一种检测或辅助检测髓系白血病细胞分化阶段的试剂盒

摘要

本发明公开了一种检测或辅助检测髓系白血病细胞分化阶段的试剂盒。本发明提供了一种检测或辅助检测髓系白血病细胞分化阶段的试剂盒，包括用于检测VSTM1蛋白表达的装置和用于检测VSTM1蛋白表达试剂；所述VSTM1蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列1。本发明的实验证明，本发明发现了VSTM1蛋白的表达与髓系细胞的分化有关，因此得到了一种检测急性髓系白血病髓系细胞分化阶段的试剂盒，利用该试剂盒检测VSTM1蛋白表达的表达量，从而判断出急性髓系白血病髓系细胞的不同分化阶段，更详细和及早的反应急性髓系白血病的分化过程，将在白血病的诊治中发挥重要作用。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测或辅助检测髓系白血病细胞分化阶段的试剂盒。

背景技术

白血病是以造血细胞分化阻滞为特征的一类恶性疾病，目前根据累及的细胞类别不同分为淋巴细胞白血病、髓系白血病、红白血病及巨核细胞白血病等。其中以急性髓系白血病（AML）因髓系细胞分化阻滞阶段不同而呈现很大的异质性。传统的对AML的FAB分型已经不足以反映AML的特征，临床应用有限。

因此，目前广泛运用的WHO的分型将AML的免疫标志物表达（免疫分型）、细胞遗传学改变及分子生物学（融合基因、突变）等纳入分类因素，更详细的反映了AML的真实特征及其与预后的关系，对临床治疗的指导意义更大。

虽然目前可用多种免疫标志物、分子标志物或遗传学改变将不同临床特点的AML亚型分别开来，但是仍有大部分AML尚无明确的分子标志物将其分别开来而被归为未分型组，仅能参照FAB的分型粗略地将其划分到大致的分化阶段。寻找新的、更精确反映白血病分化阶段的免疫标志物或分子标志物，研究其与临床的关系将是深入认识不同亚型AML从而实现精密的个体化治疗的前提。

VSTM1（V-set and transmembrane domain containing 1）是由北京大学人类疾病基因研究中心新发现的一种潜在的细胞因子编码基因。人类VSTM1基因定位于染色体19q13.42，存在五种剪切体，其中VSTM1-v1和VSTM1-v2是两种主要形式。VSTM1-v1为Ⅰ型膜蛋白，在NK、T、B、单核和粒细胞中广泛表达，在大多数肿瘤来源的细胞系中表达缺失；VSTM1-v2为经典分泌的糖蛋白，能促进外周血CD4+T细胞分泌IL-17A。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测或辅助检测髓系白血病细胞分化阶段的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括流式细胞仪和用于检测VSTM1蛋白的抗体组；所述VSTM1蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列1；所述用于检测VSTM1蛋白的抗体组包括抗VSTM1抗体。

上述试剂盒中，所述用于检测VSTM1蛋白的抗体组还包括抗CD45抗体、抗CD33抗体和抗CD34抗体。

上述试剂盒中，所述用于检测VSTM1蛋白的抗体组由抗VSTM1抗体、抗CD45抗体、抗CD33抗体和抗CD34抗体。

上述试剂盒中，所述抗VSTM1抗体、抗CD45抗体、抗CD33抗体和抗CD34抗体均用不同荧光素标记；所述抗VSTM1抗体具体为VSTM1-FITC，所述抗CD45抗体具体为CD45-PerCP、所述抗CD33抗体具体为CD33-APC，所述抗CD34抗体具体为CD34-PE。

