具有增强的老化稳定性的支链淀粉型淀粉

摘要

本发明涉及生产具有增强的老化稳定性的支链淀粉型淀粉的转基因马铃薯植物。本发明还提供了生产和鉴定此类转基因马铃薯植物的方法。

说明书

马铃薯(Solanum tuberosum)是用于遗传工程的重要靶作物。马铃薯 的主要性状是块茎质量和数量(产量)、营养组成、淀粉质量、淀粉产量、 昆虫和病毒抗性。

直链淀粉和支链淀粉是淀粉的两种分子。支链淀粉是贡献了淀粉的 75-80％的重要组分。直链淀粉和支链淀粉均由通过α-1，4糖苷键连接的D- 葡萄糖残基构成。支链淀粉由于具有高度分支化的结构而与直链淀粉不同， 支链淀粉具有通过α-1，6糖苷连接(淀粉支化酶类(SBE1和SBE2)催化 的)而相连的α-1，4葡聚糖链。在马铃薯中，直链淀粉/支链淀粉之比在基 因型间高度保守。

具有高度市场潜能的一种性状是高支链淀粉性淀粉的生产。高支链淀 粉性淀粉较之天然淀粉而言在胶黏剂(adhesive)和纸张工业中具有改进 的性能。在纸张生产中，其将用作为粘合剂，以及用于具有比目前所用的 胶乳更高的印刷质量的涂层。

马铃薯(Solanum tuberosum L)是具有高水平的遗传杂合性的四倍体 植物。因此，因为重要特征的分离，对马铃薯的传统育种是复杂的。当遗 传工程开始改进马铃薯品种，其在过去十年成为传统育种的替代方式。通 过转化，比使用传统育种更高效地引入单种性状或性状组合。

具有高度市场潜能的一种重要性状是生产具有改良的淀粉质量的马铃 薯，例如，高支链淀粉。高支链淀粉马铃薯的生产之前已被Visser等人，Mol. Genet.(1991)，225：289-296和Hofvander等人(WO 92/11376)描述过。

在胶凝期间，建立淀粉-水系统。淀粉的溶解完成于65-90℃之间(Ellis  R.P.等人，Journal of Science Food Agriculture 77，1998，77，289-311)，这 取决于淀粉的植物来源。在该过程期间，水被掺入三维淀粉网络。

所有淀粉-水系统都显示出特征性的陈化(aging)现象，被称为老化 (retrogradation)。

在陈化期间，该淀粉-水系统被重新组织。凝缩(syneresis)导致下述 事实：与淀粉部分结合的水被释放，淀粉分子由于葡萄糖单体羧基基团之 间的氢键而形成晶体复合体。在该步骤期间，较少的水被淀粉分子结合。 由于造成减少的水结合，淀粉-水系统变混浊，水从淀粉凝胶释放出来(凝 缩)。因此，胶体系统被分开为可溶化合物和固体化合物。对来自玉米、 小麦、稻、豌豆、红薯、木薯和马铃薯的所有商用淀粉，该现象均是已知 的(见Hizukuri S.Carbohydrate Research 141，1985，295-306；Roulet P.，Starch，42，3，1990，99-101)，并且该现象取决于淀粉的性质，例如支 链淀粉的链长(Hizukuri S.，1985；Kalichevsky，M.等人，Carbohydrate Research 198，1990，49-55)或直链淀粉-支链淀粉之比(Fechner，P.等人， Carbohydrate Research 340，(2005)，2563-2568；Miles，M.等人， Carbohydrate Research 135，1985，271-281)。这还可见于通过对淀粉支 化酶同种型(SBE I和II)的同时反义遏制而经遗传修饰的马铃薯植物， 其导致更高的直链淀粉含量和低老化稳定性(Blennow，2005)。所有这些 结果显示，高含量的较少分支化的长葡萄糖链会偏向于淀粉溶液的老化。

因此，未经修饰的、天然的淀粉在不同应用领域中的用途受到其老化 性质(导致不想要的质地改变，在冷冻及解冻或者在食品保存过程所需的 低温贮存后呈现得更明显)的严重限制(Lu T.-J.，Carbohydrate  Polymers 33，1997，33，19-26)。在此类条件下，支链淀粉也贡献于老化过 程，导致形成晶体结构(Tegge G.，和2004，Behrs Verlag Hamburg)。

老化发生于胶凝的淀粉中。在该反应中，优先地直链淀粉的长链自身 重新排列，也有来自支链淀粉的长链自身重新排列。这种情况下，液体形 成凝胶。如果老化导致从淀粉聚合物网络排除水，则该过程被称为凝缩。

淀粉老化可通过广泛的分析方法来测定，包括在宏观和分子水平二者 上分析淀粉凝胶的性质。多种方法被概括于Karim A.等人，Food Chemistry 71(2000)，9-36中。

用于在分子水平上对淀粉糊的老化加以定量的两种方法是差示扫描量 热法(DSC)和X-射线衍射。另一方面，可通过流变学方法(例如黏度参 数)，来分析质地性质中总结的硬度或坚硬度(firmness)。另一方法是 质地情况分析，其使用质地分析仪来分析固体和半固体样品的压缩 (compression)。

还报道了用α-淀粉酶进行的降解能区分正常淀粉和老化的淀粉(Tsuge  H.，等人，Starch 42(2006)，213-216)，因为只有未老化的淀粉可被酶促降 解。如果老化的淀粉被酶促降解了，则未老化的淀粉部分将被解聚成葡萄 糖单元。老化的淀粉部分将保持完整，支链淀粉或直链淀粉链可在用α-淀 粉酶降解之后通过碘染色来鉴定。

全球生产的淀粉中大多数都以降解形式使用，例如含糖产品。如上文 所述，仅未老化的、胶凝的(gelled)淀粉可被酶促降解。如果使用已高度 老化的淀粉，则大部分不能被酶促降解并用作为含糖单体的来源。在这种 情况下，淀粉仅可被化学降解，这是每个应用领域都不喜好的。

为得到具有高粘性质地的稳定淀粉，天然淀粉因此必须经修饰，以预 防老化。

这可通过对三维网络加以稳定、减少直链淀粉含量或减少直链淀粉和 支链淀粉的链长来实现。

为预防老化对淀粉结构的稳定通常可通过交联来实现(Tegge，G.， 2004)。

另一手段是通过部分β-淀粉分解对链长进行酶促修饰(Würsch P.et  Gumy D.，Carbohydrate Research 256，1994，129-137)。

使用具有低直链淀粉含量的蜡质谷类(waxy corn)植物品种是常见的， 因为它们具有独特的淀粉性质。从20世纪初以来就在使用具有降低的直链 淀粉含量的突变体蜡质谷类。现今蜡质谷类含有几乎纯的支链淀粉(Echt  C.等人，Genetics 99，1981，275-284)。此外，通过传统育种生产出了生产 支链淀粉型淀粉的蜡质马铃薯植物Eliane^TM(AVEBE，Foxhol，荷兰)， 并且其被商业应用。天然马铃薯淀粉因其中性味道(neutral taste)而受喜 好，这是较低的蛋白含量(Ellis，R.P.等人，Journal Sci Food Agric 77， 1998，77，289-311)和其淀粉-水系统的清澈性(与天然玉米、大麦和小麦 淀粉的相反)导致的。

此外，以遗传工程手段，通过同时反义下调三种可溶淀粉合酶基因 (SS)，产生了具有降低的直链淀粉含量的马铃薯植物，其主要产生支链 淀粉型淀粉(Jobling，S.A.等人，Nature Biotechnology 20；2002， 295-299)。此外，通过反义技术仅下调颗粒淀粉合酶(GBSS)(WO 92/11376， EP 0563189)得到了生产支链淀粉型淀粉的转基因马铃薯植物马铃薯株系 EH92-527-1。WO 01/12782公开了：仅下调GBSS并且不下调支化酶(BE)， 导致直链淀粉含量＜10％。在这种情况下，峰黏度降低至野生型马铃薯栽 培种的70％。使用马铃薯株系EH92-527-1中包含的基因构建体时却并非 如此，其峰黏度较之非转基因马铃薯栽培种Prevalent而言保持不变。

在WO 01/12782或WO 06/103107中，显示出直链淀粉含量减少至小 于20％。但是就改进的老化稳定性而言，低于10％的值是最可能需要的。

在淀粉的磷酸盐含量和黏度性质之间也有清楚的关联(Karim A.A.等 人，Journal of Food Science 72，2007，C132-138)。此外，Blennow A.等人， International Journal of Biological Macromolecules 36，2005；159-168显示： 增加的磷酸盐水平导致马铃薯淀粉增强的黏度。

总体而言，在很多食品和工业应用中，低老化程度是商业上想要的淀 粉性质。

然而，前述文献并没有教导或暗示如何产生具有高老化稳定性的支链 淀粉型马铃薯淀粉。

本发明基于下述目的：使得具有高老化稳定性的支链淀粉型马铃薯淀 粉可获得。

此外，具有高老化稳定性的新支链淀粉型淀粉可具有下述额外性质中 的至少一种：如果较之目前生产的支链淀粉型马铃薯淀粉而言，更低的直 链淀粉含量、更高的黏度水平、更高的磷水平和/或更低的蛋白水平。

下述术语用于本申请文件中：

“野生型植物”表示相应的未经遗传修饰的起始植物。该植物是生产淀 粉的植物，例如马铃薯或木薯(Manihot esculenta)栽培种。

取决于上下文，术语“植物”表示野生型植物或经遗传修饰的植物。

“转基因植物”或“经遗传修饰的植物”表示植物含有额外的经稳定插入 的基因或基因片段(“转基因”)(其可以是植物物种外源的或内源的)， 正义和/或反义定向的额外的基因或额外的基因片段，或RNAi构建体，它 们由合适的启动子驱动并且与结合颗粒的淀粉合酶(例如SEQ ID NO：2、 SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17中指出的或与其具有至 少60％序列同一性的多核苷酸)相关。

“支链淀粉型淀粉”表示来自马铃薯植物的淀粉的支链淀粉含量为至少 98％。

“株系”被定义为包含一种特定遗传基因座的植物或植物种群，作为遗 传操作的结果，所述基因座携带包含至少一个拷贝的目的转基因的外源 DNA。可通过一个或多个转基因的表达，对株系进行表型表征。在分子水 平上，可通过限制性图谱(例如通过Southern印迹测定的)，和/或通过 转基因的上游和/或下游侧翼序列，和/或转基因的分子构型，来表征株系。 用包含至少一个目的基因的转化DNA对植物进行的转化导致产生许多株 系，其中每个都是独特的，因为转化DNA插入于一个或多个基因组基因 座座(“插入位点”)。

在本文中使用时，“选择的株系”是选自下述株系的组的株系，所述组 的株系通过用相同的转化DNA进行转化或通过与由此类转化获得的植物 回交而获得，所述选择是基于转基因的表达和稳定性、性状质量(例如淀 粉组成和性质)以及具有最优农艺学特征的各插入位点的相容性。因此， 用于株系选择的标准是下述中的一种或多种，优选地两种或多种，有利地 下述全部：

a)转基因在基因组基因座(特定株系由此被表征)的存在不干扰想要 的其它植物特征，例如与农艺学性能或商业价值相关的那些；

b)所述株系特征在于良好界定的分子构型，其被稳定遗传(营养方式 或有性方式)并且可针对其开发用于特性控制的合适诊断工具；

c)在携带所述株系的植物于正常农艺学用途中可能暴露给的环境条件 范围内，转基因插入中的目的基因在株系的杂合(或半合)和纯合条件二 者下均以商业可接受的水平显示出正确的、合适的和稳定的空间和时间表 型表达。优选地，外源DNA被与植物基因组中允许渐渗到想要的商业遗 传背景的位置联系起来。

在本文中使用时，株系“PAADGN”将表示包含SEQ ID NO：2或其核 酸序列同源体的转基因马铃薯植物。

在本文中使用时，“试剂盒”指用于在生物样品中鉴定根据本发明生产 的马铃薯株系的目的的试剂组。更特别地，本发明的试剂盒的一种优选实 施方式包含至少一种或两种如本发明所述的特异性引物。或者，根据本发 明的另一实施方式，试剂盒可包含特异性探针，如上文所述，其与生物样 品中的核酸特异性杂交，以鉴定其中马铃薯株系PAADGN的存在。任选 地，试剂盒还可包含用于使用特异性探针在生物样品中鉴定株系PAADGN 的任何其它试剂(例如但不限于杂交缓冲液、标记物(label))。

