用于通过过量表达胞外多糖质构化食品的具有修饰的半乳糖激酶表达的乳酸细菌

摘要

本发明涉及一种具有质构化性质的细菌细胞、包含所述细胞的发酵剂培养物和用所述发酵剂培养物发酵的乳制品。

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有质构化性质的细菌细胞、包含所述细胞的发酵剂培养 物和用所述发酵剂培养物发酵的乳制品。

背景技术

食品工业使用多种细菌、尤其是乳酸细菌以改良食品的味道和质构，以及 延长这些食品的保存期。在乳业中，广泛使用乳酸细菌实现奶的酸化(通过发 酵)以及对掺入其的产品进行质构化。

在食品工业使用的乳酸细菌当中，提到了链球菌属(Streptococcus)、乳球 菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、 小球菌属(Pediococcus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)。嗜热链球菌 (Streptococcus thermophilus)种的乳酸细菌可大规模地单独或与其它细菌组合 用于制造食品、尤其是发酵产品。它们尤其用于制备用来制造发酵奶、例如酸 奶的发酵物。其中的一些在改善发酵产品的质构方面具有显著作用。这种特征 与多糖制造息息相关。在嗜热链球菌菌株中，可以区分质构化和非质构化菌株。

为了满足行业中的需求，必需提出新颖的质构化乳酸细菌菌株、尤其是嗜 热链球菌。

WO2007095958A1公开了具有质构化性质的嗜热链球菌菌株。在图1中， 可以看出质构化性质最强的菌株CHCC8833(DSM17876)具有约59Pa的剪切 应力值。

J Dairy Sci.92：477-482(2009)公开了一项研究，其显示可通过增加GalK活 性进行基因工程来促进粘稠嗜热链球菌菌株制造EPS。推断出当所述菌株与保 加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)组合用于制造酸奶时，重组菌株的EPS 过量产生并不显著。

因此，本发明想解决的问题是提供一种乳酸细菌菌株，其具有用于对食品 进行质构化的优良性质，特别是其中一起使用质构化乳酸细菌菌株(例如嗜热 链球菌)和乳杆菌种的菌株的产品。

发明内容

发明人惊讶地发现，GalK(半乳糖激酶)基因具有突变的乳酸细菌在发酵 奶中产生的粘度要高于野生型(母菌株)菌株，特别是在和乳杆菌一起对奶进 行发酵时。

根据此惊人发现，本发明涉及GalK基因具有突变的新颖超级质构化乳酸细 菌菌株，例如嗜热链球菌菌株，和制造这些菌株的方法，以及使用所述菌株制 备的发酵奶产品。

具体实施方式

在第一方面中，本发明涉及一种制造乳酸细菌(例如在发酵奶中产生的粘 度高于母菌株的细菌，或例如在发酵奶中产生的粘度大于约70Pa(例如大于71 Pa或大于73Pa，以在37℃下生长12小时后的剪切应力度量)的细菌)的方法， 其包括：

a)提供乳酸细菌菌株(母菌株)；和

b)在所述菌株的GalK基因中引入突变。

因此，第一方面的实施方案是：

-制造在发酵奶中产生的粘度高于母菌株(例如以例如在37℃下生长12小时 后的剪切应力度量)的乳酸细菌的方法，所述方法包括：

a)提供乳酸细菌菌株(母菌株)；和

b)在所述菌株的GalK基因中引入突变。

-制造在发酵奶中产生的粘度大于约70Pa(例如以例如在37℃下生长12小 时后的剪切应力度量)的乳酸细菌的方法，所述方法包括：

a)提供乳酸细菌菌株(母菌株)；和

b)在所述菌株的GalK基因中引入突变。

在目前优选的实施方案中，粘度是以在37℃下生长12小时后的剪切应力度 量，和/或如在下文所述的分析中度量。因此，本发明的第一方面的目前优选的 实施方案是制造在发酵奶中产生的粘度大于约70Pa(以在37℃下生长12小时后 的剪切应力度量)的乳酸细菌的方法，所述方法包括：