上述试剂盒中，所述试剂盒还包括记载在载体上的5种判断标准：

1）若表达VSTM1的阳性细胞占幼稚细胞百分比为12.40%和/或VSTM1蛋白平均荧光强度为12.90，则所述髓系白血病细胞的分化阶段为或候选为M0或M1；

2）若表达VSTM1阳性细胞占幼稚细胞百分比为12.71%和/或VSTM1平均荧光强度为33.13，则所述髓系白血病细胞的分化阶段为或候选为M2；

3）若表达VSTM1阳性细胞占幼稚细胞百分比为95.26%和/或VSTM1平均荧光强度为106.28，则所述髓系白血病细胞的分化阶段为或候选为M3；

4）若表达VSTM1阳性细胞占幼稚细胞百分比为18.59%和/或VSTM1平均荧光强度为33.68，则所述髓系白血病细胞的分化阶段为或候选为M4；

5）若表达VSTM1阳性细胞占幼稚细胞百分比为47.35%和/或VSTM1平均荧光强度为120.23，则所述髓系白血病细胞的分化阶段为或候选为M5。

上述试剂盒中，所述髓系白血病细胞为急性髓系白血病细胞。

上述的试剂盒在制备检测或辅助检测髓系白血病细胞分化阶段的产品中的应用。

上述应用中，所述试剂盒由所述流式细胞仪、所述用于检测VSTM1蛋白的抗体组和所述记载在载体上的5种判断标准组成；

所述髓系白血病细胞为急性髓系白血病细胞。

上述急性髓系白血病细胞分化阶段为如下5种分化阶段的任意一种：1）M0或M1；2）M2；3）M3；4）M4；5）M5。

上述应用为将待测髓系白血病细胞用上述试剂盒进行检测，

1）若表达VSTM1的阳性细胞占幼稚细胞百分比为12.40%和/或VSTM1蛋白平均荧光强度为12.90，则所述髓系白血病细胞的分化阶段为或候选为M0或M1；

2）若表达VSTM1阳性细胞占幼稚细胞百分比为12.71%和/或VSTM1平均荧光强度为33.13，则所述髓系白血病细胞的分化阶段为或候选为M2；

3）若表达VSTM1阳性细胞占幼稚细胞百分比为95.26%和/或VSTM1平均荧光强度为106.28，则所述髓系白血病细胞的分化阶段为或候选为M3；

4）若表达VSTM1阳性细胞占幼稚细胞百分比为18.59%和/或VSTM1平均荧光强度为33.68，则所述髓系白血病细胞的分化阶段为或候选为M4；

5）若表达VSTM1阳性细胞占幼稚细胞百分比为47.35%和/或VSTM1平均荧光强度为120.23，则所述髓系白血病细胞的分化阶段为或候选为M5。

上述VSTM1蛋白在开发、设计和/或制备检测或辅助检测髓系白血病细胞分化阶段的产品中的应用也是本发明保护的范围；所述髓系白血病细胞具体为急性髓系白血病细胞；所述急性髓系白血病细胞分化阶段具体为如下5种分化阶段中的任一一种：1）M0或M1；2）M2；3）M3；4）M4；5）M5。

本发明的实验证明，本发明发现了VSTM1蛋白的表达与髓系细胞的分化有关，因此得到了一种检测急性髓系白血病髓系细胞分化阶段的试剂盒，利用该试剂盒检测VSTM1蛋白的表达，从而判断出急性髓系白血病髓系细胞的不同分化阶段，更详细和及早的反应AML的分化过程，对临床治疗的指导意义更大。

附图说明

图1为VSTM1在正常供者骨髓各细胞亚群中的表达示例图

图2为VSTM1在正常供者不同分化阶段的髓系细胞中的表达示例图

图3为VSTM1在正常供者不同分化阶段的髓系细胞中的表达示例图

图4为VSTM1在正常供者不同分化阶段的髓系细胞中的表达水平

图5为VSTM1在白血病骨髓细胞中的表达示例图

图6为VSTM1在不同亚型AML中的表达示例图

图7为AML急性髓系白血病骨髓细胞中VSTM1的表达

图8为VSTM1在M5中的表达与CD34表达水平有关

图9为ATRA诱导分化后NB4细胞VSTM1的表达和CD11b的表达

图10为K562细胞ATRA诱导后VSTM1的表达

图11为APL细胞经ATRA处理后VSTM1的mRNA和蛋白的表达

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，部分具体列如下：

1、小牛血清、RPMI1640：购自GIBCO公司。

2、TRIzol试剂：购自Invitrogen公司

3、随机引物、M-MLV逆转录酶：购自Promega公司。

4、急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4：（NB4细胞购自北京欣兴唐生物科技有限公司，产品目录号为CL007；）。