本发明可被如下表征：

具有高老化稳定性的支链淀粉型淀粉，其特征在于老化值G’(3-0w)在 10Pa以下，优选地9Pa以下，最优选8Pa以下。

具有高老化稳定性的支链淀粉型淀粉，其特征在于老化值G’(3-0w)在 5Pa以下。

支链淀粉型淀粉，其特征在于老化值G’(3-0w)在2Pa以下。

支链淀粉型淀粉，其特征在于磷含量高于0.09％。

支链淀粉型淀粉，其特征在于蛋白含量低于0.02％。

核酸序列SEQ ID NO：2或其核酸序列同源体。

核酸序列SEQ ID NO：47或其核酸序列同源体。

核酸序列SEQ ID NO：15或其核酸序列同源体。

核酸序列SEQ ID NO：16或其核酸序列同源体。

核酸序列SEQ ID NO：17或其核酸序列同源体。

核酸序列SEQ ID NO：2，其中所述核酸序列被稳定并入马铃薯植物的 基因组中。

核酸序列SEQ ID NO：15，其中所述核酸序列被稳定并入马铃薯植物 的基因组中。

核酸序列SEQ ID NO：16，其中所述核酸序列被稳定并入马铃薯植物 的基因组中。

核酸序列SEQ ID NO：17，其中所述核酸序列被稳定并入马铃薯植物 的基因组中。

用于生产具有高老化稳定性的支链淀粉型淀粉的方法，其特征在于， 用包含核酸序列SEQ ID NO：15、16或17的载体转化马铃薯植物，选择 在所述植物基因组中包含SEQ ID NO：15、16或17的转基因马铃薯株系 以及选择生产具有在10Pa以下(优选地9Pa以下，最优选8Pa以下)的 老化值G’(3-0w)的支链淀粉型淀粉的转基因马铃薯株系，繁殖所选择的转 基因植物，并且从此类植物分离支链淀粉型淀粉。

用于生产具有高老化稳定性的支链淀粉型淀粉的方法，其特征在于， 使用包含核酸序列SEQ ID NO：15、16或17的载体转化马铃薯植物，选 择在所述植物基因组中包含SEQ ID NO：2的转基因马铃薯株系以及选择 生产具有在10Pa以下(优选地9Pa以下，最优选8Pa以下)的老化值 G’(3-0w)的支链淀粉型淀粉的转基因马铃薯株系，繁殖所选择的转基因植 物，并且从此类植物分离支链淀粉型淀粉。

用于生产具有高老化稳定性的支链淀粉型淀粉的方法，其特征在于， 使用包含核酸序列SEQ ID NO：15、16或17的载体转化马铃薯植物，选 择在所述植物基因组中包含SEQ ID NO：47的转基因马铃薯株系以及选择 生产具有在10Pa以下(优选地9Pa以下，最优选8Pa以下)的老化值 G’(3-0w)的支链淀粉型淀粉的转基因马铃薯株系，繁殖所选择的转基因植 物，并且从此类植物分离支链淀粉型淀粉。

用于生产具有高老化稳定性的支链淀粉型淀粉的方法，其特征在于， 使用包含核酸序列SEQ ID NO：15、16或17的载体转化马铃薯植物，选 择在所述植物基因组中包含SEQ ID NO：2的转基因马铃薯株系以及选择 生产具有在5Pa以下的老化值G’(3-0w)的支链淀粉型淀粉的转基因马铃薯 株系，繁殖所选择的转基因植物，并且从此类植物分离支链淀粉型淀粉。

用于生产具有高老化稳定性的支链淀粉型淀粉的方法，其特征在于， 使用包含核酸序列SEQ ID NO：15、16或17的载体转化马铃薯植物，选 择在所述植物基因组中包含SEQ ID NO：2的转基因马铃薯株系以及选择 生产具有2Pa以下的老化值G’(3-0w)的支链淀粉型淀粉的转基因马铃薯株 系，繁殖所选择的转基因植物，并且从此类植物分离支链淀粉型淀粉。

生产转基因马铃薯植物的方法，所述植物生产具有高老化稳定性的支 链淀粉型淀粉，所述方法特征在于，使用包含核酸序列SEQ ID NO：16的 载体转化马铃薯植物，选择在基因组中包含SEQ ID NO：16的转基因马铃 薯植物，以及选择生产具有9Pa以下的老化值G’(3-0w)的支链淀粉型淀粉 的转基因马铃薯植物。

生产转基因马铃薯植物的方法，所述植物生产具有高老化稳定性的支 链淀粉型淀粉，所述方法特征在于，使用包含核酸序列SEQ ID NO：15的 载体转化马铃薯植物，选择在基因组中包含SEQ ID NO：15的转基因马铃 薯植物，以及选择生产具有9Pa以下的老化值G’(3-0w)的支链淀粉型淀粉 的转基因马铃薯植物。

生产转基因马铃薯植物的方法，所述植物生产具有高老化稳定性的支 链淀粉型淀粉，所述方法特征在于，使用包含核酸序列SEQ ID NO：17的 载体转化马铃薯植物，选择在基因组中包含SEQ ID NO：17的转基因马铃 薯植物，以及选择生产具有9Pa以下的老化值G’(3-0w)的支链淀粉型淀粉 的转基因马铃薯植物。

生产转基因马铃薯植物的方法，所述植物生产具有高老化稳定性的支 链淀粉型淀粉，所述方法特征在于，使用包含核酸序列SEQ ID NO：17的 载体转化马铃薯植物，选择在基因组中包含SEQ ID NO：2的转基因马铃 薯植物，以及选择生产具有9Pa以下的老化值G’(3-0w)的支链淀粉型淀粉 的转基因马铃薯植物。

可通过上文所述的方法获得的转基因马铃薯植物。

转基因马铃薯植物、种子、块茎、植物细胞或植物组织，其中基因组 包含至少一条核酸序列SEQ ID NO：2。

转基因马铃薯植物、种子、块茎、植物细胞或植物组织，其中基因组 包含至少一条核酸序列SEQ ID NO：47。

转基因马铃薯植物、种子、块茎、植物细胞或植物组织，其中基因组 包含至少一条核酸序列SEQ ID NO：15。

转基因马铃薯植物、种子、块茎、植物细胞或植物组织，其中基因组 包含至少一条核酸序列SEQ ID NO：16。

转基因马铃薯植物、种子、块茎、植物细胞或植物组织，其中基因组 包含至少一条核酸序列SEQ ID NO：17。

转基因马铃薯植物、种子、块茎、植物细胞或组织，其特征在于，使 用聚合酶链式反应，以及使用分别具有核苷酸序列SEQ ID NO：44和SEQ  ID NO：45的两条引物，基因组DNA可用于扩增1023个碱基对的DNA片 段SEQ ID NO：46(包含990个碱基对的SEQ ID NO：16)。

转基因马铃薯植物、种子、块茎、植物细胞或组织，其特征在于，使 用聚合酶链式反应，以及使用分别具有核苷酸序列SEQ ID NO：38和SEQ  ID NO：39的两条引物，基因组DNA可用于扩增2254个碱基对的DNA片 段SEQ ID NO：15。

转基因马铃薯植物、种子、块茎、植物细胞或组织，其特征在于，使 用聚合酶链式反应，以及使用分别具有核苷酸序列SEQ ID NO：40和SEQ  ID NO：41的两条引物，基因组DNA可用于扩增5212个碱基对的DNA片 段SEQ ID NO：17。

转基因马铃薯植物、种子、块茎、植物细胞或组织，其特征在于，使 用聚合酶链式反应，以及使用分别具有核苷酸序列SEQ ID NO：42和SEQ  ID NO：43的两条引物，基因组DNA可用于扩增大约8706个碱基对的DNA 片段SEQ ID NO：2。

通过下述方法获得的转基因马铃薯植物、种子、块茎、植物细胞或组 织：将上文公开的转基因植物与非转基因马铃薯植物杂交，并且选择生产 具有10Pa以下(优选地9Pa以下，更优选8Pa以下)的老化值G’(3-0w) 的支链淀粉型淀粉的转基因马铃薯株系。

通过下述方法获得的转基因马铃薯植物、种子、块茎、植物细胞或组 织：将上文公开的转基因植物与非转基因马铃薯植物杂交，并且选择生产 具有5Pa以下的老化值G’(3-0w)的支链淀粉型淀粉的转基因马铃薯株系。

通过下述方法获得的转基因马铃薯植物、种子、块茎、植物细胞或组 织：将上文公开的转基因植物与非转基因马铃薯植物杂交，并且选择生产 具有2Pa以下的老化值G’(3-0w)的支链淀粉型淀粉的转基因马铃薯株系。

用于生产下述转基因马铃薯植物的方法，所述植物生产具有高老化稳 定性的支链淀粉型淀粉，所述方法包括：

a)鉴定出下述转基因马铃薯植物，所述植物特征在于，使用聚合酶链 式反应，以及使用分别具有核苷酸序列SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45 的两条引物，基因组DNA可用于扩增1023个碱基对的DNA片段(包含 990个碱基对的SEQ ID NO：16)；

b)将步骤a)中鉴定的转基因马铃薯植物杂交进特征在于至少一个特 定特征不同于所述转基因马铃薯植物的非转基因马铃薯植物；以及

c)选择包含990个碱基对(SEQ ID NO：16)并且携带有非转基因马 铃薯植物的特定特征的转基因植物。

用于生产下述转基因马铃薯植物的方法，所述植物生产具有高老化稳 定性的支链淀粉型淀粉，所述方法包括：

a)鉴定出下述转基因马铃薯植物，所述植物特征在于，使用聚合酶链 式反应，以及使用分别具有核苷酸序列SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39 的两条引物，基因组DNA可用于扩增2254个碱基对的DNA片段SEQ ID NO：15；

b)将步骤a)中鉴定的转基因马铃薯植物杂交进特征在于至少一个特 定特征不同于所述转基因马铃薯植物的非转基因马铃薯植物；以及

c)选择包含2,254个碱基对(SEQ ID NO：15)并且携带有非转基因 马铃薯植物的特定特征的转基因植物。

用于生产下述转基因马铃薯植物的方法，所述植物生产具有高老化稳 定性的支链淀粉型淀粉，所述方法包括：

a)鉴定出下述转基因马铃薯植物，所述植物特征在于，使用聚合酶链 式反应，以及使用分别具有核苷酸序列SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41 的两条引物，基因组DNA可用于扩增5212个碱基对的DNA片段SEQ ID  NO：17；

b)将步骤a)中鉴定的转基因马铃薯植物杂交进特征在于至少一个特 定特征不同于所述转基因马铃薯植物的非转基因马铃薯植物；以及

c)选择包含5212个碱基对(SEQ ID NO：17)并且携带有非转基因 马铃薯植物的特定特征的转基因植物。

用于生产下述转基因马铃薯植物的方法，所述植物生产具有高老化稳 定性的支链淀粉型淀粉，所述方法包括：

a)鉴定出下述转基因马铃薯植物，所述植物特征在于，使用聚合酶链 式反应，以及使用分别具有核苷酸序列SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43 的两条引物，基因组DNA可用于扩增8706个碱基对的DNA片段SEQ ID  NO：2；

b)将步骤a)中鉴定的转基因马铃薯植物杂交进特征在于至少一个特 定特征不同于所述转基因马铃薯植物的非转基因马铃薯植物；以及

c)选择包含8706个碱基对(SEQ ID NO：2)并且携带有非转基因马 铃薯植物的特定特征的转基因植物。

用于鉴定生产具有高老化稳定性的支链淀粉型淀粉的转基因马铃薯植 物、其种子、块茎、植物细胞或组织的方法，所述方法通过使用聚合酶链 式反应以及使用分别具有核苷酸序列SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45的 两条引物、扩增1023个碱基对(bp)的DNA片段(包含990个碱基对的 序列SEQ ID NO：16)来进行。

用于鉴定生产具有高老化稳定性的支链淀粉型淀粉的转基因马铃薯植 物、其种子、块茎、植物细胞或组织的方法，所述方法通过使用聚合酶链 式反应以及使用分别具有核苷酸序列SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39的 两条引物、扩增2254个碱基对的DNA片段SEQ ID NO：15来进行。

用于鉴定生产具有高老化稳定性的支链淀粉型淀粉的转基因马铃薯植 物、其种子、块茎、植物细胞或组织的方法，所述方法通过使用聚合酶链 式反应以及使用分别具有核苷酸序列SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41的 两条引物、扩增5212个碱基对的DNA片段SEQ ID NO：17来进行。

用于鉴定生产具有高老化稳定性的支链淀粉型淀粉的转基因马铃薯植 物、其种子、块茎、植物细胞或组织的方法，所述方法通过使用聚合酶链 式反应以及使用分别具有核苷酸序列SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43的 两条引物、扩增8706个碱基对的DNA片段SEQ ID NO：2来进行。

