杂交瘤细胞株10G4及其产生的抗黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量单克隆抗体

摘要

本发明涉及杂交瘤细胞株10G4及其分泌产生的抗黄曲霉毒素总量单克隆抗体。本发明提供的杂交瘤细胞株10G4（CCTCCNO.C201016）可以用于制备抗黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量单克隆抗体，并用常规非竞争酶联免疫吸附分析（ELISA）法测得10G4的鼠腹水抗体的效价可达5.12×10

说明书

技术领域

本发明涉及杂交瘤细胞株10G4及其产生的抗黄曲霉毒素总量单克隆抗体。 

背景技术

黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉分泌产生的次生代谢产物，是能引起人畜各种损害的天然有毒化合物。黄曲霉毒素品种较多，目前被已发现20余种。黄曲霉毒素具有污染广、毒性强、危害重等特点。因此，全球至今至少有70个以上的国家制定了农产品及食品中黄曲霉毒素限量标准，很多国家更是制定了主要黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量的限量标准。因此黄曲霉毒素总量分析方法显得尤为重要。 

现有黄曲霉毒素的检测方法包括薄层层析法、精密仪器分析法和免疫学分析法。其中薄层层析法是检测黄曲霉毒素最常用的检测方法，其不需要特殊的仪器设备，一般实验室都可进行，但试剂用量大、操作繁琐、其它组分干扰严重、准确性差，不能准确定量，且对实验人员和周围环境污染危害较大，不适于现场快速检测。精密仪器分析法包括荧光分光光度法和高效液相色谱法，其灵敏度高，准确性好，但仪器昂贵，要求黄曲霉毒素样品纯化程度高，样品前处理过程繁琐，耗时长，对实验环境要求高，难以实现快速检测。近些年发展起来的免疫分析技术克服了前两者的缺点，具有特异性强、灵敏度高、样品前处理简单、成本低、对实验人员和周围环境的污染危害小、适于现场批量检测等优点。 

免疫分析是利用抗原和抗体的特异性反应和抗体（或抗原）上标记物的生物、物理或化学放大作用来对超微量残留物进行定性、定量检测，所以要研究建立针对黄曲霉毒素总量分析方法的任何一种免疫学检测技术，都必须先制得抗黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量的抗体。事实上无论国内还是国际上研制黄曲霉毒素抗体的报道很多，黄曲霉毒素通用抗体也有报道，甚至也有个别学者将黄曲霉通用抗体用来建立黄曲霉毒素总量分析方法。黄曲霉毒素通用抗体主要强调抗体对各种黄曲霉毒素均可发生较强的特异性结合反应，可被用来分别建立每种黄曲霉毒素的免疫分析方法；而黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量抗体则不仅强调抗体对各种黄曲霉毒素均可发生较强的特异性结合反应，而且还特别强调应用该抗体建立的针对每种黄曲霉毒素的免疫分析方法的灵敏度一致性要强。国内外现有报道的黄曲霉毒素通用抗体通用性都是比较强的，但针对每种黄曲霉毒素的分析灵敏度一致性却通常都较差，因此，这些报道的黄曲霉毒素通用抗体并不适合用来建立黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量分析方法，即使建立了黄曲霉毒素总量分析方法，其定量分析的准确性也会大打折扣。因此，研制黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量抗体对实现黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量免疫快速定量检测具有重要意义。 

发明内容

本发明所要解决的问题是提供杂交瘤细胞株10G4及其产生的抗黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量单克隆抗体。 

本发明提供了杂交瘤细胞株10G4，该细胞株已于2010年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO. C201016，分类命名为小鼠杂交瘤细胞10G4。其具有序列表中SEQ ID NO.1所示的抗黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量单克隆抗体重链可变区编码基因序列和序列表中SEQ ID NO.2所示的抗黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量单克隆抗体轻链可变区编码基因序列。 

抗黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量单克隆抗体，它由保藏编号为CCTCC NO. C201016的杂交瘤细胞株10G4分泌产生。其重链可变区具有序列表中SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；轻链可变区具有序列表中SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。 