6、6孔、24孔及96孔培养板：购自Corning公司。

7、荧光素标记的单克隆抗体CD45-PerCP(产品目录号:347464)、CD33-APC(产品目录号:340474)、CD13-APC(产品目录号:557454)、CD34-PE(产品目录号:348057)CD34-PE-Cy7(产品目录号:348057)、CD117-PE(产品目录号:340529)、CD16-APC-Cy7(产品目录号:557758)、CD14-APC-Cy7(产品目录号:333951)及CD11b-PE(产品目录号:333142)，均购自美国Becton Dickinson公司。

8、多克隆抗体VSTM1-FITC：将抗原多肽免疫兔，收集兔血清，纯化并且荧光标记得到多克隆抗体VSTM1-FITC，抗原多肽为VSTM1蛋白，其氨基酸序列为序列表中的序列1：

9、全反式维甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA），三氧化二砷（As₂O₃）：购自Sigma-Aldrich公司。

下述实施例中所用的主要仪器设备如下：

1、超净工作台：北京半导体设备厂；

2、CO₂培养箱：美国NAPCO牌；

3、低温高速离心机：GS-15R型，美国Beckman公司；

4、流式细胞仪：FACSort型，美国Becton Dickinson公司；

5、倒置光学显微镜：日本Olympus公司；

6、PCR扩增仪：美国Perkin Elmer Cetus公司，GeneAmp PCR System 9700；

7、定量PCR仪：美国Perkin Elmer Cetus公司，ABI7500；

8、低速离心机：BFX5-320型（白洋离心机厂）；

9、紫外分光光度计：美国Nano Drop ND-1000。

下述实施例中采用的细胞培养如下：NB4及急性早幼粒细胞白血病（acutepromyelocytic leukemia，APL）病人骨髓细胞用10%FBS/RPMI1640(4.5g/L glucose，4mM L-glutamine，100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素)培养，细胞复苏及传代按照常规进行。

下述实施例中的VSTM1蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列1。

下述实施例中病人标本采集：正常供者及白血病病人的骨髓细胞采自在北京人民医院就诊的病人，患者知情，且本研究获得北京大学人民医院医学伦理委员会批准，遵循赫尔辛基宣言；标本用肝素抗凝；而且所有细胞的FAB分型已经确定。

下述实施例中的VSTM1蛋白的表达采用流式细胞检测，运用带不同荧光素的抗白细胞表面抗原的抗体标记骨髓细胞，具体步骤如下：

（1）骨髓细胞计数：取10ul样本，加适量冰醋酸裂解红细胞并稀释血细胞，显微镜下计数；

（2）按照抗体说明书加适量抗体至200μl血样，室温（25℃）避光孵育15min；

（3）加红细胞裂解液（NH4CL 1.8675g,Tris 0.65g蒸馏水250ml），室温裂解8min；

（4）离心1200rpm×10min，弃上清液；

（5）加磷酸缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）（购自上海耕欣生物科技有限公司）洗两遍；

（6）离心1200rpm×10min，弃上清液，加200μl上流式细胞仪检测。

（7）数据分析，运用FCS Express V3软件分析流式细胞术检测数据，统计分析在SPSS软件17.0中进行。

下述实施例中的经不同浓度ATRA诱导分化后不同时间点的NB4细胞VSTM1表达水平与CD11b表达水平的相关性采用Pearson相关系数分析。P值小于0.05定义为有统计学差异。