a)提供乳酸细菌菌株(母菌株)；和

b)在所述菌株的GalK基因中引入突变。

本发明的方法可进一步包括一个或一个以上选自由以下组成的组的其它步 骤：

c1)筛选产生质构的突变株，例如产生比母菌株更高的质构性或增加奶底 物的粘度的菌株；和

c2)筛选具有Gal+表型、例如与母菌株相比具有提高的半乳糖降解/发酵活 性的突变株。

突变可引入基因的启动子区域，例如基因的-10区域(Pribnow盒)。

在本发明的方法的引人关注的实施方案中，突变导致野生型-10区域 (TACGAT)中的C和G中的一者或两者被独立选自由A和T组成的组的核苷酸替 换。

突变可导致野生型-10区域(TACGAT)中的C被独立选自由A和T组成的组 的核苷酸替换。

在一个实施方案中，突变导致野生型-10区域(TACGAT)中的C被T替换， 和/或突变产生具有核苷酸序列TATGAT、TATTAT或TACTAT的-10区域。

突变可使用基因工程技术和/或使用诱变技术(例如通过辐射或用化学剂处 理)引入，任选地随后对GalK基因进行分析以检验GalK基因中的突变。

细菌(母菌株)可选自属于由链球菌属、乳球菌属、乳杆菌属、明串珠菌 属、小球菌属和双歧杆菌属组成的组的属。引人关注的细菌属于嗜热链球菌种。

在另一方面中，本发明涉及一种可通过本发明的方法获得的乳酸细菌。

此外，本发明涉及一种在发酵奶中产生的粘度大于约70Pa(例如大于71Pa 或大于73Pa，以在37℃下生长12小时后的剪切应力度量)的乳酸细菌；一种在 GalK基因的-10区域中携带突变(与野生型-10区域(TACGAT)相比)的乳酸细 菌，其中所述突变产生具有核苷酸序列TATGAT、TATTAT或TACTAT的-10区域； 和一种在GalK基因的-10区域中携带突变的乳酸细菌，所述突变导致野生型-10 区域(TACGAT)中的C被独立选自由A和T组成的组的核苷酸替换。在一个引人 关注的实施方案中，所述突变导致野生型-10区域(TACGAT)中的C被T替换。

在一个引人关注的实施方案中，本发明的乳酸细菌包含SEQ ID NO：5或其启 动子区域，该启动子区域包含-35区域和-10区域。乳酸细菌优选属于嗜热链球菌 种。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种属于嗜热链球菌种的菌株，选自由 CHCC11379(DSM 22884)、CHCC11342、CHCC11976和其中任一种的突变株 和变异株组成的组。此外，本发明还涉及本文所提及的所有新颖菌株以及其突 变株和变异株。

在另一方面中，本发明涉及一种包含本发明的乳酸细菌、例如属于菌株 CHCC11379的细菌的组合物。所述组合物优选包含至少10¹⁰CFU(细胞形成单 位)的所述细菌。

组合物可包含作为混合物或多组分试剂盒(kit-of-parts)的以下菌株

-属于乳杆菌种的菌株，例如保加利亚乳杆菌或发酵乳杆菌(L.fermentum) 菌株；和

-本发明的乳酸细菌的菌株，例如属于嗜热链球菌种的菌株。

属于乳杆菌种的菌株目前优选是属于产多糖(例如杂多糖、同多糖)和/或 果糖基转移酶的乳杆菌种的菌株。

组合物可包含至少10¹⁰CFU(细胞形成单位)的属于乳杆菌种的菌株；和至 少10¹⁰CFU的属于嗜热链球菌种的菌株。

组合物优选可用作发酵剂培养物，且采取冷冻、冻干或液体形式。

在另一方面中，本发明涉及一种制造发酵奶产品/乳制品的方法，包括用本 发明的乳酸细菌、菌株或组合物发酵奶底物(例如牛奶)。

所述方法可进一步包括用属于乳杆菌种的菌株发酵奶底物，例如保加利亚 乳杆菌或发酵乳杆菌菌株，例如选自由LB18、CHCC10019(DSM19252)、 DSM22584或CHCC3984(DSM19251)和这些菌株中任一种的突变株和变 异株组成的组的菌株。