本发明提供的杂交瘤细胞株10G4是采用两步筛选法获得的，其具体步骤为：将BALB/c小鼠经黄曲霉毒素完全抗原AFB1-BSA免疫4-6次后，用2倍于前一次免疫剂量的黄曲霉毒素完全抗原AFB1-BSA作最后一次加强免疫，3天后进行细胞融合，采用ELISA方法分两步进行筛选融合细胞：第一步采用间接ELISA法筛选出抗黄曲霉毒素B1而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔培养液进行检测，用黄曲霉毒素G2作为竞争原——因为国内外现有报道的黄曲霉毒素通用抗体对黄曲霉毒素G2的交叉反应率往往是最小的（＜50%），选择吸光值和灵敏度均较高的孔，采用有限稀释法进行克隆，克隆后10天左右采用同样的两步筛选法进行检测，如此重复克隆2-3次后，最终筛选获得杂交瘤细胞株10G4。 

抗黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量单克隆抗体在黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量测定中的应用。 

本发明提供的抗黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量单克隆抗体的制备方法，步骤如下：将获得的杂交瘤细胞株10G4注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，纯化即得抗黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量单克隆抗体。 

按上述方案，所述的纯化方法为辛酸-硫酸铵法，具体操作为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000r/min离心15min以上，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为30～35 μL，室温混合30～60min，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L 和pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，用2 mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4，4 ℃预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，对纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的抗黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量单克隆抗体，将抗体置-20℃冰箱中备用； 

所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容至100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容至100mL所得。

本发明的有益效果在于： 

(1)本发明提供的杂交瘤细胞株10G4可以用于制备抗黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量单克隆抗体。用常规非竞争酶联免疫吸附分析（ELISA）法测得10G4的鼠腹水抗体的效价可达5.12×10⁵。

(2)本发明提供的抗黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量单克隆抗体可以一致性较好地识别黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2，对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的50%抑制浓度IC₅₀依次为2.09ng/mL、2.23ng/mL、2.19ng/mL、3.21ng/mL，对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的交叉反应率范围为65.2%-100%。 

(3)本发明提供的抗黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量单克隆抗体可应用于定量测定黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量。 

具体实施方式

实施例1：杂交瘤细胞株10G4的制备 

1.动物免疫

 购买6周龄BALB/c小鼠6只，免疫市售的黄曲霉毒素B1完全抗原AFB1-BSA。第一次免疫将黄曲霉毒素B1完全抗原与等量福氏完全佐剂乳化后，于小鼠颈背部皮下多点注射。第二次免疫于4周后进行，采用福氏不完全佐剂与等量黄曲霉毒素B1完全抗原乳化，于小鼠腹腔注射。第三次免疫与第二次免疫间隔4周，免疫方式与其相同，第四次免疫于第三次免疫3周后进行，免疫方式与第二次免疫相同，同样为腹腔注射。4次免疫剂量相同，均为每鼠50μg。前3次每次免疫后8天，尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法监测小鼠血清效价。第4次免疫后8天，尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法监测小鼠血清效价，并用间接竞争ELISA法测定小鼠血清灵敏度，选择效价、灵敏度均相对较高的血清对应的小鼠进行最后一次加强免疫，免疫剂量为之前的2倍。黄曲霉毒素B1完全抗原AFB1-BSA购于Sigma-Aldrich公司。

2.细胞融合 

于最后一次加强免疫3天后，采用50%（重量百分数）的聚乙二醇即PEG（分子量为1450）作融合剂，按常规方法进行细胞融合，具体步骤：无菌条件下杀死免疫小鼠，分离脾细胞，与鼠源骨髓瘤细胞SP2/0以5︰1的个数比混合，用RPMI-1640基础培养液洗混合细胞，用50%PEG融合，融合1分钟，然后加满RPMI-1640基础培养液，离心，移去上清，小鼠脾细胞和鼠源骨髓瘤细胞SP2/0形成的融合细胞用72mLRPMI-1640基础培养液重悬，将重悬起来的细胞滴加到96孔细胞培养板内，2滴/孔，置37℃二氧化碳培养箱培养，所述的RPMI-1640基础培养液为含有20%（体积百分数）胎牛血清，2%（重量百分数）生长因子和1%（重量百分数）次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即HAT。上述SP2/0购于上海泛柯生物科技有限公司；RPMI-1640基础培养液购于Hyclone公司；1%次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即HAT购于Sigma-Aldrich公司。