实施例1、不同髓系细胞中的VSTM1表达分析

一、检测正常骨髓细胞分化阶段中的VSTM1表达

1、VSTM1在正常骨髓各细胞亚群中的表达

为明确VSTM1蛋白在骨髓各亚群细胞中的表达水平，运用不同荧光素标记的抗白细胞表面抗原的抗体及抗VSTM1抗体标记骨髓细胞，运用流式细胞仪检测了VSTM1在29例正常供者骨髓细胞亚群中的表达。

运用CD45与侧向散色光（SSC）将细胞分为淋巴细胞（CD45++且SSC小），幼稚细胞（CD45+且SSC小），成熟粒细胞（CD45+且SSC大）及单核细胞（CD45++且SSC小）。

采用上述的流式细胞检测29例正常供者骨髓细胞亚群中VSTM1的表达，抗体为VSTM1-FITC,CD45-PerCP。实验重复三次，结果取平均值。

在正常供者骨髓中，VSTM1阳性细胞占淋巴细胞的百分比为15.54%，平均荧光强度为23.33；占成熟粒细胞的百分比为94.01%，平均荧光强度为167.61；占幼稚细胞的百分比为37.14%，平均荧光强度为46.70。图1是其中一例的示意图。

VSTM1在成熟粒细胞中的表达很高，而在幼稚细胞中表达很低，说明VSTM1在不同分化阶段的髓系细胞中的表达明显不同，VSTM1可能与髓系细胞的分化有关。各群间VSTM1的阳性百分比及平均荧光强度均具有统计学意义（P值均为0.000）。

2、VSTM1在正常髓系细胞不同分化阶段的表达

为明确VSTM1在正常髓系细胞不同分化阶段的表达水平，进一步运用六种荧光素组合的单克隆抗体标记骨髓细胞，运用流式细胞仪分别检测不同阶段正常髓系细胞VSTM1的表达水平。每例供者做两管，共检测了11例正常供者骨髓样本。运用CD45和侧向散色光（SSC）将细胞初步分为淋巴细胞（R2）、幼稚细胞（R3），成熟粒细胞（R5）及单核细胞（R4）。再按照CD34、CD117、CD33、CD13、CD16、CD14的表达水平将R3髓系细胞各依其成熟度分为：原始细胞（CD34+），早幼粒细胞（CD34-CD117+CD16-），中幼粒细胞（CD34-CD117-CD16-CD13+），晚幼粒细胞（CD16+）；将R5中的单核细胞分为未成熟髓系细胞（CD14-)和成熟单核细胞(CD14+)（图2-3）。

采用上述的流式细胞检测，抗体组合分别如下:

管1：VSTM1-FITC/CD117-PE/CD45-PerCP/CD13-APC/CD34-PE-Cy7/CD16-APC-Cy7；

管2：VSTM1-FITC/CD117-PE/CD45-PerCP/CD33-APC/CD34-PE-Cy7/CD14-APC-Cy7。

结果如表1和图4所示，表明VSTM1在原始细胞，早幼粒细胞，中幼粒细胞和晚幼粒细胞中表达的阳性百分比逐渐升高（表1，图4，P＝0.000）。而且，在整个粒细胞群中，VSTM1的表达强度随CD16表达强度的升高而增强（图4，相邻分化阶段细胞之间VSTM1表达强度比较，P值均为0.005）。在R4中，CD14+成熟单核细胞的VSTM1阳性百分比明显高于CD14-细胞(68.66 vs 34.35，P＝0.004)。

表1为VSTM1在正常供者不同分化阶段的髓系细胞中的表达

从上述正常人的研究结果发现，VSTM1在不同分化阶段的髓系细胞中的表达明显不同，VSTM1可能与髓系细胞的分化有关。

二、VSTM1在白血病骨髓细胞中的表达

为明确VSTM1在白血病中的表达水平，检测了52例AML急性髓系白血病(4例M0/M1，22例M2，4例M3，14例M4，8例M5)、10例ALL淋巴细胞白血病及5例CML（慢性粒细胞白血病）骨髓白血病细胞的VSTM1表达水平。

