(In-gel MBP kinase assay)时，蔓越莓 原花青素提取物激活36kDa MBP激酶。以上结果提示。蔓越莓原花青素 提取物对嗜酸粒细胞能诱导细胞凋亡，该细胞凋亡与36kDa MBP激酶有 关。由此推断本发明蔓越莓原花青素提取物中含有可以用于抗嗜酸粒细胞 性炎症作用药物的成分。

所得结果如下表2所示：

确认实施例2和3具有强的细胞凋亡诱导活性，并伴有MBP激酶的 活化。

表2

如上所述，便可以较好地实现本发明。