用于鉴定生产具有高老化稳定性的支链淀粉型淀粉的转基因马铃薯植 物的试剂盒，所述试剂盒包含用于PCR鉴定方案的PCR引物，其中一条 识别SEQ ID NO：2内的外源DNA序列，另一条识别SEQ ID NO：2内的 5’侧翼序列或SEQ ID NO：2内的3’侧翼序列。

如上文所述的试剂盒，其中所述PCR引物包含分别是SEQ ID NO：8 和SEQ ID NO：9的核苷酸序列。

如上文所述的试剂盒，其中所述第二PCR引物或探针识别SEQ ID  NO：2内的外源DNA序列。

用于验证块茎纯度的方法，所述方法包括用引物或探针来检测块茎样 品中的特定DNA序列，所述引物或探针特异性识别下述转基因马铃薯植 物特异性的、SEQ ID NO：2内的5’侧翼序列或3’侧翼序列，所述转基因 马铃薯植物包含SEQ ID NO：2，生产具有高老化稳定性的支链淀粉型淀 粉。

针对SEQ ID NO：2的存在筛选对块茎、植物细胞或组织加以筛选的 方法，所述方法包括用特异性引物或探针来检测所述特定DNA序列，所 述引物或探针特异性识别样品中SEQ ID NO：2内的5’侧翼序列SEQ ID  NO：6或SEQ ID NO：2内的3’侧翼序列SEQ ID NO：7。

用于鉴定生物样品中SEQ ID NO：2的试剂盒，所述试剂盒至少包含 下述PCR引物或探针，所述引物或探针识别SEQ ID NO：2内的5’侧翼序 列或SEQ ID NO：2内的3’侧翼序列。

上文公开的核酸序列SEQ ID NO：2、15、16或17用于检测源于上文 公开的转基因马铃薯植物的植物材料的用途。

具体地，本发明涉及具有特定基因构建体的转基因马铃薯植物、植物 材料，所述构建体的表达导致产生具有高老化稳定性的支链淀粉型淀粉。 本发明还提供了生产此类转基因马铃薯植物的方法和鉴定此类转基因马铃 薯植物的方法。还描述了用于鉴定本发明的转基因马铃薯植物的试剂盒。 本发明的转基因马铃薯植物组合了形成具有高老化稳定性的独特的支链淀 粉型淀粉的能力和最优整体农艺学性能和遗传稳定性。

转基因在植物中的表型表达通过基因本身结构和通过其在植物基因组 中的位置(插入位点)二者来测定。同时，转基因在基因组中不同位置的 存在可以以不同方式影响植物的整体表型。经遗传转化的植物的实际转化 和再生在包括遗传表征和田间试验评估的一系列选择步骤中是第一步。

为了质量控制(例如种批的纯度)、在植物材料或包含或源于植物材 料的材料(例如但不限于食物或饲料产品)中检测株系的目的，可使用本 文公开的试剂盒，并且其组分可被具体调节。

如果在用这些限制性酶中的至少两种、优选至少三种、特别地至少四 种、更特别地所有这些限制性酶进行消化后，分离自植物材料的基因组 DNA产生能杂交至本发明试剂盒内提供的探针的DNA片段(其具有与下 文所述的那些相同的长度)的话，则植物被测定为具有对应于株系 PAADGN中存在的基因构建体的基因构建体。

还可根据本文中针对株系PAADGN描述的PCR鉴定方案，来鉴定包 含对应于株系PAADGN中存在的基因构建体的基因构建体的转基因植物 或植物材料。简言之，使用特异性识别转基因马铃薯株系PAADGN中插 入位点的侧翼序列(优选地，识别本文所述的PAADGN的插入位点的5’ 或3’侧翼序列)的引物(例如引物SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20)和 识别转基因中的序列的引物(特别是分别为SEQ ID NO：18和21的序列 的引物)通过PCR来扩增基因组DNA。与天然马铃薯基因杂交的引物被 用作为对照。如果在植物材料上使用上述引物组合进行PCR分别产生了 300至410bp之间的片段(优选大约359bp的片段)和/或300至400bp 之间的片段(优选大约348bp)，转基因植物就被测定为是选择的马铃薯 株系PAADGN。

在本发明的一种实施方式中，马铃薯植物、其种子、块茎、植物细胞 或组织包含位于插入位点的序列SEQ ID NO：2——见图2和3。在本发明 的另一实施方式中，马铃薯植物、其种子、块茎、植物细胞或组织包含表 达盒SEQ ID NO：16——见图10。在本发明的一种优选实施方式中，马铃 薯植物、其种子、块茎、植物细胞或组织包含表达盒SEQ ID NO：15—— 见图9。在本发明的一种最优选的实施方式中，马铃薯植物、其种子、块 茎、植物细胞或组织包含表达盒SEQ ID NO：17——见图11。在本发明的 最优选的实施方式中，转基因马铃薯植物、其种子、块茎、植物细胞或组 织是选择的马铃薯株系PAADGN。

本发明涉及转基因马铃薯植物、种子、块茎或植物细胞，其基因组DNA 特征在于下述特征之一或二者皆有：

a)基因组DNA能产生选自下组的限制性片段中的至少两条、优选至 少三条、最优选至少四条：

i)一条PvuII片段，其长度在4550bp至4850bp之间，优选大约4718 bp；

ii)一条PvuII/BpiI片段，其长度在3620bp至3950bp之间，优选 大约3783bp；

iii)一条EcoRI/BpiI片段，其长度在7050bp至7400bp之间，优选 长度大约7232bp；

iv)一条MunI/AvrII片段，其长度在3800bp至4100bp之间，优 选长度大约3930bp；

其中每条限制性片段能在标准严格条件下与包含 c-AtAHASL[csr1-2o]序列的部分以及p-NOS序列的部分的343bp的片段 (可通过对本文所述的质粒VC-PMA12-1[AP4]qcz2进行SacII消化来获 得)杂交。

和/或

b)基因组DNA能产生选自下组的至少一条、优选至少两条限制性片 段：

i)一条EcoRI/AvrII片段，其长度在4400bp至4700bp之间，优选 大约4535bp；

ii)一条MunI/SapI片段，其长度在3500bp至3800bp之间，优选 大约3638bp；

其中每条限制性片段能在标准严格条件下与包含 c-AtAHASL[csr1-2o]序列的部分以及p-NOS序列的部分的343bp的片段 (可通过对本文所述的质粒VC-PMA12-1[AP4]qcz2进行SacII消化来获 得)杂交。

本发明涉及转基因马铃薯植物、种子、块茎或植物细胞，其基因组DNA 特征在于下述特征之一或二者皆有：

a)基因组DNA能产生选自上文a)所描述的组的限制性片段中的至 少两条、优选至少三条、例如至少四条，所述组包含上文a)的i)、ii)、 iii)和iv)所描述的限制性片段，由此选择可包括上文a)所描述的i)、 ii)、iii)和iv)的任何组合；

和/或

b)基因组DNA能产生选自上文b)所描述的组的至少一条或优选至 少两条限制性片段，所述组包含上文b)的i)和ii)所描述的限制性片段， 由此选择可包括上文b)所描述的i)和ii)的任何组合。

本发明还涉及转基因马铃薯植物、种子、块茎或植物细胞，其特征在 于下述特征之一或二者皆有：

a)使用聚合酶链式反应，以及使用分别具有SEQ ID NO：18和SEQ ID  NO：19的核苷酸序列的两条引物，基因组DNA可用于扩增300bp至410 bp之间(优选大约359bp)的DNA片段，和/或

b)使用聚合酶链式反应，以及使用分别具有SEQ ID NO：20和SEQ ID  NO：21的核苷酸序列的两条引物，基因组DNA可用于扩增300bp至400 bp之间(优选大约348bp)的DNA片段。

本发明还涉及转基因马铃薯植物、种子、块茎或植物细胞，其特征在 于下述特征之一或二者皆有：

a)使用聚合酶链式反应，以及使用分别具有SEQ ID NO：22和SEQ ID  NO：23的核苷酸序列的两条引物，基因组DNA可用于扩增3100bp至3400 bp之间(优选大约3240bp)的DNA片段，和/或

b)使用聚合酶链式反应，以及使用分别具有SEQ ID NO：24和SEQ ID  NO：25的核苷酸序列的两条引物，基因组DNA可用于扩增300bp至400 bp之间(优选大约348bp)的DNA片段。

本发明还涉及转基因马铃薯植物、种子、块茎或植物细胞，其特征在 于下述特征之一或二者皆有：

a)使用聚合酶链式反应，以及使用分别具有SEQ ID NO：26和SEQ ID  NO：27的核苷酸序列的两条引物，基因组DNA可用于扩增600+x bp至 750+x bp之间(优选大约680+x bp)的DNA片段，其中x代表可选择标 记盒的长度(以碱基对计)和/或

b)使用聚合酶链式反应，以及使用分别具有SEQ ID NO：28和SEQ ID  NO：29的核苷酸序列的两条引物，基因组DNA可用于扩增300bp至400 bp之间(优选大约348bp)的DNA片段。

本发明还涉及用于鉴定本发明的株系PAADGN的试剂盒，所述试剂 盒包含具有SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31的核苷酸序列的PCR引物 和具有SEQ ID NO：32的核苷酸序列的PCR探针(在5’末端与6-FAM共 价连接，在3’末端与TAMRA共价连接)。引物探针组导致产生具有SEQ  ID NO：33的110bp的扩增子。

定量PCR如下设置：

Universal Master Mix，具有UNG(Applied Biosystems)

400nM引物SEQ ID NO：30

400nM引物SEQ ID NO：31

150nM探针SEQ ID NO：32

5μl基因组DNA模板

总体积25μl中

定量PCR反应能例如运行于ABI 7500快速实时PCR系统(ABI 7500 Fast Real-Time PCR System)(Applied Biosystems)上。

循环仪的情况如下所述：

52℃2分钟

95℃10分钟

45个循环的95℃15秒、60℃1分钟

本发明还涉及用于鉴定本发明的株系PAADGN的试剂盒，所述试剂 盒包含具有SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35的核苷酸序列的PCR引物 和具有SEQ ID NO：36的核苷酸序列的PCR探针(在5’末端与6-FAM共 价连接，在3’末端与BHQ1共价连接)。引物探针组导致产生具有SEQ ID  NO：37的97bp的扩增子。

定量PCR如下设置：

1x Jumpstart ReadyMix Taq(Sigma P2893)

900nM引物SEQ ID NO：34

900nM引物SEQ ID NO：35

100nM探针SEQ ID NO：36

2μl基因组DNA模板

总体积10μl中

定量PCR反应能例如运行于ABI 7900实时PCR系统(Applied Biosystems)上。

循环仪的情况如下所述：

95℃5分钟

40个循环的95℃15秒、60℃1分钟

本发明还涉及转基因马铃薯植物、种子、块茎或植物细胞，其包含整 合进染色体DNA的部分(其特征在于SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的 序列)中的重组核酸序列SEQ ID NO：17或整合进染色体DNA中的重组 核酸序列SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16(包含至少一个转基因)。

在另一优选的实施方式中，本发明的经分离的核酸同源体包含与SEQ  ID NO：2所示的核苷酸序列或与包含其至少60个连续核苷酸的部分至少约 40-60％相同(优选至少大约60-70％，更优选至少大约70-75％、75-80％、 80-85％、85-90％或90-95％，以及甚至更优选至少大约95％、96％、97％、 98％、99％相同或更相同)的重组核苷酸序列。用于重组核酸序列比较的 优选长度为至少75个核苷酸，更优选至少100个核苷酸，以及最优选地， 包含SEQ ID NO：15(图9)或SEQ ID NO：16(图10)的RNAi区域全 长。

本发明的经分离的重组核酸同源体必须编码正义或反义定向的或作为 RNAi构建体或其部分的天然GBSS核酸序列的部分，其与SEQ ID NO：2 或SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17所示的核酸序列至 少约50-60％相同(优选至少大约60-70％，更优选至少大约70-75％、 75-80％、80-85％、85-90％或90-95％，以及最优选至少大约96％、97％、 98％、99％相同或更相同)，并且在调节植物中淀粉生物合成或降低植物 中直链淀粉生物合成方面具有功能。

就本发明的目的而言，两条核酸序列间的百分比序列同一性是使用 Vector NTI 6.0(PC)软件包(InforMax，7600 Wisconsin Ave.，Bethesda， MD 20814)来测定的。使用空位开放罚分15和空位延伸罚分6.66，来 测定两条核酸的百分比同一性。就多重比对的目的而言(Clustal W算法)， 空位开放罚分为10，空位延伸罚分为0.05，使用blosum62矩阵。应当理 解，就测定序列同一性的目的而言，当将DNA序列与RNA序列进行比较 时，胸苷核苷酸等同于尿嘧啶核苷酸。