采用上述的流式细胞检测白血病细胞的VSTM1表达水平，抗体为VSTM1-FITC,CD45-PerCP,CD33-APC,CD34-PE。

结果VSTM1在急性白血病幼稚细胞中的表达也很低，在ALL幼稚细胞中VSTM1的阳性百分比为16.04%，平均荧光强度为23.90，在AML中VSTM1在幼稚细胞中的阳性百分比为均值为19.60%，平均荧光强度为45.66；VSTM1在CML粒细胞中VSTM1的阳性百分比为85.45%，平均荧光强度为104.48。VSTM1在ALL幼稚细胞中的表达与AML幼稚细胞的阳性百分比无明显差异（P＝0.745）。VSTM1在CML粒细胞中的阳性百分比及平均荧光强度比在除M3、M5之外的AML（M1、M2及M4）幼稚细胞的表达均高（P值均为0.000）。

VSTM1在AML幼稚细胞的表达很低，而在CML细胞中VSTM1表达较高。提示VSTM1低表达在AML的病理机制中发挥一定作用，VSTM1在正常人成熟粒细胞和相对成熟的CML细胞中均相对较高表达(图5)，说明VSTM1可能与髓系细胞的分化有关。VSTM1在ALL幼稚细胞和正常人骨髓中的淋巴细胞中均低表达，二者之间无明显差异（VSTM1阳性百分比：16.04vs 15.54（%），P＝0.926,；VSTM1平均荧光强度：23.90vs 23.33，P＝0.932）。提示VSTM1可能主要在髓系细胞中发挥作用。

实施例2、检测髓系细胞分化阶段的试剂盒及其应用

一、VSTM1在AML不同分化阶段的骨髓细胞中的表达及试剂盒的构建

AML通常根据FAB(French-American-British)分型进行分类，FAB分类是基于不同类别骨髓细胞及其分化程度而进行的分类。52例AML急性髓系白血病(4例M0/M1，22例M2，4例M3，14例M4，8例M5，每例病人的FAB分型已经确定)，为进一步了解VSTM1表达与AML不同分化阶段的骨髓细胞的关系，分析了不同FAB亚型的AML骨髓细胞VSTM1的表达。以正常人骨髓细胞为对照。

检测方法采用上述的流式细胞检测AML急性髓系白血病骨髓细胞中VSTM1的表达，抗体为VSTM1-FITC,CD45-PerCP,CD33-APC,CD34-PE。

每个亚型中取1例检测结果如图6所示，为VSTM1在不同亚型AML中的表达示例图，运用CD45和侧向散色光（SSC）分出AML骨髓细胞中的R3（红色）：幼稚细胞；

按照上述方法检测每个亚型多例病人的VSTM1的表达，VSTM1的表达通过表达VSTM1阳性细胞占幼稚细胞百分比和VSTM1平均荧光强度体现；实验重复三次，结果取平均值。

结果如图7所示，A为表达VSTM1阳性细胞占幼稚细胞百分比；B为VSTM1平均荧光强度；

M0/M1亚型中VSTM1阳性细胞占幼稚细胞百分比为12.40%，VSTM1平均荧光强度为12.90；

M2亚型中VSTM1阳性细胞占幼稚细胞百分比为12.71%，VSTM1平均荧光强度为33.13；

M3亚型中VSTM1阳性细胞占幼稚细胞百分比为95.26%，VSTM1平均荧光强度为106.28；

M4亚型中VSTM1阳性细胞占幼稚细胞百分比为18.59%，VSTM1平均荧光强度为33.68；

M5亚型中VSTM1阳性细胞占幼稚细胞百分比为47.35%，VSTM1平均荧光强度为120.23。

正常人骨髓细胞中，VSTM1阳性细胞占幼稚细胞百分比为37.14%，VSTM1平均荧光强度为46.70。

因此，用于检测VSTM1表达的抗体组VSTM1-FITC、CD45-PerCP、CD33-APC和CD34-PE、流式细胞仪及记载在载体上的5种判断标准构成了用于检测髓系细胞分化阶段的试剂盒，上述记载在载体上的5种判断标准如下：