可在用属于乳杆菌种的菌株发酵之前、期间或之后用任一前述权利要求的 菌株或细菌，例如属于嗜热链球菌种的菌株进行发酵奶底物。

所述方法可包括在发酵之前、期间和/或之后向奶底物中加入酶，例如选自 由以下组成的组的酶：能交联蛋白质的酶、谷氨酰胺转移酶、天冬氨酸蛋白酶、 凝乳酶(chymosin)和粗制凝乳酶(rennet)。

在另一方面中，本发明涉及一种可通过本发明的方法获得的乳制品，例如 发酵奶产品(例如酸奶或酪乳)或奶酪(例如新鲜奶酪或帕斯塔费拉塔奶酪(pasta  filata))。发酵奶产品可例如为搅拌型产品或静置型(set-type)产品。

乳制品可任选地包含选自由以下组成的组的成分：浓缩果汁、糖浆、益生 菌培养物、着色剂、增稠剂、调味剂和防腐剂；和/或其任选地采取搅拌型产品、 静置型产品或饮用产品的形式。

本发明还涉及一种乳制品，其可用本发明的乳酸细菌(例如属于嗜热链球 菌种的菌株，例如DSM 22884)和选自保加利亚乳杆菌和发酵乳杆菌种(例如 CHCC10019(DSM19252)、CHCC3984(DSM19251)和CHCC2008 (DSM22584))的乳酸细菌发酵奶底物(例如牛奶)来制得。

在引人关注的实施方案中，本发明的乳制品具有大于100Pa(例如大于102 Pa或大于104Pa)的粘度，以例如在37℃下生长12小时后的剪切应力度量。在一 个目前优选的实施方案中，大于100Pa的粘度是通过细菌细胞单独生长获得，但 更高的粘度值可通过加入例如明胶、卡拉胶(carrageenan)等化合物获得。

定义

如本文所用，术语“乳酸细菌”指示革兰氏阳性的微需氧或厌氧细菌，其发酵 糖，产生酸，包括乳酸(作为主要生产的酸)、乙酸和丙酸。工业上最有用的 乳酸细菌属于“乳杆菌”目，包括乳球菌属、链球菌属、乳杆菌属、明串珠菌属、 伪明串珠菌属(Pseudoleuconostoc spp.)、小球菌属、短杆菌属(Brevibacterium  spp.)、肠球菌属(Enterococcus spp.)和丙酸杆菌属(Propionibacterium spp.)。 此外，属于严格厌氧菌双歧杆菌(即双歧杆菌属)的组的产乳酸菌一般包含在 乳酸细菌的组中。这些经常单独或和其它乳酸细菌组合用作食品培养物。包括 乳杆菌种和嗜热链球菌种的细菌在内的乳酸细菌通常以冷冻或冻干培养物的形 式供应给乳品业，以用于批量发酵剂繁殖(bulk starter propagation)，或以打算 直接接种到发酵容器或桶中的所谓的“直接桶式”(Direct Vat Set；DVS)培养物 的形式供应给乳品业，以用于制造乳制品，例如发酵奶产品。所述培养物一般 称为“发酵剂培养物”或“发酵剂”。

术语“奶”应理解为通过给任何哺乳动物，例如奶牛、绵羊、山羊、水牛或骆 驼挤奶而获得的乳分泌物。在一个优选实施方案中，奶是牛奶。术语“奶”还包括 由植物材料制造的蛋白质/脂肪溶液，例如豆奶。

术语“奶底物”可以是可根据本发明的方法而经历发酵的任何生乳和/或加工 奶材料。因此，有用的奶底物包括(但不限于)包含蛋白质的任何奶或奶状产 品的溶液/悬浮液，所述奶或奶状产品例如是全脂奶或低脂奶、脱脂奶、酪乳、 复原奶粉、炼乳、奶粉、乳清、乳清渗透物、乳糖、由乳糖结晶获得的母液、 乳清蛋白浓缩物或乳脂。显然，奶底物可来源于任何哺乳动物，例如为基本上 纯的哺乳动物奶，或复原奶粉。

在发酵之前，奶底物可根据所属领域中已知的方法进行均质化和巴氏灭菌。

本文所用的“均质化”意思是彻底混合以获得可溶的悬浮液或乳液。如果均质 化在发酵之前进行，那么其目的是将奶中的脂肪打碎成较小尺寸以便其不再与 奶分离。这可通过在高压下迫使奶通过小孔来实现。