在另一方面，本发明提供了经分离的重组核酸序列，其包含在严格条 件下与SEQ ID NO：2的多核苷酸杂交的多核苷酸。更特别地，本发明的 经分离的重组核酸分子长度为至少15个核苷酸，并且在严格条件下与包含 SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17的核 苷酸序列的核酸分子杂交。在另一实施方式中，核酸长度为至少30、50、 100、250或更多个核苷酸。优选地，本发明的经分离的重组核酸同源体包 含下述核苷酸序列，所述核苷酸序列在高度严格条件下与SEQ ID NO：2、 SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列杂 交，并且作为植物中淀粉生物合成的调节剂发挥功能或于在植物中降低直 链淀粉生物合成的方面发挥功能。

在本文中关于DNA到DNA印迹的杂交的方面使用时，术语“严格条 件”指在10X Denhart’s溶液、6X SSC、0.5％SDS和100μg/ml变性鲑精 DNA中60℃于杂交过夜。于62℃，在3X SSC/0.1％SDS中、接着在1X SSC/0.1％SDS、以及最后在0.1X SSC/0.1％SDS中依序对印迹加以洗涤， 每次30分钟。在另一实施方式中，短语“严格条件”指在6X SSC溶液中于 65℃杂交。如还在本文中使用的，“高度严格条件”指在10X Denhart’s溶 液、6X SSC、0.5％SDS和100μg/ml变性鲑精DNA中于65℃杂交过夜。 于65℃，在3X SSC/0.1％SDS中、接着在1X SSC/0.1％SDS、以及最后 在0.1X SSC/0.1％SDS中依序对印迹加以洗涤，每次30分钟。用于核酸 杂交的方法被描述于Meinkoth和Wahl，1984，Anal.Biochem. 138：267-284；Current Protocols in Molecular Biology，Chapter 2，Ausubel 等人编著，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York，1995；和 Tijssen，1993，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular  Biology：Hybridization with Nucleic Acid Probes，Part I，Chapter 2， Elsevier，New York，1993中。优选地，本发明的经分离的重组核酸分子在 严格或高度严格条件下与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：15或SEQ ID NO： 16或SEQ ID NO：17的序列杂交。

本发明提供了生产转基因马铃薯植物、种子、块茎或植物细胞的方法， 所述方法包括：将重组DNA分子SEQ ID NO：17插入特征在于SEQ ID  NO：6(图7)和SEQ ID NO：7(图8)的马铃薯植物细胞染色体DNA的 部分中，以及任选地，从经转化的细胞再生转基因马铃薯植物。

或者，本发明提供了生产转基因马铃薯植物、种子、块茎或植物细胞 的方法，所述方法包括：将重组DNA分子SEQ ID NO：15插入特征在于 SEQ ID NO：6(图7)和SEQ ID NO：7(图8)的马铃薯植物细胞染色体 DNA的部分中，以及任选地，从经转化的细胞再生转基因马铃薯植物。

或者，本发明还可提供生产转基因马铃薯植物、种子、块茎或植物细 胞的方法，所述方法包括：将重组DNA分子SEQ ID NO：16插入特征在 于SEQ ID NO：6(图7)和SEQ ID NO：7(图8)的马铃薯植物细胞染色 体DNA的部分中，以及任选地，从经转化的细胞再生转基因马铃薯植物。

本发明还涉及下述转基因马铃薯植物、种子、块茎或植物细胞，它们 是从特征在于包含SEQ ID NO：2的转基因马铃薯株系与非转基因马铃薯 植物(特征在于与转基因马铃薯株系PAADGN不同的至少一个特定特征) 杂交获得的，由此选择的转基因植物特征在于生产具有高老化稳定性的支 链淀粉型淀粉和上文所述额外的特定特征的存在。

本发明还涉及鉴定本发明的马铃薯株系PAADGN的转基因马铃薯植 物、种子、块茎或植物或细胞的方法，所述方法包括，建立转基因植物或 其细胞的基因组DNA的下述特征之一或二者：

a)基因组DNA能产生选自下组的限制性片段的组中的至少两条、优 选至少三条、更优选至少四条、最优选至少五条：

i)一条PvuII片段，其长度在4550bp至4850bp之间，优选大约4718 bp；

ii)一条PvuII/BpiI片段，其长度在3620bp至3950bp之间，优选 大约3783bp；

iii)一条EcoRI/BpiI片段，其长度在7050bp至7400bp之间，优选 长度大约7232bp；

iv)一条MunI/AvrII片段，其长度在3800bp至4100bp之间，优 选长度大约3930bp；

其中每条限制性片段能在标准严格条件下与包含 c-AtAHASL[csr1-2o]序列的部分以及p-NOS序列的部分的343bp的片段 (可通过对本文所述的质粒VC-PMA12-1[AP4]qcz2进行SacII消化来获 得)杂交。

和/或

b)基因组DNA能产生选自下组的至少一条、优选至少两条限制性片 段：

i)一条EcoRI/AvrII片段，其长度在4400bp至4700bp之间，优选 大约4535bp；

ii)一条MunI/SapI片段，其长度在3500bp至3800bp之间，优选 大约3638bp；

其中每条限制性片段能在标准严格条件下与包含 c-AtAHASL[csr1-2o]序列的部分以及p-NOS序列的部分的343bp的片段 (可通过对本文所述的质粒VC-PMA12-1[AP4]qcz2进行SacII消化来获 得)杂交。

本发明还涉及用于鉴定包含本发明的马铃薯株系PAADGN的植物的 试剂盒，所述试剂盒包含具有SEQ ID NO：8(正向引物)和SEQ ID NO： 9(反向引物)的核苷酸序列的PCR探针。本发明还涉及用于鉴定本发明 的马铃薯株系PAADGN的植物的试剂盒，所述试剂盒包含具有SEQ ID  NO：10的核苷酸序列的探针。

本发明所包括的方法和试剂盒可用于不同目的，例如但不限于下述这 些：用于在植物材料或产品(例如但不限于食品或饲料产品(新鲜的或经 加工的))中鉴定马铃薯株系PAADGN或源于此类株系的产品。此外或 备选地，本发明的方法和试剂盒可用于鉴定转基因植物材料(用于分离转 基因和非转基因材料的目的)；此外或备选地，本发明的方法和试剂盒可 用于测定包含马铃薯株系PAADGN的植物材料的质量(即，纯材料百分 比)。

支链淀粉马铃薯株系，马铃薯株系PAADGN是通过用导致颗粒结合 淀粉合酶(GBSS)表达大幅降低的RNA干扰构建体转化母系淀粉马铃薯 品种Kuras来开发的。在淀粉级分中，转基因马铃薯株系PAADGN的块 茎含有至少98％的支链淀粉(支化链淀粉组分)，伴随直链淀粉水平的大 幅降低。编码来自拟南芥的乙酰羟酸合酶(AHAS)的基因的csr1-2等位 基因作为可选择标记包括于转化过程中。

SEQ ID NO：1所公开的载体可被用于转化植物，优选地，转化马铃薯 的植物品种。

此类植物还可被进一步繁殖，以将本发明的马铃薯株系PAADGN的 转基因序列引入相同植物物种的其它栽培种中。

可使用不同的马铃薯品种进行转化。

用于转化的优选马铃薯品种是用于商业马铃薯淀粉生产的那些，例如 但不限于Tomensa、Sirius、Power、Mercury、Terra、Ponto、Albatros、 Elkana、Stabilo、Kardent、Ceres、Orlando、Indira、Bonanza、Astarte、 Kuras、Festien、Oktan、Eurostarch、Amado、Amyla、Aspirant、Avano、 Logo、Quadriga、Ramses、Roberta、Sibu、Toccata、Terrana、Karlena、 Canasta、Kuba和Ramses。

最优选的马铃薯品种是品种Kuras。

作为载体SEQ ID NO：1或插入物SEQ ID NO：2中的选择标记，使用 AHAS抗性标记SEQ ID NO：5(图6)，如US 5,767,366所公开的。替代 性地，可使用其它AHAS抗性标记。或者，可用植物技术中使用的其它抗 性标记来替代AHAS抗性标记。

乙酰羟酸合酶(EC 4.1.3.18；AHAS；乙酰乳酸合酶)是以两条平行 途径催化分支化链氨基酸缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸合成第一步的酶。在 缬氨酸和亮氨酸生物合成中，AHAS催化两个丙酮酸分子缩合导致的乙酰 乳酸产生。而在异亮氨酸生物合成中，AHAS将一个丙酮酸分子与一个2- 氧代丁酸分子缩合，形成乙酰羟基丁酸(Umbarger，H.E.，in Synthesis of  Amino Acids and Proteins，(1975)，1-56，MTP International Review of  Science，Butterworth，London)。对高等植物中AHAS基因的序列比较显 示了至少10个区域中的高度保守。这些区域对AHAS功能可能非常重要。 在烟草中，被命名为SuRA和SuRB的两个不相连的基因编码AHAS酶催 化性亚基。而在拟南芥中并非如此，拟南芥中仅一个基因编码该酶。

AHAS是若干类除草剂的靶标酶，所述除草剂包括磺酰脲类(Ray， T.B.，Plant Physiology(1984)，75，827-831)、咪唑啉酮类(Shaner等人， Plant Physiology(1984)，76，545-546)、三唑嘧啶类(Subrimanian，M.V.， Gerwick，B.C.，in Biocatalysis in Agricultural Biotechnology，pp277-288， ACS Symposium Series No.389(1989)，American Chemical Society， Washington DC)和嘧啶基氧基苯甲酸酯类(Hawkes，T.R.，in Prospects for  Amino Acid Biosynthesis Inhibitors in Crop Protection and  Pharmaceutical Chemistry，pp131-138，British Crop Protection Council  Monograph No.42(1989)，Surrey UK)。除草剂防止植物合成支化氨基酸， 并且可导致植物死亡。但是，AHAS基因中的突变因为降低了酶和除草剂 之间的亲和性故而可导致对这些除草剂的更高耐受性(US 5,013,659)。

在植物中，赋予对除草剂的抗性的突变是作为重复暴露给化合物的结 果产生的，如针对拟南芥所报道的。一旦突变的基因被分离，它们可被用 于对植物进行遗传工程化，获得改进的除草剂耐性。例如，拟南芥AHAS 基因中的突变已产生，并成功赋予了对咪唑啉酮类的抗性，如WO 00/26390、US 5,767,366和US 6,225,105所述。谷类AHAS基因中的突变 向单子叶植物赋予咪唑啉酮类抗性，如EP 0 525 384所述。

本发明的AHAS基因的突变体等位基因赋予对咪唑啉酮类除草剂的抗 性。被赋予对其的所述抗性的除草剂种类例如美国专利No：4,188,487、 4,201,565、4,221,586、4,297,128、4,554,013、4,608,079、4,638,068、4,747,301、 4,650,514、4,698,092、4,701,208、4,709；036、4,752；323、4,772,311和4,798,619 中所述。

赋予对AHAS抑制性除草剂的抗性的AHAS基因突变体等位基因被描 述于US 5,013,659、US 5,141,870和US 5,378,824中。

本发明的AHAS基因的其它突变体等位基因还可赋予对磺酰脲类除草 剂的抗性。赋予磺酰脲类抗性的突变体类型被描述于例如US 5,853,973和 US 5,928,937中。

赋予对咪唑啉酮类型除草剂抗性的AHAS基因突变体等位基因被描述 于WO 00/26390和US 5,767,366中。

此外Duggleby，R.G.和Pang，S.S.在Journal of Biochemistry and  Molecular Biology 33(1)，1-36(2000)中描述了能被用于本发明以向转基因 马铃薯植物赋予除草剂抗性的AHAS基因突变。

在WO 00/26390中，公开了编码真核AHAS小亚基蛋白的额外基因组 序列和cDNA序列。DNA序列和载体用于转化植物，以产生具有升高的除 草剂(例如咪唑啉酮类)耐性或抗性水平的转基因植物。

本领域技术人员应当理解，SEQ ID NO：5中描述的核酸序列并非能用 于赋予咪唑啉酮类特异性抗性的唯一序列。还包括编码相同蛋白但是由于 遗传密码简并性具有不同核苷酸序列的那些核酸序列。本发明还包括编码 AHAS序列的基因，其中存在上述突变，但其也编码分子中与除草剂抗性 或催化功能不相关的位置上的一个或多个沉默氨基酸改变。还包括来自其 它咪唑啉酮类抗性单子叶或双子叶植物的、在序列相应区域具有突变的基 因序列。

AHAS基因的突变等位基因可用于生产除草剂抗性植物，产生对特定 除草剂的田间抗性，或可用作为选择标记用于对植物的遗传工程。

为在马铃薯中表达赋予除草剂抗性的经突变的AHAS基因，可使用下 述启动子：

-WO 92/11376中描述的来自马铃薯的块茎特异性gbss启动子，和 Rocha-Sosa等人，1989 EMBO J.8：23-29中描述的patatin启动子；