1）若表达VSTM1的阳性细胞占幼稚细胞百分比为12.40%和/或VSTM1蛋白平均荧光强度为12.90，则所述髓系白血病细胞的分化阶段为或候选为M0或M1；

2）若表达VSTM1阳性细胞占幼稚细胞百分比为12.71%和/或VSTM1平均荧光强度为33.13，则所述髓系白血病细胞的分化阶段为或候选为M2；

3）若表达VSTM1阳性细胞占幼稚细胞百分比为95.26%和/或VSTM1平均荧光强度为106.28，则所述髓系白血病细胞的分化阶段为或候选为M3；

4）若表达VSTM1阳性细胞占幼稚细胞百分比为18.59%和/或VSTM1平均荧光强度为33.68，则所述髓系白血病细胞的分化阶段为或候选为M4；

5）若表达VSTM1阳性细胞占幼稚细胞百分比为47.35%和/或VSTM1平均荧光强度为120.23，则所述髓系白血病细胞的分化阶段为或候选为M5。

因此，可以利用上述的试剂盒来辅助检测AML急性髓系白血病骨髓细胞处于M0/M1、M2、M3、M4和M5这几种分化阶段的哪一种。

二、检测髓系细胞分化阶段的试剂盒在检测AML骨髓细胞不同分化阶段的应用

将待测编号为1-5的已确定FAB分型的AML骨髓细胞样本按照前面的流式细胞检测方法用上述一得到的试剂盒进行检测；结果待测编号为1-5的检测结果与已确定的FAB分型一致，说明本发明的方法正确。

实施例3、VSTM1在AML骨髓细胞中的表达与CD34及CD33的关系和M3亚型骨髓细胞诱导分化

一、VSTM1在AML骨髓细胞中的表达与CD34及CD33的关系

Gene Atlas数据库提示VSTM1在骨髓CD33+髓系细胞中选择性高表达，而在其它组织、细胞中的表达丰度非常低。而且，VSTM1与CD33一样具有胞浆内尾部ITIM基序。因此分析了VSTM1在髓系细胞的表达，及其与CD33表达的关系。

运用流式细胞分析软件对不同细胞亚群进行设门分析，检测方法采用上述的流式细胞检测，抗体为VSTM1-FITC,CD45-PerCP,CD33-APC,CD34-PE。

结果如图8和表2所示，A：CD34+及CD34-M5中VSTM1的表达水平示例图R2(绿色)：淋巴细胞；R3（红色）：幼稚细胞；R5(蓝色)：粒细胞；R6（粉色）：有核红细胞；B：VSTM1在CD34+或部分阳性的M5中阳性百分比及平均荧光强度均明显低于CD34-M5；可以看出，VSTM1在所有（n=19）CD33+的AML中分化较成熟粒细胞（流式设门为R5）中均表达（阳性百分比在90%以上），而在CD33+的白血病细胞（M0-M3幼稚髓细胞流式设门为R3，M4-M5幼稚单核细胞设门为R4）中的表达则呈现较大的异质性，VSTM1阳性百分比范围在<10%到100%不等(n=22)，VSTM1虽在正常骨髓CD33阳性细胞中选择性高表达，而在白血病中的表达呈现较大异质性，提示CD33不是与VSTM1表达水平相关的唯一因素。由于CD34是原始细胞的标志，还同时分析了VSTM1表达与CD34表达的关系，结果发现21例AML中，有20例VSTM1在CD34+细胞中的表达均低于30%，仅有一例AML为50%。

研究中还发现VSTM1在急性单核细胞白血病（M5）中的表达与幼稚单核细胞CD34的表达有关，共8例M5型AML患者中，4例病人的幼稚单核细胞呈CD34+，另4例呈CD34-。在CD34+或部分阳性幼稚单核细胞的VSTM1