3.细胞株的筛选及克隆 

待细胞融合后第12天左右，细胞集落长到占孔底1/2大小，培养液变黄，即可进行抗体检测。采用ELISA方法对有杂交瘤细胞生长的培养孔进行筛选，筛选分两步进行，第一步采用间接ELISA法筛选出抗黄曲霉毒素B1而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔进行检测，用黄曲霉毒素G2作为竞争原，选择吸光值和灵敏度均较高的孔（吸光值较高指竞争原为0的孔即阳性对照孔的最终测定值较高，灵敏度较高指抑制率为50%时的竞争原浓度亦即IC₅₀值较小），采用有限稀释法进行克隆，克隆后10天左右采用同样的两步法进行检测，如此重复克隆2-3次后，获得杂交瘤细胞株10G4。

实施例2：抗黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量单克隆抗体杂交瘤细胞株系10G4抗体可变区序列测定 

（1）提取总RNA：采用天根公司的总RNA提取试剂盒并按照说明书提取可产生杂交瘤细胞株系10G4的总RNA；

（2）合成cDNA：以步骤1获得的总RNA 为模板，oligo (dT) ₁₅为引物，按照SuperScript^TM-2 Ⅱ反转录酶说明书进行反转录，合成cDNA第一链；引物oligo (dT) ₁₅ 由Invitrogen购得；

（3）PCR法克隆可变区基因：根据GENEBANK中小鼠抗体基因序列的保守位点设计引物，以cDNA为模版扩增抗体轻、重链可变区基因。PCR程序为：94℃ 30s、55℃ 1min、72℃ 1min ，扩增 30 个循环，最后 72℃延伸 10min。PCR 产物经过1％（重量百分数）的琼脂糖凝胶电泳分离后，用试剂盒纯化回收DNA片段，连接到载体pMD18-T中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，送至上海桑尼生物科技有限公司进行测序。其中引物的序列分别为：重链可变区引物为5^，-AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG G-3^，（22mer）和5^，-TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CC-3^，（32mer）其中S、M、R和W为兼并碱基，M=A/C，R=A/G，S=C/G，W=A/T，轻链可变区引物为5^，-GAC ATT GAG CTC ACC CAG CTT GGT GCC -3^，（24mer）和5^，-CCG TTT CAG CTC CAG CTT GGT CCC-3^，（24mer）。

得到的基因序列结果：重链可变区编码基因序列长356bp，序列如SEQ ID NO:1所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的重链可变区由118个氨基酸组成，序列如SEQ ID NO:3所示。轻链可变区编码基因序列长332bp，序列如SEQ ID NO:2所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的轻链可变区由110个氨基酸组成，序列如SEQ ID NO:4所示。 

实施例3：抗黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量单克隆抗体的制备纯化、亚型和特性鉴定 

将实施例2获得的抗黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量单克隆抗体杂交瘤细胞株系10G4注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，具体操作为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000r/min离心15min，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为33 μL，室温混合30min，4℃静置2h，然后4℃，12000r/min离心30min，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L 和pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，用2 mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4，4 ℃预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h，然后4℃，12000r/min离心30min，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，对纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的抗黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量单克隆抗体，将抗体置-20℃冰箱中备用；所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容至100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容至100mL所得。

用市售亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株10G4分泌的抗黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量单克隆抗体的亚型为IgG1。 

用常规非竞争酶联免疫吸附分析（ELISA）法测得10G4的鼠腹水抗体的效价可达5.12×10⁵，即鼠腹水抗体稀释5.12×10⁵倍时的溶液测定结果为阳性。用常规间接竞争ELISA法鉴定其对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量的灵敏度50%抑制浓度IC₅₀依次为2.09ng/mL、2.23ng/mL、2.19ng/mL、3.21ng/mL，对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的交叉反应率范围为65.2%-100%。 