-光可诱导启动子：WO 98/18940中描述的来自马铃薯的胞质 FBPase；

-章鱼碱启动子(US 5,428,147)；来自甜菜(Beta vulgaris)的三OCS 增强的vATPase c1(triple OCS enhanced vATPase c1)启动子(Plant Mol  Biol(1999)39：463-475)；

-组成型启动子：参考文献见Benfey等人，EMBO J.8(1989)， 2195-2202；35S启动子(Franck等人，Cell 21，(1980)，285-294)或增强版 本；19S启动子，见US 5,352,605和WO 84/02913；

-RUBISCO小亚基SSU启动子：见US 4,962,028；

-如US 6,025,541所描述的AHAS启动子；

-用于在马铃薯植物的叶、愈伤组织、特定组织(例如块茎)或其它 部分表达基因的其它启动子也可使用。

尤其地，本发明可通过使用nos启动子、AHAS抗性基因S653N (US 5,767,366中描述的)和nos终止子来进行。

用于转化和选择的拟南芥AHAS基因(S653N)含有用于克隆的常见 限制性位点中的大多数，例如HindIII、BamHI、EcoRI、SstI、BglII和 EcoRV。可改变AHAS基因分子组成，以消除限制性位点，而不改变得到 的蛋白的氨基酸序列。在此进行过程中，可考虑改变密码子使用情况，以 针对翻译效率和RNA稳定性对其加以改进(消除潜在存在的可能剪接位 点和/或聚腺苷酸化信号)。

为选择转基因马铃薯植物，可使用抑制AHAS酶的化合物。有用的化 合物是咪唑啉型的除草剂。尤其有用的化合物选自咪草烟(imazethapyr) 甲氧咪草烟(imazamox)咪草酸 (imazamethabenz)灭草烟(imazapyr)甲 基咪草烟(imazapic)和imazaquinon构成的组。

为选择转基因植物，可使用Duggleby，R.G.和Pang，S.S.于Journal of  Biochemistry and Molecular Biology 33(1)，1-36(2000)的综述文章中描述 的化合物。

当遗传材料被引入植物细胞的种群，仅少部分细胞被成功转化。为生 产新颖的经遗传修饰的植物，将选择系统与性状基因一起转化，提供具有 选择性生长优势的经转化细胞。该构建体允许通过添加有利于经转化的枝 条(shoot)再生的化合物将经转化的细胞与未经转化的细胞选择开。

可用于代替AHAS抗性标记的其它可选择标记基因例如但不限于，双 丙氨膦抗性基因(bar)和卡那霉素或G418抗性基因(NPTII)。

在想要的基因座插入转基因可通过被称为基因靶向的同源重组来实 现。为实现此，将同源于想要的插入位点的序列置于目的转基因盒周围 (Hanin等人，2001，Plant J.28(6)：671-7)。转化后，针对在想要的基因座 具有插入的那些株系对转基因株系加以筛选。技术人员显然知道如何鉴定 靶向插入，例如通过PCR或Southern杂交来进行。

在植物中基因靶向是可能的，但是是相当少见的事件(Hanin & Paszkowski 2003 Current Opinion Plant Biol.6(2)：157-62)。本领域技术人 员将知道如何改进基因靶向频率。例如，可通过表达协助同源重组过程的 蛋白(例如酵母RAD54)来增加基因靶向频率(Shaked等人2005 Proc Natl  Acad Sci USA 102(34)：12265-9)。另一手段是通过强的阳性-阴性选择系统 来协助对基因靶向株系的检测(Iida & Terada 2005 Plant Mol.Biol 59： 205-219)。在此手段中，阴性可选择标记位于转化构建体上同源序列的外 部。由此，仅那些具有随机插入的转基因序列的转基因植物含有阴性可选 择标记，而通过基因靶向获得的转基因株系不包含阴性可选择标记。

此外，通过在想要的插入位点或附近引入DNA双链断裂，可极大地 增加基因靶向频率。本领域技术人员将知道这如何实现。例如，可对天然 存在的回归内切核酸酶(也被称为大范围核酸酶，例如I-CreI)加以修饰， 使得它们识别和切割新DNA序列，即，基因组中想要的插入位点上或附 近的序列(WO 07/047859，WO 07/049156)。或者，可设计所谓的锌指核 酸酶，其包含与锌指(其特异性识别想要的DNA序列)连接的非特异性 核酸酶结构域(通常从FokI核酸酶获得)(比较例如Trends Biotechnol. 2005 23(12)：567-9；Cell Mol Life Sci.200764(22)：2933-44；WO 08/021207)。

基因靶向可用于获得与PAADGN相似的株系，这通过在与株系 PAADGN中发现的基本相同的插入位点插入包含GBSS RNAi盒(例如 SEQ ID 15或SEQ ID NO：17)的转基因构建体来实现。本领域技术人员 将知道，插入位点可有数个碱基对或多至数千个碱基对不同，但仍获得较 之株系PAADGN具有相似有益特征的相似株系。基因靶向可特别用于在 并非Kuras的马铃薯品种中建立与PAADGN相似的株系。基于更特别适 于在不同马铃薯种植区域发现的环境条件的其它品种，建立此类相应株系 可能是人们感兴趣的。

本发明基于下述目的：使得具有高老化稳定性的支链淀粉型淀粉可获 得。

在本发明的一种实施方式中，具有高老化稳定性的支链淀粉型淀粉特 征在于老化值G’(3-0w)在10Pa以下、9Pa以下或甚至8Pa以下。

在本发明的更优选的实施方式中，具有高老化稳定性的支链淀粉型淀 粉特征在于老化值G’(3-0w)在7Pa以下、6Pa以下、5Pa以下、4Pa以 下或者甚至3Pa以下。

在本发明的最优选的实施方式中，具有高老化稳定性的支链淀粉型淀 粉特征在于老化值G’(3-0w)在2Pa以下或者甚至1Pa以下。

通过包含核酸序列SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：16 或SEQ ID NO：15的转基因马铃薯株系生产的支链淀粉型淀粉可至少额外 具有下述物理化学性质之一：如果较之目前生产的支链淀粉型马铃薯淀粉 而言，更低的直链淀粉含量、更高的黏度水平、更高的磷水平和/或更低的 蛋白水平。

此外，本发明提供了具有高老化稳定性的支链淀粉型淀粉，其特征在 于磷含量高于0.085％，更优选高于0.090％，最优选0.095％或者甚至高于 0.095％。

此外，本发明提供了具有高老化稳定性的支链淀粉型淀粉，其特征在 于蛋白含量低于0.03％，优选低于0.025％，更优选低于0.20％，最优选 0.017％或者甚至低于0.017％。

本发明的另一特征是：本发明支链淀粉型淀粉的直链淀粉含量在1％ 以下，优选0.9％以下，更优选0.8％以下，最优选0.7％或者甚至0.7％以 下。

此外，本发明的另一特征是：本发明的支链淀粉型淀粉的胶凝温度低 于转基因马铃薯株系EH92-527-1生产的支链淀粉型淀粉。

此外，较之来自例如马铃薯栽培种Bonanza、Kuras和Prevalent的淀 粉的峰黏度而言，来自包含核酸序列SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：17、SEQ  ID NO：16或SEQ ID NO：15的转基因马铃薯株系的支链淀粉型淀粉的峰 黏度有所增加。

较之来自马铃薯株系EH92-527-1的支链淀粉型淀粉和来自例如马铃 薯栽培种Bonanza、Kuras和Prevalent的淀粉的蛋白含量而言，来自包含 核酸序列SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO： 15的转基因马铃薯株系的支链淀粉型淀粉的蛋白含量有所降低。

此外，较之来自马铃薯株系EH92-527-1的支链淀粉型淀粉和来自例 如马铃薯栽培种Bonanza、Kuras和Prevalent的淀粉的磷含量而言，来自 包含核酸序列SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：16或SEQ ID  NO：15的转基因马铃薯株系的支链淀粉型淀粉的磷含量有所增加。

实施例16所示的四个冻融循环的每个之后，PAADGN支链淀粉型淀 粉的透射(transmission)都高于EH92-527-1支链淀粉型淀粉。因此，较 之EH92-527-1支链淀粉型淀粉，多至四个冻融循环后，PAADGN支链淀 粉型淀粉显示出更高的老化稳定性。

应当理解，本发明的特定实施方式被本文所附从属权利要求描述。

在说明书和实施例中，提到下述序列：

SEQ ID NO：1：

质粒VC-PMA12-1[AP4]qcz2

SEQ ID NO：2：

株系PAADGN中的插入位点，特征在于转基因DNA以及马铃薯天然 的上游和下游序列(侧翼序列)

SEQ ID NO：3：

c-RNAigbss450(见图4)

SEQ ID NO：4：

mf-间隔区cGBSS(见图5)

SEQ ID NO：5：

c-AtAHASL[csr1-2o]-AHASL抗性基因(见图6)

SEQ ID NO：6：

转基因马铃薯株系PAADGN中，相对SEQ ID：2中给出的来自 VC-PMA12-1[AP4]qcz2的T-DNA的部分的插入位点而言上游的基因组马 铃薯序列(见图7)

SEQ ID NO：7：

转基因马铃薯株系PAADGN中，相对SEQ ID：2中给出的来自 VC-PMA12-1[AP4]qcz2的T-DNA的部分的插入位点而言下游的基因组马 铃薯序列(见图8)

SEQ ID NO：8：

正向引物         5′-TGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAA-3′

SEQ ID NO：9：

反向引物         5′-AAATGCGAGGGTGCCATAGA-3′

SEQ ID NO：10：

PCR探针          5′TATTTCTGATTTCATGCAGGTCGACTTGCA-3′

SEQ ID NO：11：

引物

AP4L1            5’-CGGATTAAATACTGAGAGCTCGAATTTCC-3’

SEQ ID NO：12：

引物

AP4L2            5’-TGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATAT-3’

SEQ ID NO：13：

引物

AP4R1            5’-TTTGTATCCTGATTACTCCGTCAACAGCC-3’

SEQ ID NO：14：

引物

AP4R2            5’-TTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCC-3’

SEQ ID NO：15

p-GBSS-RNAi-间隔区-RNAi-nosT

SEQ ID NO：16

RNAi-间隔区-RNAi

SEQ ID NO：17

株系PAADGN插入位点处的T-DNA的部分

SEQ ID NO：18

正向引物         5’-GCCGATGATCCCGAATGGT-3’

SEQ ID NO：19

反向引物         5’-GATGCCTAACACCTTCCCT-3’

SEQ ID NO：20

正向引物         5’-AATTGAAAATAAAACTTACCT-3’

SEQ ID NO：21

反向引物         5’-TTGGCGTAATCATGGTCAT-3’

SEQ ID NO：22

正向引物         5’-TCTCAGCAAATGCGAGGGT-3’

SEQ ID NO：23

反向引物         5’-GATGCCTAACACCTTCCCT-3’

SEQ ID NO：24

正向引物         5’-AATTGAAAATAAAACTTACCT-3’

SEQ ID NO：25

反向引物         5’-TTGGCGTAATCATGGTCAT-3’

SEQ ID NO：26

正向引物         5’-TCTCAGCAAATGCGAGGGT-3’

SEQ ID NO：27

反向引物         5’-GATGCCTAACACCTTCCCT-3’

SEQ ID NO：28

正向引物         5’-AATTGAAAATAAAACTTACCT-3’

SEQ ID NO：29

反向引物         5’-TTGGCGTAATCATGGTCAT-3’

SEQ ID NO：30

正向引物         5’-CCATCAAGCGTCTATCAAATTTTTCAT-3’

SEQ ID NO：31

反向引物         5’-CTGATTGTCGTTTCCCGCCTTC-3’

SEQ ID NO：32

PCR探针          5’-CAGTGTTTGCGAACGAACATTTTAGGA-3’

SEQ ID NO：33

PCR片段          5’-

CCATCAAGCGTCTATCAAATTTTTCATCCACATTTAAATTTATTAGATATCCTAAAATGTTCG

TTCGCAAACACTGATAGTTTAAACTGAAGGCGGGAAACGACAATCAG-3’

SEQ ID NO：34

正向引物         5’-CGTCTATCAAATTTTTCATCCACATT-3’

SEQ ID NO：35

反向引物         5’-TGTCGTTTCCCGCCTTCA-3’

SEQ ID NO：36

PCR探针          5’-TTCGTTCGCAAACACTGATAGTTTAA-3’

SEQ ID NO：37

PCR片段          5’-

CGTCTATCAAATTTTTCATCCACATTTAAATTTATTAGATATCCTAAAATGTTCGTTCGCAAA

CACTGATAGTTTAAACTGAAGGCGGGAAACGACA-3’

