一种核酸提取磁球和四种脑炎病毒核酸检测试剂盒（荧光PCR法）的研制

摘要

目的:　　研制一种分散性好、磁响应能力强、化学性质稳定和机械强度高的高性能Fe3O4@SiO2磁性复合微球，不仅可用于不同病原微生物核酸的提取，还可以配合核酸提取仪快速、自动提取和纯化 DNA；2、为提高对近年来频繁爆发的虫媒传染病的预防与检测能力，分别研发脑膜炎症候群病毒中可造成中枢神经系统严重感染的东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒和森林脑炎病毒核酸检测试剂盒（荧光PCR法）。　　方法:　　首先，采用水热合成法，以 NaAc为静电稳定剂，乙二醇为还原剂，聚乙二醇为表面活性剂，FeCl3·6H2O为原料，在高温高压条件下反应合成四氧化三铁磁性纳米微球；其次，在超声波辅助的条件下，通过 St?ber合成法在磁性微球表面快速包覆一层均匀二氧化硅，并通过调节投入反应体系中的正硅酸乙酯（TEOS）的量来控制Fe3O4磁性微粒表面包覆的二氧化硅壳层的厚度，进而制备一系列具有不同二氧化硅壳层厚度的Fe3O4@SiO2磁性复合微球；然后通过透射电镜（TEM）、超导量子干涉磁强计（SQUID）对Fe3O4@SiO2磁性复合微球的基本性能进行表征，最终通过提取鲑鱼精DNA溶液、乙肝病毒血清稀释样本及质粒菌稀释样本，验证其对不同样本DNA的提取效果。2、四种脑炎病毒核酸检测试剂盒（荧光 PCR法）的技术路线主要分为三部分：（1）引物探针的设计与筛选。通过文献调研确定目标病原体的靶基因，从genebank数据库中下载相应病原体靶基因的基因序列并进行比对分析，设计实时荧光PCR的引物和TaqMan探针；收集标准病毒株样本，建立质粒参考品和体外转录RNA参考品，对无样本的脑炎病毒通过重叠延伸法人工合成靶基因后建立质粒参考品；制备灵敏度和特异性参考品，完成引物和探针的筛选。（2）实验条件的优化。重点优化PCR过程的退火温度和退火时间。（3）试剂盒综合性能评价。以阳性参考品和阴性参考品评价核酸检测试剂盒的特异性。以灵敏度参考品评价其核酸检测试剂盒的最低检出限。检测实际临床样本或模拟病毒样本评价核酸检测试剂盒的使用效果。　　结果:　　水热法制备出粒径为400~500nm的Fe3O4磁性微球，通过进一步合成反应，制备出三种不同二氧化硅壳层厚度的Fe3O4@SiO2磁性复合微球T50、T100、T150。透射电镜显示，二氧化硅平均厚度由薄至厚依次为20nm、40nm、65nm。超导量子干涉磁强计测得包硅后的饱和磁化强度可达62.5emu/g。乙肝病毒DNA提取实验表明中等厚度的Fe3O4@SiO2磁性复合微球（T100）提取DNA后扩增的Ct值最小，表明T100磁珠的提取效果最好。对不同浓度的鲑鱼精 DNA溶液提取实验表明，T100磁性复合微球的效率可达85%以上。磁珠用量与洗脱时间的实验表明，当磁性复合微球为1mg，洗脱时间10min时，可达到最佳提取效果。提取不同浓度乙肝病毒DNA时，与商业化磁珠试剂盒相比，T100磁性复合微球具有更好的提取效率。此外，T100磁性复合微球对质粒DNA也有良好的提取效果。2、首先，根据文献调研确定了东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒和森林脑炎病毒的靶基因。根据基因序列比对结果，分别设计了2-3对引物及3-5条探针。构建了质粒参考品。以病毒质粒参考品为模板制备了四种病毒的体外转录RNA作为灵敏度参考品。其次筛选出四种虫媒脑炎病毒的引物与探针。然后分别优化了每种脑炎病毒PCR反应参数以保证其靶基因能良好的扩增。最后，对核酸检测试剂盒的综合性能进行了评价。特异性评价结果表明核酸检测试剂盒可很好的区分同种属病毒。灵敏度评价结果表明四种脑炎病毒核酸检测试剂盒的最低检出限为102copies/μl。　　结论:　　成功制备了一种分散性好、磁响应能力强、化学性质稳定和机械强度高的高性能Fe3O4@SiO2磁性复合微球，不仅可用于不同病原微生物核酸的提取，还可以运用于核酸提取仪，快速、自动提取和纯化 DNA。2、成功研制出东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、森林脑炎病毒的实时荧光PCR法核酸检测试剂盒，为这四种脑炎病毒的预防和控制提供了新的检测方法。

目录

声明

中英文对照表

前言

实验1一种核酸提取磁球的制备

1 材料和仪器

2 方法

3 结果

实验2四种脑炎病毒核酸检测试剂盒（荧光PCR法）的研制

1 材料与仪器

2 方法

3 结果

讨论

结论

致谢

参考文献

附录一：文献综述:核酸提取方法及其研究进展

附录二：在校期间论文论著和科研情况