本文所用的“巴氏灭菌”意思是处理奶底物以减少或消除例如微生物等活有 机体的存在。优选地，巴氏灭菌是通过将指定温度维持指定时段来实现。指定 温度通常通过加热来实现。可选择温度和持续时间以便杀死或灭活特定细菌， 例如有害细菌。随后可进行快速冷却步骤。

本发明方法中的“发酵”意思是通过微生物作用将碳水化合物转化为醇类或 酸类。优选地，本发明方法中的发酵包括将乳糖转化为乳酸。

打算用于制造发酵奶产品的发酵方法是众所周知的，且所属领域技术人员 将了解如何选择合适的工艺条件，例如温度、氧、微生物的量和特征以及处理 时间。显然，应选择发酵条件以便实现本发明，即获得固体或液体形式的乳制 品(发酵奶产品)。

术语“搅拌型产品”特定地是指在发酵之后维持机械处理，导致发酵阶段形成 的凝结物被碎裂和液化的发酵奶产品。机械处理典型地但不是排他地通过搅拌、 抽吸、过滤或均质化凝胶，或通过和其它成分混合来实现。搅拌型产品典型地 但不是排他地具有9％至15％的奶固体非脂肪含量。

术语“静置型产品”包括已经用发酵剂培养物(例如发酵剂培养物)接种且在 接种步骤后包装，然后在包装中发酵的基于奶的产品。

在本发明中，术语“突变株”应理解为通过例如基因工程、辐射和/或化学处 理而从本发明的菌株衍生的菌株。突变株优选是功能相等的突变株，例如相比 母菌株具有基本上相同或改进的性质(例如关于质构、剪切应力、粘度、凝胶 硬度、口腔包覆感、风味、后酸化、酸化速度和/或噬菌体稳定性(phage  robustness))的突变株。所述突变株是本发明的一部分。特别地，术语“突变 株”是指使本发明的菌株经历任何常规使用的诱变处理(包括用例如乙烷甲烷磺 酸盐(EMS)或N-甲基-N′-硝基-N-硝基胍(NTG)等化学诱变剂、UV光处理) 而获得的菌株，或自发形成的突变株。突变株可能已经经历数次诱变处理(单 次处理应理解为一个诱变步骤，接着是筛选/选择步骤)，但目前优选执行不超 过20次或不超过10次或不超过5次处理(或筛选/选择步骤)。在目前优选的突变 株中，相比母菌株，细菌基因组中小于5％或小于1％或甚至小于0.1％的核苷酸被 另一种核苷酸替换，或被缺失。在本发明中，术语“变异株”应理解为功能与本发 明的菌株等效的菌株，例如具有基本上相同或改进的性质(例如关于质构、剪 切应力、粘度、凝胶硬度、口腔包覆感、风味、后酸化、酸化速度和/或噬菌体 稳定性)。所述变异株可使用适当的筛选技术鉴别，并且是本发明的一部分。

在本发明中，“质构”是以在37℃下生长12小时后的剪切应力度量。打算用于 分析质构的分析：

在培养后当天，使发酵奶达到13℃并用配备有带孔圆盘(bored disc)的搅 拌棒轻轻搅拌，直到样品变得均匀为止。在配备有C25同轴测量系统的流变仪 (StressTech，Reologica Instruments，Sweden)上评估样品的流变性质。利用在 21步中从0.27l/s到300l/s变化的剪切速率进行粘度测试。先增加后降低剪切速 率，并记录剪切应力和表观粘度的向上和向下曲线。延迟时间和积分时间分别 为5s和10s。

除非本文另外指定或上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(特 别是在以下权利要求的上下文中)使用的术语“一”和“所述”和类似指示物应解释 为涵盖单数和复数。除非另外指定，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有” 应解释为开放式术语(即意思是“包括(但不限于)”)。除非本文另外指定，否 则本文叙述的值的范围仅打算用作个别地提及落在所述范围内的每一单独值的 简化方法，且每一单独值都被纳入说明书中，就如同其在本文中被个别地叙述 一样。除非本文中另外指定或上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法都可 按任何合适次序进行。使用任何和所有实施例或本文提供的示例性修辞(例如 “诸如”)仅打算更好地阐明本发明，且除非另外要求，否则不会对本发明的范围 构成限制。说明书中的任何修辞都不应解释为表明任何未要求的要素对于本发 明的实施是必不可少的。