SEQ ID NO：38

正向引物         5’-aagctttaacgagataga-3’

SEQ ID NO：39

反向引物         5’-gatctagtaacatagat-3’

SEQ ID NO：40

正向引物         5’-caaacactgatagtttaaa-3’

SEQ ID NO：41

反向引物         5’-tcctagtttgcgcgctatat-3’

SEQ ID NO：42

正向引物         5’-taaacatgttggaataaaact-3’

SEQ ID NO：43

反向引物         5’-aggacatgcatttttatcct-3’

SEQ ID NO：44

正向引物         5’-atttcatgcaggtcgact-3’

SEQ ID NO：45

反向引物         5’-tcggggaaattcgagctct-3’

SEQ ID NO：46

RNAi-间隔区-RNAi加引物结合物

SEQ ID NO：47

株系PAADGN中的插入位点，特征在于转基因DNA以及马铃薯天然 的上游和下游序列(侧翼序列)

此外，本发明如下所公开：

A.来自马铃薯植物的支链淀粉型淀粉，其具有至少98％的支链淀粉 含量，具有高老化稳定性，其特征在于老化值G’(3-0w)在9Pa以下。

B.根据A的支链淀粉型淀粉，其特征在于老化值G’(3-0w)在2Pa以 下。

C.根据A或B的支链淀粉型淀粉，其特征在于磷含量高于0.09％。

D.根据A、B或C的任一项的支链淀粉型淀粉，其特征在于蛋白质含 量低于0.02％。

E.根据A、B、C或D的任一项的支链淀粉型淀粉，其特征在于所述 马铃薯植物是转基因的。

F.生产根据A、B、C、D或E的具有高老化稳定性的支链淀粉型淀 粉的方法，所述方法特征在于，用包含核酸序列SEQ ID NO：16的载体转 化马铃薯植物，选择在基因组中包含SEQ ID NO：16的转基因马铃薯植物， 选择生产具有9Pa以下的老化值G’(3-0w)的支链淀粉型淀粉的转基因马铃 薯植物，繁殖所选择的转基因植物，并且从此类植物分离支链淀粉型淀粉。

G.生产根据A、B、C、D或E的具有高老化稳定性的支链淀粉型淀 粉的方法，所述方法特征在于，用包含核酸序列SEQ ID NO：15的载体转 化马铃薯植物，选择在基因组中包含SEQ ID NO：15的转基因马铃薯植物 和选择生产具有9Pa以下的老化值G’(3-0w)的支链淀粉型淀粉的转基因马 铃薯植物，繁殖所选择的转基因植物，并且从此类植物分离支链淀粉型淀 粉。

H.生产根据A、B、C、D或E的具有高老化稳定性的支链淀粉型淀 粉的方法，所述方法特征在于，用包含核酸序列SEQ ID NO：17的载体转 化马铃薯植物，选择在基因组中包含SEQ ID NO：17的转基因马铃薯植物 和选择生产具有9Pa以下的老化值G’(3-0w)的支链淀粉型淀粉的转基因马 铃薯植物，繁殖所选择的转基因植物，并且从此类植物分离支链淀粉型淀 粉。

I.生产根据A、B、C、D或E的具有高老化稳定性的支链淀粉型淀 粉的方法，所述方法特征在于，用包含核酸序列SEQ ID NO：17的载体转 化马铃薯植物，选择在基因组中包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：47的 转基因马铃薯植物和选择生产具有9Pa以下的老化值G’(3-0w)的支链淀粉 型淀粉的转基因马铃薯植物，繁殖所选择的转基因植物，并且从此类植物 分离支链淀粉型淀粉。

J.生产下述转基因马铃薯植物的方法，所述转基因马铃薯植物生产根 据A、B、C、D或E的具有高老化稳定性的支链淀粉型淀粉，所述方法特 征在于，用包含核酸序列SEQ ID NO：16的载体转化马铃薯植物，选择在 基因组中包含SEQ ID NO：16的转基因马铃薯植物和选择生产具有9Pa 以下的老化值G’(3-0w)的支链淀粉型淀粉的转基因马铃薯植物。

K.生产下述转基因马铃薯植物的方法，所述转基因马铃薯植物生产根 据A、B、C、D或E的具有高老化稳定性的支链淀粉型淀粉，所述方法特 征在于，用包含核酸序列SEQ ID NO：15的载体转化马铃薯植物，选择在 基因组中包含SEQ ID NO：15的转基因马铃薯植物和选择生产具有9Pa 以下的老化值G’(3-0w)的支链淀粉型淀粉的转基因马铃薯植物。

L.生产下述转基因马铃薯植物的方法，所述转基因马铃薯植物生产根 据A、B、C、D或E的具有高老化稳定性的支链淀粉型淀粉，所述方法特 征在于，用包含核酸序列SEQ ID NO：17的载体转化马铃薯植物，选择在 基因组中包含SEQ ID NO：17的转基因马铃薯植物和选择生产具有9Pa 以下的老化值G’(3-0w)的支链淀粉型淀粉的转基因马铃薯植物。

M.生产下述转基因马铃薯植物的方法，所述转基因马铃薯植物生产 根据A、B、C、D或E的具有高老化稳定性的支链淀粉型淀粉，所述方法 特征在于，用包含核酸序列SEQ ID NO：17的载体转化马铃薯植物，选择 在基因组中包含SEQ ID NO：2的转基因马铃薯植物和选择生产具有9Pa 以下的老化值G’(3-0w)的支链淀粉型淀粉的转基因马铃薯植物。

N.根据J、K、L或M中任何一项生产的转基因马铃薯植物、种子、 块茎、植物细胞或植物组织。

O.根据方法J、K、L或M生产的转基因马铃薯植物、种子、块茎、 植物细胞或植物组织，其特征在于，使用聚合酶链式反应以及使用分别具 有核苷酸序列SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9的两条引物，基因组DNA 可用于扩增77个碱基对的DNA片段。

P.通过将根据方法J、K、L或M的任一项生产的转基因植物与非转 基因马铃薯植物杂交获得的转基因马铃薯植物、种子、块茎、植物细胞或 植物组织，以及选择生产具有9Pa以下的老化值G’(3-0w)的支链淀粉型淀 粉的转基因马铃薯植物。

Q.核酸序列SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：6，SEQ ID  NO：7，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO 16或SEQ ID NO：17用于生产或检测 下述转基因马铃薯植物的用途，所述转基因马铃薯植物生产具有9Pa以下 的老化值G’(3-0w)的支链淀粉型淀粉。

下述实施例描述了对具有转基因株系PAADGN的马铃薯植物的开发 和特征。

实施例

实施例1

构建质粒VC-PMA12-1[AP4]qcz2

为构建二元载体VC-PMA12-1[AP4]qcz2(SEQ ID NO：1-图1和图 2)，使用携带有突变S653N的AHAS基因SEQ ID NO：5，其源于拟南芥 (Arabidopsis thaliana)(Sathasivan，K.等人，1991，Plant Physiology 97： 1044-1050)。为从AHAS基因除去限制性位点，使用编码相同氨基酸序 列的合成版本。将AHAS基因置于nos启动子(见Herrera-Estrella，L.等 人，1983，Nature 303：209-213)和nos终止子的控制下。从马铃薯分离GBSS 启动子和GBSS编码序列，并将其克隆进RNAi构型。通过由GBSS编码 序列SEQ ID NO：4构成的间隔区(spacer)分开GBSS基因的正义和反义 (SEQ ID NO：3)部分。nos终止子用于GBBS RNAi的下游，以允许转 录本在马铃薯中正确聚腺苷酸化。AHAS基因SEQ ID NO：5和GBSS RNAi盒(SEQ ID NO：15)被克隆进基于pSUN的二元载体(US 7,303,909)， 产生作为SEQ ID NO：1提供的序列，还见表1。

表1

特征

实施例2

将VC-PMA12-1[AP4]qcz2转化进马铃薯植物

Andersson等人(2003)在Plant Cell Rep 22：261-267中描述了用于转化 马铃薯植物的方法。

使用电穿孔，将包含如表1公开的特征的VC-PMA12-1[AP4]qcz2 (SEQ ID NO：1-图1)转化进农杆菌菌株LBA4404。

将含有VC-PMA12-1[AP4]qcz2的根癌农杆菌(Agrobacterium  tumefaciens)菌株LBA4404培养于含有1g/l利福平和1g/l壮观霉素的酵 母提取培养液(YEB)培养基中，以持续振荡于28℃培养过夜。

马铃薯转化方案基于Visser(1991)，Regeneration and transformation  of potato by Agrobacterium tumefaciens.于：Lindsey K(编著)Plant tissue  culture manual.Kluwer，Dordrecht，B5：1-9)的方案，并有一些修改 (Andersson等人，2003 Plant Cell Rep 22：261-267)。

所有植物材料培养于具有2.5g/l Gelrite(Duchefa)的固体培养基上， 这在92x 16mm培养皿上以16小时光照周期(以60-70mmol m^-2s^-1)进 行。从体外繁殖的马铃薯植物的完全扩张的叶子按对角线切为2-4片，并 于23-24℃将其在盖有一张灭菌滤纸的MC-板[M300板(4.4g/l Murashige 和Skoog(1962，Physiol.Plant 15：473-497)培养基(MS培养基)，2mg/l a-萘乙酸(NAA)，1mg/l 6-苄氨基嘌呤(BAP)，3％(w/v)蔗糖，pH 5.2)， 其具有1.5-2ml液体M100培养基(4.4mg/l MS培养基，30g/l蔗糖，0.5mg/l 盐酸硫胺，0.5mg/l盐酸吡哆醇，1mg/l烟酸，0.5mg/l激动素，29.8mg/l FeSO4.7H2O，1mg/l 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)，2g/l酪蛋白水解产物，pH 5.2)]上预培育2-3天。

通过用MS10培养基(4.4g/l MS培养基，1％(w/v)蔗糖，pH 5.8) 进行1∶20稀释来制备用于接种的细菌培养物。通过在细菌溶液中浸没8-10 分钟感染来自马铃薯(品种Kuras)的叶外植体，之后在滤纸上排水5-20 秒。将叶切片放置在MS300板上，于23-24℃共培养2天。在共培养结束 时，将叶切片移到MS400板(4.4g/l MS培养基，2mg/l玉米素(zeatine)， 0.01mg/l NAA，0.1mg/l赤霉酸(GA3)，10％(w/v)蔗糖，pH 5.8)上， 该板含有400mg/l头孢噻肟(claforan)，以遏制细菌生长。4-5天后，将 外植体移至补充有400mg/l的头孢噻肟和500mM甲氧咪草烟的选择培养 基MS400。

每两周将叶切片转移至新鲜的MS400选择培养基。收集再生的可能的 转基因枝条，培育于含有200mg/l头孢噻肟的MS30(4.4g/l MS培养基， 3％(w/v)蔗糖，pH 5.8)板上，目的是枝条延长。从外植体上剖离由其 捡出枝条的愈伤组织，防止相同转基因株系的再选择。

为产生微块茎，从3-5cm长的枝条上切下1-2cm，并将其在黑暗下于 25℃培养于微块茎诱导培养基(4.4g/l MS培养基，2.5mg/l激动素，0.5mg/l 脱落酸(ABA)，8％蔗糖，200mg/l头孢噻肟)上。2-5周后，产生微块 茎。

实施例3

对转基因马铃薯株系的选择

使用碘染色对所有获得的马铃薯株系进行初始筛选，以鉴定出支链淀 粉型马铃薯淀粉高的株系。通过将一块微块茎磨碎并加入数滴碘溶液 (Lugol’s溶液(6.7g/l KI+3.3g/l I₂)和甘油1∶1)来进行视觉筛选。在 显微镜下观察样品。通过样品的红棕色至紫色着色，鉴定出具有高支链淀 粉含量的株系。

对产生高支链淀粉型淀粉的转基因株系进行分子分析，以鉴定出包含 SEQ ID NO：15的单插入株系——关于SEQ ID NO：15的特定特征参见表 2。

表2

特征

或者，对产生高支链淀粉型淀粉的转基因株系进行分子分析，以鉴定 出包含SEQ ID NO：16的单插入株系——关于SEQ ID NO：16的特定特征 参见表3。

表3

特征

对产生高支链淀粉型淀粉的转基因株系进行分子分析，以鉴定出包含 SEQ ID NO：17的单插入株系——关于SEQ ID NO：17的特定特征参见表 4。

表4

特征

对产生高支链淀粉型淀粉的转基因株系进行分子分析，以鉴定出包含 SEQ ID NO：2的单插入株系——关于SEQ ID NO：2的特定特征参见表5。

选择来用于进一步分析的具有高支链淀粉含量的一种单插入株系是 PAADGN。

表5

特征

使用实时PCR(ABI Prism 7900HT，Applied Biosystems)，在叶组织 DNA上进行拷贝数分析。使用gbss基因作为内源对照。使用Wizard  Magnetic 96 DNA plant系统(Promega)，基本按照制造商说明书，来分 离DNA。使用三颗不锈钢珠(3.2mm)，在混合磨MM300(Retsch)上 以25Hz进行2x 30秒的冷冻马铃薯叶组织匀浆。用100μl新鲜的 Millipore水来洗脱DNA样品，并稀释五倍，之后进行分析。