表2.VSTM1在AML中的表达与CD34及CD33表达的关系

n.d.:由于在该患者中该群细胞很少或几乎没有，故未分析其VSTM1的表达。

-:VSTM1阳性百分比<10%；部分+：VSTM1阳性百分比10-30%；+：VSTM1阳性百分比>90%的阳性百分比（29.44%vs91.41%，P＝0.001）及平均荧光强度（43.38vs196.38，P＝0.011）均显著低于CD34-的幼稚单核细胞（图8）。

二、M3亚型骨髓细胞诱导分化(体外诱导分化)

1、NB4细胞诱导分化(体外诱导分化)

为进一步明确VSTM1与髓系细胞分化的关系，将白血病细胞系经体外诱导分化，观察其VSTM1的表达变化。全反式维甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）可诱导急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4分化。因此运用ATRA诱导NB4细胞分化，运用流式细胞术检测其VSTM1的表达水平。

（1）NB4细胞（为M3亚型）培养，培养方法如前面所述；

（2）加红细胞裂解液裂解8min，生理盐水洗涤两遍后进行细胞计数，稀释细胞至1×10⁶/ml；

（3）按照4×10⁵细胞/孔铺24孔板；

（4）次日加不同终浓度的ATRA（全反式维甲酸）处理不同时间。

（5）以K562细胞（K562细胞购自中国科学院细胞库，产品目录号为TCHu191，来自慢性髓性白血病-急变期患者）为对照。

（6）检测方法采用上述的流式细胞检测，抗体为VSTM1-FITC,CD11b-PE。

结果如图9和图10所示，图9为ATRA诱导分化后NB4细胞VSTM1的表达随CD11b表达升高而升高(A、B、C，其中A上图为诱导分化24h，A下图为诱导分化48h，B上图为诱导分化72h，B下图为诱导分化120h，)和NB4细胞经诱导分化后VSTM1与CD11b的平均荧光强度呈正相关（D）；图10为K562细胞ATRA诱导后VSTM1的表达无明显升高；从图中看出，经ATRA诱导分化以后，随着细胞的分化程度升高（CD11b表达升高），NB4细胞的VSTM1阳性百分比明显升高（图9A-D）。由于在诱导分化72h时，2.0μmol/L和4.0μmol/L ATRA处理的细胞出现死亡，横向比较了在该时间点运用同样浓度(均为1.0μmol/L)的三氧化二砷（As₂O₃，图中以“As”表示），ATRA(图中以“RA”表示)及二者联合运用(图中以“As+RA”表示)时VSTM1的表达变化，结果显示，VSTM1在“RA”及“As+RA”组均出现表达上调，而在“As”组表达无明显升高（图9B）。在诱导5天后，运用0.5μmol/L和1.0μmol/L ATRA处理后的NB4细胞VSTM1的阳性百分比为较未用ATRA者分别高2倍和3倍，同时CD11b的阳性百分比分别由3%上升至76%和82%（图9C），VSTM1的平均荧光强度与CD11b的平均荧光强度呈正相关（n=17，Pearson相关系数r＝0.866，P＝0.000）（图9D）。相反，不能被ATRA诱导分化的K562细胞其VSTM1表达水平无明显变化（图10）。

2、APL（急性早幼粒细胞白血病）骨髓细胞诱导分化(体外诱导分化)

为进一步明确VSTM1与粒细胞分化的关系，运用ATRA诱导早幼粒细胞白血病病人的骨髓细胞，研究其VSTM1表达水平的差异。APL（急性早幼粒细胞白血病，为M3亚型）骨髓样本（case1和case2两个样本）经以下步骤诱导分化：

