粮谷中的黄曲霉毒素(B1、B2、G1、G2)和赭曲霉毒素A联合检测研究

摘要

黄曲霉毒素(AFT)和赭曲霉毒素(OT)是真菌毒素中毒性最大的两类毒素，1993年AFB1被国际癌症研究机构(IARC)列为一类致癌物，赭曲霉毒素中的赭曲霉毒素A(OTA)则被列为二类致癌物。AFT和OT不仅毒性强，而且污染范围极广，AFT对粮食和饲料的危害有不少报道，检出率高达80％～100％，OT则被许多国家检出大量污染粮食作物，更有资料表明AFT和OTA常常同时污染同一粮食作物，而且存在毒性的加性效应，众多国家和地区都已经制定了AFT和OTA严格的限量标准。目前虽然AFT和OTA的分别测定方法已比较成熟，很多学者都做了大量的研究，但其分别测定成本较高，试剂损耗严重且测定耗时，工作量大。而对AFT和OT进行联合检测可有效解决上述问题，缩短分析时间，提高食品安全性。目前对食品、农产品中AFT和OT等真菌毒素的单独检测方法主要有薄层色谱法、酶联免疫吸附法、荧光光度法、胶体金免疫层析法和高效液相色谱法等，但对其进行联合检测的报道较少，虽有少数文献建立了其联合检测方法，但其方法成本高，设备昂贵，不能在一般实验室大面积推广使用，因而受到限制。建立一套成本低，操作简便、快速、净化效果好的AFT和OTA联合检测方法，运用于粮食作物中的真菌毒素检测，意义重大。
　　 本研究建立了粮谷中AFT和OTA的联合检测方法，样品采用超声波提取，液液萃取净化，高效液相色谱-可变荧光波长检测器测定。同时对方法的准确度，精密度，灵敏度和线性范围等进行研究，并与现行国标方法进行比对实验，主要结论如下：
　　 (1)通过荧光分光光度计在200nm～700nm范围内全波段扫描，AFT的最大激发波长360nm左右，最大发射波长440nm左右；OTA最大激发波长333nm左右，最大发射波长477nm左右。经过高效液相色谱-荧光检测器检测，AFT(衍生后)和OTA在液相色谱上有很强的荧光信号，而且每种毒素荧光信号的峰面积和其对应浓度都有良好的线性关系，线性相关系数都在0.999以上，说明通过液相色谱-荧光检测器联合检测AFT和OTA是可行的。
　　 (2)对提取过程中影响提取效果的各个因素进行了研究。确定取样量为5g时，可以满足提取回收率的要求，达到80％以上的回收率，变异系数为10％以内；不同提取方式对固体样品中AFT和OTA提取率影响很大，超声波20℃处理20min时可以基本达到最大提取率，回收率在90％左右，检测时间比国家标准振荡处理缩短了近30min；实验研究了提取剂的浓度，提取比对提取效果的影响，20mL80％甲醇溶液对5g样品的提取率可以达到最大，回收率达到80％以上；当进行液液萃取时，第一次萃取后仍有少量毒素残留在水相中，萃取不完全，回收率低，当二次萃取后回收率显著升高，毒素已基本萃取完全，所以实验中进行多次萃取是必要的。
　　 (3)在玉米，大米，小麦三类样品中加标回收率平均为71.73％～115.37％，相对标准偏差为3.00％～9.88％：经连续日间和日内7次精密度实验，相对标准偏差为3.00％～9.30％，根据3倍信噪比的峰响应值，确定AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和OTA检出限分别为0.06、0.03、0.18、0.05、0.51μg/kg，上述五种毒素分别在浓度0.05～100.00、0.125～25.00、0.05～100.00、0.125～25.00、0.05～50.00μg/L范围内成线性相关，相关系数r分别为0.9995、0.9996、0.9998、0.9992和0.9998；方法学验证结果表明，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和OTA联合检测结果与现行国标的单独检测方法检测结果无显著性差异(P>0.05)。