使用下述参数，用ABI 7900HT机器来进行实时PCR：

例如，为测定T-DNA插入的拷贝数，使用下述引物和探针：

正向引物SEQ ID NO：8

5′-TGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAA-3′

反向引物SEQ ID NO：9

5′-AAATGCGAGGGTGCCATAGA-3′

探针SEQ ID NO：10

5′TATTTCTGATTTCATGCAGGTCGACTTGCA-3′

引物组在包含SEQ ID NO：2、15或17的插入物中扩增边界在p-gbss 启动子和c-RNAi450gbss元件之间的77bp区域。

株系PAADGN特征在于基因组中包含核酸序列SEQ ID NO：2——还 见表5中的特定特征。

此外，株系PAADGN特征在于基因组中包含核酸序列SEQ ID NO： 47。

株系PAADGN特征在于基因组中包含核酸序列SEQ ID NO：15—— 还见表2中的特定特征。

株系PAADGN特征在于基因组中包含核酸序列SEQ ID NO：16—— 还见表3中的特定特征。

此外，株系PAADGN特征还在于基因组中包含核酸序列SEQ ID NO： 17——还见表4中的特定特征。

实施例4

测定马铃薯株系PAADGN中的插入位点

使用Wizard Magnetic 96 DNA plant系统(Promega)，基本按照制 造商说明书，来从株系PAADGN分离基因组DNA。使用GenomeWalker 试剂盒(Clontech)，按照制造商说明书，测定插入的侧翼序列。

已使用下述引物：

AP4L1   CGGATTAAATACTGAGAGCTCGAATTTCC  -SEQ ID NO：11

AP4L2   TGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATAT  -SEQ ID NO：12

AP4R1   TTTGTATCCTGATTACTCCGTCAACAGCC  -SEQ ID NO：13

AP4R2   TTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCC  -SEQ ID NO：14

用于第一和第二(嵌套)GenomeWalker PCR的设置以及PCR条件 如下所示：

将获得的PCR产物克隆并繁殖于大肠杆菌中。各克隆在液体培养物中 培养过夜，分离质粒DNA，测定核苷酸序列。左边界侧翼区域已被鉴定为 由八个分离的克隆所代表。左边界区域是截短的，这导致左边界、一些载 体DNA和nos终止子的38bp丢失。左T-DNA边界(b-LB)下游的2418 bp的侧翼DNA(SEQ ID NO：7)已被分离，其显示出与野生马铃薯 (Solanum demissum)染色体5的同源性。

针对右边界侧翼序列的七个克隆代表了相同的侧翼类型。T-DNA是截 短的，其导致右边界部分丢失。右T-DNA边界(b-RB)上游的1076bp 的染色体DNA(SEQ ID NO：6)已被分离，其与野生马铃薯(Solanum  demissum)染色体5具有强同源性。

侧翼区域具有下述序列：

转基因马铃薯株系PAADGN中，来自VC-PMA12-1[AP4]qcz2的 T-DNA的部分的插入位点上游的基因组马铃薯序列被公开于图7和SEQ  ID NO：6中。

转基因马铃薯株系PAADGN中，来自VC-PMA12-1[AP4]qcz2的 T-DNa的部分的插入位点下游的基因组马铃薯序列被公开于图8和SEQ  ID NO：7中。

实施例5

田间试验

用于比较品种马铃薯品种Kuras、Prevalent和Bonanza的播种材料获 得自商业种子块茎来源。

Kuras受欧盟植物品种保护权(Plant Variety Protection Right in EU) (CPVO-档案号1995/1123)保护，其注册于法国、荷兰、奥地利和德 国。

Prevalent可从IPK-Genbank，Leibniz-Institut für Pflanzengenetik- und Kulturpflanzenforschung(IPK)；Parkweg 3a，18190GroβLüsewitz， 德国订购。

Bonanza可从Science and Advice for Scottish Agriculture(SASA)， Roddinglaw Road，Edingburgh，EH 12 9FJ；英国或Norika GmbH， Parkweg 4，18190 GroβLüsewitz，德国订购。

按照实施例1至3公开的方法，生产转基因马铃薯株系PAADGN。

按照EP 0563189公开的方法，生产转基因马铃薯株系EH92-527-1。

田间试验作为具有单次重复的条带试验进行。每块土地由每进入(per  entry)四条4.5m长的列构成，列间距0.75m。

在每个位置的土地和作物管理操作，包括害虫、病原体和杂草管理， 按照针对田间试验所在的每个特定区域所推荐的来进行。用于试验的所有 土地都具有用于生产作物的长期历史。基于土壤分析和当地推荐，通过添 加肥料(氮、磷和/或钾)为种植准备田地，并对其圆盘犁耕地(disc tilled)， 以确保苗床均匀。用手以3至4块茎/m(取决于当地推荐)或每ha大约 44,000植物的密度种植种子块茎。种植在四至六月间完成。为确保每次田 间试验中马铃薯植物成功完成生长和发育，按照当地推荐以及保护植物免 遭昆虫、真菌和杂草侵袭的需求，在每个位置应用杀虫剂、杀真菌剂和除 草剂。应用的杀虫剂化学品包括噻虫啉(thiacloprid)、杀灭阿菊酯 (esfenvalerate)、pymetrizone、高效氯氟氰菊酯(lambda-cyhalothrin) 和clothiodin。应用于控制真菌(主要是致病疫霉(Phytophthora infestans) 和索兰尼链格孢(Alternaria solani))的化学品包括氟啶胺(fluazinam)、 氟啶胺+甲霜灵(metalaxyl)、propamacarb+百菌清(chlorothalonil)、 propamacarb+氧吡菌胺(fluopicolide)、百菌清(Chlorothalonil)、氰霜唑 (cyazofamid)、苯噻菌胺(benthiavalicarb)+代森锰锌(mancozeb)、 烯酰吗啉(dimethomorph)+代森锰锌、戊唑醇(tebuconazole)+ fludioxanil和苯酰菌胺(zoxamide)+代森锰锌。采用苄草丹 (prosulfocarb)、异恶草松(clomazone)、利谷隆(linuron)、嗪草酮 (metribuzin)、玉嘧磺隆(rimsulfuron)或草甘膦(glyphosate)的萌发 前应用来控制杂草。在收获成熟期(harvest maturity)，用草铵膦 (glufosinate)或敌草快(diquat)烧掉作物株冠。在所有位置，在季节期 间使用杀虫剂、杀真菌剂和除草剂的不止一次应用和配方。

位置位于商业马铃薯生产代表性地区的区域。

在每个位置的土地和作物管理操作，包括害虫、病原体和杂草管理， 按照针对田间试验所在的每个特定区域所推荐的来进行。

在收获成熟期，应用敌草快、氟唑草酮(carfentrazone)或草铵膦烧 掉植物的绿色部分。使用马铃薯升运式挖掘机(elevator-digger)机械收获 马铃薯块茎，或者人工进行。在测定小块土地产量后，将马铃薯包装于双 麻袋(double jute)或编织袋(string sacks)中，加上标签，并准备运输。 在九月至十月之间启动收获。

使用马铃薯株系PAADGN与比较用株系的田间试验在不同位置进行。 作为比较株系，传统非转基因马铃薯品种Kuras、Bonanza、Prevalent和 转基因马铃薯株系EH92-527-1(授予欧洲植物品种保护权AMFLORA—— 申请档案号2003/1520)(生产＞98％支链淀粉的支链淀粉型淀粉)也被同 时种植。

实施例6

大规模淀粉分离

收获和暂时贮藏后，在试验性尺寸的淀粉生产机中加工马铃薯块茎。 在该过程中，淀粉颗粒从马铃薯组织的细胞结构中释放出。将淀粉与其它 组分，例如纤维、糖、蛋白和矿物质分离。

用水对马铃薯进行锉磨(锉磨来自Urschel，Lisses，法国)。在centri 筛(Larsson Mekaniska verkstad，瑞典)中将细胞壁(纤 维)与果实汁液和淀粉分开。该步骤后，在水力旋流器(Larsson  Mekaniska verkstad，瑞典)中，将果实汁液与淀粉分开。然后 在biichner漏斗上对分离的淀粉脱水，并在流床干燥机(GEA Process  Engineering Inc.，Columbia，美国)上于低于胶凝温度的温度下干燥。在该 机器中，一次可处理多至50kg的马铃薯。

使用该试验性的生产过程，对来自转基因和非转基因马铃薯品种的淀 粉加以分离，并将其用于详细的物理化学分析，如实施例7至13所公开的。 该马铃薯淀粉对来自正常大规模马铃薯淀粉生产的淀粉来说是完全代表性 的。

实施例7

黏度情况

为表征经遗传修饰的马铃薯植物的淀粉，测定多个参数。使用 Viscograph E(GmbH & Co.KG，Duisburg，德 国)，按照国际淀粉研究所(the international starch institute)(Science park  Aarhus；http://www.starch.dk/isi/methods/19brabender.htm)的ISI 19-6e/ICE 169来测量黏度情况。

在下述温度曲线期间测量4％(w/v)淀粉分散体系(水中/pH 6,5)的 黏度，所述温度曲线为：起始25℃，随后采取1¹/₂℃/分钟的温度增加速率， 在95℃保持25分钟，然后以1¹/₂℃/分钟冷却至25℃。

测定胶凝温度(黏度增加第一次达到20个Brabender单位(BU)时 的温度，和峰温度下的峰黏度(BU))。

实施例8

老化稳定性

按照下述程序来测定淀粉溶液的老化稳定性(有时也称为贮藏稳定 性)：

步骤1：将淀粉分散(4％，w/w)于Viscograph E (Brabender GmbH & Co.KG，Duisburg，德国)中的含有0.002％(w/v) NaN₃(用于防止贮藏期间的微生物生长)的蒸馏水中，其间伴随持续剪切 力和受控温度程序，如ICC-标准No.169 AACC Method No.61-01所述。 通过记录从20℃开始到100℃再冷却回20℃的整个温度范围的黏度行 为，可确认发生了100％胶凝，这是作为在步骤2中测量淀粉溶液老化行 为的起点的重要前提条件。

步骤2：在溶液于+5℃贮藏三周之前和之后，用Physica MCR 300流 变仪(Anton Paar GmbH；Graz；奥地利)，以振荡模式(1Hz)来测量老 化(G’)。使用同心圆筒杯(concentric cylinder cup)和摆动系统(bob  system)，cc27，于25℃和10^-1/秒的剪切力，以1Hz测定G’。具老化稳 定性的淀粉溶液特征在于贮藏后G’改变微小。因此，以帕斯卡(Pa)测量 的G’低改变值是最优选的。

术语G’(3-0w)是以帕斯卡(Pa)测量，其用于实施例12所示的表6 中，具有下述含义：在+5℃贮藏三周后测量的老化G’减去贮藏开始时测 量的老化G’。

实施例9

支链淀粉/直链淀粉含量

按照Klucinec，JD和Thompson，DB，2002.Cereal Chemistry 79， 24-35，使用酶促脱支淀粉的高效尺寸排阻色谱(HPSEC)，来分析支链 淀粉/直链淀粉含量。

对样品中支链淀粉和直链淀粉的测定是在高效尺寸排阻色谱 (HPSEC)系统上进行的。该系统由下述构成：来自Varian(Palo Alto(CA)， 美国)的泵(Prostar 220)和自动采样器(Prostar 400)，来自Polymer  Laboratories(Shropshire，英国)的三个SEC柱(PLgel Mixed-B，10μm)， 来自聚合物实验室的保护柱(PLgel Guard，10μm)，来自C.I.L的柱加热 器，来自Wyatt Technology(Dembach，德国)的RI检测仪(Optilab rex) 和MALS检测仪(Dawn eos)。通过来自Wyatt Technology的Astra 5 软件记录和分析信号。在样品注射进分离系统之前，将其溶解并用异-淀粉 酶脱支。因此，使用3U异淀粉酶(E-ISAMY；EC 3.2.1.68，来自假单胞 菌属种(Pseudomonas sp)；Megazyme Wicklow，爱尔兰)于45℃对10 mg淀粉孵育过夜(15小时)。对支链淀粉消化之后，直链淀粉级分具有 最大的分子，并且首先经过分离系统通过DMSO中的50mM LiBr的0.5 ml/分钟的恒定流被洗脱。