1)离心（1500rpm×10min），吸取白细胞层；

2)加红细胞裂解液裂解8min，生理盐水洗涤两遍后进行细胞计数，稀释细胞至1×10⁶/ml；

3)按照4×10⁵细胞/孔铺24孔板；

4)次日加终浓度2.0umol/l的ATRA（全反式维甲酸）处理7天。

以不加入ATRA（全反式维甲酸）处理为对照（control）。

分别进行如下检测：

A、VSTM1的mRNA水平检测

将ATRA处理后的细胞，用生理盐水洗涤2次，利用TRIzolTM试剂提取细胞总RNA，反转录得到cDNA作为模板，利用上游引物VSTM1-FP：5’-GCCGAGGCAGATTTATCCAA-3’；下游引物VSTM1-RP：5’-CCTGGGTGGTGTCTGAAGCT-3’；探针VSTM1-probe：

5’-FAM-CTCGACGGCAGACCCCCAAGG-BHQ-3，进行实时定量PCR扩增，以ABL为内参基因，内参的引物、探针为：上游引物ABL1-F：5’-TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3’；ABL1-R（序列表的序列5）：5’-GATGTAGTTGCTTGGGACCCA-3’；探针ABL1-T-probe（5’→3’）:FAM-CCATTTTTGGTTTGGGCTTCACACCATT–TAMRA。VATM1的表达水平以VSTM1/ABL表示。

结果如图11A所示，可以看出，对照的case1和case2的VSTM1的mRNA表达量分别为15.02和8.96；ATRA处理（RA）后的case1和case2的细胞中VSTM1的mRNA表达量分别为89.27和274.59。

B、VSTM1的蛋白水平检测

检测方法采用上述的流式细胞检测，抗体为VSTM1-FITC及CD11b-PE。

结果如图11B所示，CD11b表达升高而升高(B)；对照组细胞VSTM1和CD11b的平均荧光强度分别为119.97和58.09；ATRA处理（RA）后的细胞的VSTM1和CD11b的平均荧光强度分别为157.81和135.45；。

上述结果表明，经ATRA诱导分化后，APL细胞VSTM1mRNA及蛋白量的表达均升高。运用ATRA2.0μmol/L处理后第7天，ATRA处理的2例APL病人的骨髓细胞VSTM1mRNA水平较未用ATRA的APL细胞分别高6倍（89.27vs15.02）和30倍（274.59vs8.96）（图11A），ATRA处理后APL细胞VSTM1蛋白的表达水平随CD11b表达升高而升高（图11B）。

总之，用流式细胞术检测发现，VSTM1蛋白在正常供者骨髓中各细胞亚群的表达各不相同，在淋巴细胞中表达很低，而在成熟粒细胞中表达很高。在正常供者和ALL中淋巴细胞的VSTM1表达均很低，而在AML细胞中的表达明显低于正常成熟粒细胞和CML细胞，说明VSTM1与髓系白血病的发生发展相关，并提示VSTM1的表达与髓系细胞的分化程度相关。进一步研究结果表明，VSTM1的表达与髓系细胞的分化程度有关，VSTM1在正常人成熟粒系细胞中高表达，而在幼稚细胞中表达很低。在相对成熟的粒细胞白血病APL和CML中VSTM1的表达明显高于阻滞于更幼稚阶段的白血病M0-M2，在单核细胞白血病中也有类似现象。体外诱导分化后的APL细胞系NB4及APL病人的骨髓细胞VSTM1的表达升高。说明VSTM1是与骨髓中髓系细胞的分化密切相关，分化越成熟的髓系细胞（粒细胞及成熟单核细胞）VSTM1表达越高。这一特点提示VSTM1可作为正常髓系分化过程中一个有用的标志物，可能作为成熟髓系细胞免疫表型之一用于鉴别白细胞的分化程度及更精确的白血病的免疫分型。在白细胞发育、分化、活化过程中出现或消失的细胞膜表面标志称为CD抗原。VSTM1的这些特点有望成为白细胞表面的另一CD分子，需要进一步利用单克隆抗体进行识别和区分。单克隆抗体的制备还可对VSTM1的功能研究具有重要意义。

综上所述，VSTM1在髓系细胞中的表达与细胞的分化程度密切相关，VSTM1可能是髓系细胞增殖和分化的一个调控分子。