实施例4：黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量单克隆抗体10G4的应用。 

将实施例3中获得的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2共4条标准曲线平均化处理获得一条新的定量分析曲线作为黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量分析曲线，并用于检测5份花生实际样品黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量，同时采用GB/T 18979-2003高效液相色谱标准方法进行检测比对，结果显示两种方法一致性比较理想，详细结果： 

样品1：基于抗体10G4的总量ELISA方法检测结果为0.23ng/mL，GB/T 18979-2003高效液相色谱标准方法检测结果为0.2ng/mL；

样品2：基于抗体10G4的总量ELISA方法检测结果为1.47ng/mL，GB/T 18979-2003高效液相色谱标准方法检测结果为1.2ng/mL；

样品3：基于抗体10G4的总量ELISA方法检测结果为0.88ng/mL，GB/T 18979-2003高效液相色谱标准方法检测结果为1.1 ng/mL；

样品4：基于抗体10G4的总量ELISA方法检测结果为阴性，GB/T 18979-2003高效液相色谱标准方法检测结果为阴性；

样品5：基于抗体10G4的总量ELISA方法检测结果为0.92ng/mL，GB/T 18979-2003高效液相色谱标准方法检测结果为0.8ng/mL。

序列表

＜110＞  中国农业科学院油料作物研究所

 

＜120＞  杂交瘤细胞株10G4及其产生的抗黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量单克隆抗体

 

＜160＞  4

 

＜210＞  1

＜211＞  356bp

＜212＞  DNA

＜213＞  小鼠

 

＜400＞ 1

aggtgcagct gcaggagtca gggggaggct tagtgaagcc tggagggtcc 50

ctgaaactct cctgtgcagc ctcaggattc actctcagta gtaatgacat 100

gtcttgggtt cgccagacac cggagaagag gctggagtgg gtcgcaagta 150

ttagtagagg tggtaggtac acctactatc cagacagtgt gaaggggcga 200

ttcaccatct ccagagacaa agccaagaac accctgtatc tgcaaatgaa 250

cagtctgagg tctgaggata cggccatgta ttattgtgca agacactatg 300

gtagctactg gtacttcgat gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 350

tcctca                                                                                 356

 

＜210＞  2

＜211＞  332bp

＜212＞  DNA

＜213＞  小鼠

 

＜400＞  2

ccgtttgatt  tccagcttgg  tgccccctcc  gaacgtgtaa  gctccctaat  50

gtgctgacag  taataggttg  cagcatcctc  ctcctccaca  ggatggatgt  100

tgagggtgaa  gtctgtccca  gacccactgc  cactgaacct  ggcagggacc  150

ccagattcta  ggttggatac  aagatagatg  aggagtctgg  gtggctgtcc  200

tggtttctgt  tggttccagt  gcatataact  atagccagat  gtactgacac  250

ttttgctggc  cctgtatgag  atggtggccc  tctgccccag  agatacagct  300

aaggaagctg  gagactgggt  gagctcaatg  tc                                  332

 

＜210＞  3

＜211＞  118

＜212＞  PRT

＜213＞  小鼠

 

＜400＞  3

Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser

1                          5                              10                             15                          20

Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Ser Asn Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro 

                            25                          30                             35                           40

Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Arg Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro 

                           45                         50                            55                        60

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 

                           65                          70                            75                          80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg His Tyr Gly                  

                           85                            90                             95                          100

Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 

                          105                          110                           115                          

＜210＞  4

＜211＞  110

＜212＞  PRT

＜213＞  小鼠

 

＜400＞  4

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr

1                          5                           10                           15                           20

Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn

                          25                          30                           35                            40

Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser

                            45                           50                            55                         60

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

                           65                           70                            75                          80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg

                            85                            90                           95                        100

Ser  Glu  Gly  Ala  Pro  Ser  Trp  Lys  Ser  Asn

                                 105                                110