针对脱支正常马铃薯淀粉，直链淀粉和支链淀粉洗脱时间的转换是从 DP(聚合程度＝直链淀粉/支链淀粉的链内葡萄糖单体的数量)200(43 分钟)的下凹(dip)设置的一见图12。第一个峰洗脱的样品被认为是直 链淀粉，第二个峰洗脱的材料则是支链淀粉。支链淀粉级分在DP30(47 分钟)在长链支链淀粉(B链)和短链支链淀粉分开(来自正常马铃薯淀 粉的下凹)。对每个样品制备了至少两次分别制备的消化，并用HPSEC 对消化加以分析。

实施例10

蛋白含量

使用Kjeltec 2300(Foss，Hilleroed；Denmark)测定氮含量。用于氮分析 的Kjeldahl方法(ISO 5983-2：2005)由三个不同步骤组成。它们是消化、 蒸馏和滴定。

消化是分解蛋白和其它氮形式的结构及转化为氨所必需的。

将1克样品放在具有15ml浓硫酸(H₂SO₄)的管中，加入两片Kjeltabs (3,5g K₂SO₄+0,4g CuSO₄x 5H₂O)。消化在420℃进行30-45分钟。 进行蒸馏步骤用于从消化物中分离氨-氮。这是通过用45％NaOH将pH 升高至pH 7来完成的。在使用的系统中，通过吸收进4％硼酸，在5分钟 内完成对氨的收集。氨以硼酸铵的形式与硼酸结合。在存在混合指示剂时， 用0.1N HCl进行氨滴定。混合指示剂(溴甲酚绿和甲基红)在4％硼酸溶 液中可获得。

关于氮百分比：

已显示，蛋白含16％的氮。氮至蛋白的转化因子为6.25。因此，蛋白 百分比被如下计算：

％蛋白＝6.25x％

实施例11

磷含量

按照Gericke S和Kurmies BO，1952，Zeitschrift für Düngung，Bodenkunde 59，32-35(1952)的方法，进行分 光光度测定。

将5g干淀粉于650℃灰化，然后溶解于5ml HNO₃中。在100℃蒸 发溶液。将干粉润湿于数滴HNO₃和5ml水中。将溶液稀释至100ml，之 后取5ml转移到新的100ml瓶中。加入30ml VM试剂，所述VM试剂 含有下述物质的1∶1∶1混合物：0.25％钒酸铵溶液(2％浓硝酸中)、5％钼 酸铵溶液和1∶2稀释的浓硝酸溶液。加水至达到100ml，在分光光度计中 进行分析前，放置溶液1小时。

在436nm处，以分光光度方式测量颜色，通过标准曲线来计算磷含 量。

实施例12

马铃薯株系PAADGN支链淀粉型淀粉的特征

从按照实施例5所述在不同年份期间于6个不同位置培育的马铃薯提 取来自转基因马铃薯株系PAADGN的支链淀粉型淀粉，所述株系 PAADGN生产至少98％支链淀粉的支链淀粉型淀粉。按照实施例7至11 所述，测定淀粉的不同参数。来自生产至少98％支链淀粉的支链淀粉型淀 粉的转基因马铃薯株系PAADGN的支链淀粉型淀粉可从BASF Plant  Science Company GmbH，Carl-Bosch-Str.38，D-67056 Ludwigshafen，德 国获得。

结果概括于表6中。为进行比较，从三种不同的未经遗传修饰的栽培 种Bonanza、Kuras和Prevalent以及一种转基因马铃薯株系EH92-527-1 (生产至少98％支链淀粉的支链淀粉型淀粉)提取淀粉。此外，还分析了 天然的、未经化学修饰的马铃薯淀粉，其可从LYCKEBY INDUSTRIAL  AB，60-20，SE-291 91 Kristianstad，瑞典，物品号(article  number)15000商业获得。

在表6中，展示了至少9个单独测量的平均值和这些值与均值的绝对 偏差。对于不同淀粉应用来说重要的三种淀粉特征被示出——老化稳定性、 胶凝温度和峰黏度。这些特征取决于直链淀粉、长B-链、磷和蛋白的含量， 这些还显示于表7、8和9中。

表6：未经遗传转化的栽培种Bonanza、Kuras和Prevalent，转基因 株系PAADGN和EH92-527-1以及来自Lyckeby的天然马铃薯淀粉的老化 G’(3-0w)、直链淀粉含量和长B-链百分比。

表6中的结果显示，未经转化的株系和转基因株系之间直链淀粉含量 的减少是随着在5℃贮藏3周之后淀粉溶液的老化稳定性更高而实现的。 在PAADGN和EH92-527-1之间，直链淀粉含量和长B-链百分比上没有 区别。这两个参数通常确定贮藏稳定性(Hizukuri S，Carbohydrate  Research 141，1985，295-306)。虽然直链淀粉含量和长B-链百分比上没 有区别，但在贮藏稳定性方面有明显区别。

来自Lyckeby/瑞典的天然马铃薯淀粉具有平均153Pa的老化值 G’(3-0w)。

根据表6，根据实施例5和6品种Bonanza、Kuras和Prevalent生产 的淀粉的老化G’(3-0w)平均为109,7Pa。

根据表6，较之淀粉品种Bonanza、Kuras和Prevalent的老化G’(3-0w) 平均程度而言，转基因株系PAADGN的老化G’(3-0w)平均程度仅为1.5％。

根据表6，较之来自Lyckeby/瑞典的天然马铃薯淀粉的老化G’(3-0w) 平均程度而言，转基因株系PAADGN的老化G’(3-0w)平均程度仅为 1,05％。

比较而言，较之淀粉品种Bonanza、Kuras和Prevalent的老化G’(3-0w) 平均程度而言，转基因株系EH 92-527-1的老化G’(3-0w)平均程度为仅 17％。

表7：未经遗传转化的栽培种Bonanza、Kuras和Prevalent，转基因 株系PAADGN和EH92-527-1以及来自Lyckeby的天然马铃薯淀粉的磷含 量和蛋白含量。

为评估何种参数可影响这种增强的贮藏稳定性，对两种额外参数—— 磷含量和蛋白含量进行了评估，并显示于表7中。表7显示，未经转化的 栽培种与转基因株系之间，以及尤其是转基因株系PAADGN和 EH92-527-1之间，贮藏稳定性的增加与蛋白含量和磷含量的减少相关。

表8：未经遗传转化的栽培种Bonanza、Kuras和Prevalent，转基因 株系PAADGN和EH92-527-1以及来自Lyckeby的天然马铃薯淀粉的胶凝 温度和峰黏度。

表8

在WO 01/12782中，对于对颗粒结合淀粉合酶的下调而言，直链淀粉 含量的增加是随着峰黏度的减少实现的。因此，峰黏度被评估概括于表8 中。表8清楚显示，较之非转基因野生型株系Kuras而言，在转基因株系 PAADGN中峰黏度增加。此外，在转基因株系PAADGN中，胶凝温度有 利地被减少至几乎到未经转化株系Bonanza、Prevalent和Kuras的水平， 而转基因株系EH92-527-1却并非如此。

马铃薯株系PAADGN生产具有增强的老化稳定性的支链淀粉型淀粉。

此外，如果较之目前生产的天然马铃薯淀粉或支链淀粉型马铃薯淀粉， 来自马铃薯株系PAADGN的支链淀粉型淀粉额外具有下述有益性质中的 至少一种：

-直链淀粉含量＜1％

-胶凝温度低于株系EH92-527-1生产的支链淀粉型淀粉的胶凝温度

-较之来自非转基因马铃薯栽培种的天然马铃薯淀粉而言，增强的峰 黏度

-降低的蛋白含量

-增加的磷含量

-较之来自非转基因马铃薯栽培种的天然马铃薯淀粉而言，增加的长 B-链

实施例13

对脂类含量的分析

马铃薯株系PAADGN产生了较之其它马铃薯株系生产的支链淀粉型 淀粉或天然淀粉而言具有降低的脂类含量的支链淀粉型淀粉。

实施例14

马铃薯育种

为将包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：16或SEQ ID  NO：15的马铃薯株系中的转基因插入物渐渗进其它马铃薯品种，将株系自 体授粉或与其它马铃薯品种杂交，优选与淀粉马铃薯品种(例如但不限于 Tomensa、Albatros、Olga、Bonanza、Kormoran、Logo或Amado)杂 交。

鉴于马铃薯通常是营养繁殖的，可通过持续人工移除匍匐茎或可选地 将马铃薯嫁接到西红柿根茎上，来刺激真种子生产(与营养性的块茎(有 时也被称为种子)相对而言的真种子)(见 http://www.sharebooks.ca/eBooks/SpudsManual.pdf)。

为进行杂交授粉，雌性亲本被去势。为进行去势，移除花药，使得花 无法自体授粉。在开花前的那天，当花药仍为不育时，完成去势。用镊子 移除五枚花药中的每一个。第二天，雄性不育花大大开放。选择具有黄色 花药的大大开放的花作为雄性亲本花。通过将花粉放到每朵去势花的现可 被授粉的柱头上，进行杂交授粉。用细镊子取一枚花药，并将其放到去势 花的柱头上。继续培育马铃薯直到马铃薯果实成熟。通过破碎果实，然后 在密封罐中将它们在水中剧烈震荡，来收获种子。将真种子放进土壤中， 以培育新的马铃薯。针对其农艺学性能以及具有高老化稳定性的支链淀粉 型淀粉的生产，来分析马铃薯。选择表现良好的马铃薯植物，用其进行后 续育种循环。

实施例15

基因靶向

可通过同源重组来实现转基因在想要的基因座的插入。为实现此目的， 将与想要的插入位点同源的序列放置于转化构建体上转基因盒SEQ ID  NO：17周围(Hanin等人，2001，Plant J.28(6)：671-7)。优选地，同源序列 与基因组中想要的插入位点处的序列至少90％相同，更优选95％相同，进 一步更优选地，与基因组中想要的插入位点处的序列相同，并且至少100bp 长，更优选至少500bp长，最优选至少1000bp长。最优选的是SEQ ID NO： 6和SEQ ID NO：7。

或者，转基因盒SEQ ID NO：15原样，或SEQ ID NO：16组合启动子 和终止子的周围放置SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7。

转化后，针对转基因株系加以筛选，选出在想要的基因座具有插入的 那些株系。通过例如PCR或Southern杂交来鉴定靶向插入。例如，可使 用引物组合SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19和/或引物组合SEQ ID NO： 20和SEQ ID NO：21，来鉴定基因构建体SEQ ID NO：17至经转化的马铃 薯品种优选插入位点(特征在于是SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的同源 体)的靶向插入。

实施例16

冻融稳定性

在随后的冻融循环中，支链淀粉型淀粉溶液的老化逐渐增加。老化作 为支链淀粉型淀粉溶液的混浊被测量，其减少了光的透射率 (transmission)。

光的透射率被老化的支链淀粉型淀粉的光散射和光吸收所减少。

使用以1.6mM/l每种的浓度含有CaCl₂x 6H₂O和MgCl₂x 6H₂O的双 蒸馏水，在Paar高压釜(Moline，Illinois，美国)中于120℃、1小时制备 1％支链淀粉(重量/体积)的淀粉溶液。之后直接将温度再增加至135℃， 并保持20分钟。在冷却至室温后，通过在显微镜下检查不可溶淀粉颗粒来 证明完全溶解性。如果看不到淀粉颗粒，则用Ultra Turrax IKA T25(Werke GmbH & Co.KG，Staufen，德国)在室温下以24.000rpm对淀粉溶 液额外施加剪切力(sheered)2分钟。

使用UV VIS Spektralphotometer Specord 210(Analytik Jena AG， Jena，德国)，在650nm处，在2ml小管中，测量支链淀粉型淀粉溶液的 透射率。在-20℃贮藏24小时后重复该测量。在测量前以及随后的FTC(冻 融循环)后，将小管于25℃解冻1小时并混合五次。

在表9中，透射率被计算为较之以1.6mM/l每种的浓度含有CaCl₂x 6H₂O和MgCl₂x 6H₂O的水而言的％(对照-100％透射)。FTC是随后以 增加的顺序进行的冻融循环。以1.6mM/l每种的浓度含有CaCl₂x 6H₂O 和MgCl₂x 6H₂O的双蒸馏水中的支链淀粉型淀粉溶液显示在第一次冷冻 之前透射率较之对照减少6-7％。

四次FTC中的每次之后，较之EH92-527-1支链淀粉型淀粉而言， PAADGN支链淀粉型淀粉的透射率更高。因此，PAADGN支链淀粉型淀 粉较之EH92-527-1支链淀粉型淀粉在多至四次FTC后显示出更高的老化 稳定性。

表9：