附图说明

图1描绘用StressTech流变仪测量的CHCC11379的剪切应力。结果显示在43℃ 下生长整夜后，用CHCC11379凝固的奶获得改良的质构(剪切应力)。质构是 通过如发酵奶质构的分析所述，使用StressTech流变仪以帕斯卡(Pa)度量的剪 切应力评估来定量。

实施例

实施例1制备链球菌菌株的半乳糖阳性突变株

半乳糖发酵菌株的分离

分离作为嗜热链球菌菌株CHCC6008(＝ST6008，DSM18111)的半乳糖 发酵突变株的突变株。在突变株分离步骤之前既不用任何诱变化合物也不用UV 光对CHCC6008细胞进行诱变。分离的菌株因此类似于CHCC6008的自发半乳 糖阳性突变株。

在分离突变株之前，将CHCC6008接种于含有2％半乳糖的M17琼脂平板 (M17-gal平板)上。CHCC6008在半乳糖作为唯一的碳水化合物源时不生长。

然后将CHCC6008的整夜培养物涂布于M17-gal平板上，且可在37℃下生长 两天后分离若干菌落。在M17-gal平板上纯化若干突变株，并在含有2％半乳糖作 为唯一碳水化合物的M17肉汤中再测试。

CHCC6008没有显著降低M17-gal肉汤的pH，但纯化的突变株之一 CHCC11379在37℃下生长10小时后达到pH 5.3，且因此被视为源自CHCC6008 的半乳糖发酵突变株。

菌株CHCC11342和CHCC11976按同样的方法分离。

通过基因工程分离突变株

半乳糖阳性突变株也可通过定点诱变产生。使用在galK-10启动子盒内携带 突变核苷酸的寡聚核苷酸通过PCR扩增特定DNA片段。将携带期望突变的PCR 片段克隆到载体质粒中，并转化入嗜热链球菌目标菌株中，通过重组将所述突 变整合入染色体并交换野生型galK启动子区域。菌株的分离如上进行。

发酵奶质构的分析

在培养后当天，使发酵奶达到13℃并用配备有带孔圆盘的搅拌棒轻轻搅拌， 直到样品变得均匀为止。在配备有C25同轴测量系统的流变仪(StressTech，流 变仪，Sweden)上评估样品的流变性质。

利用在21步中从0.27l/s到300l/s变化的剪切速率进行粘度测试。先增加后 降低剪切速率，并记录剪切应力和表观粘度的向上和向下曲线。

延迟时间和积分时间分别为5s和10s。为进行进一步分析，选择300s-1下的 剪切应力。流变仪结果显示，CHCC11379的剪切应力与CHCC6008相比提高了 10％(CHCC11379的剪切应力值为74.0Pa(帕斯卡)，而母菌株CHCC6008则为 67.5Pa，参见图1)。

发酵奶质构的分析

在另一个实验中，使用CHCC11379作为酸奶培养物的一部分，其中来自嗜 热链球菌的菌株在43℃在脱脂奶中和来自德氏乳杆菌保加利亚亚种 (Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus)的菌株共同培养。当酸奶制造中的 唯一区别为使用CHCC11379而不是野生型CHCC6008时，剪切应力也增加了10％ (含CHCC11379的酸奶培养物的剪切应力为105.0Pa，而含CHCC6008的酸奶 培养物的剪切应力为94.7Pa)。

CHCC11379的galK启动子区域的测序

为了揭示gal阳性突变株CHCC11379的突变类型，对galK基因(编码嗜热链 球菌的半乳糖激酶)的开始部分进行测序。

对于CHCC11379，鉴别了galK启动子区域中的突变(见下文)。对应的突 变最可能导致启动子活性相比母菌株6008获得增强，这解释了观察到的gal阳性 表型。这是基于以下事实：-10启动子盒的共有序列为“TATAAT”，且 CHCC6008的-10盒(区域)(“TACGAT”)核苷酸3上的突变产生了与CHCC11379 中的共有序列具有更高相似性的-10盒(“TATGAT”)。

CHCC11379的galK基因的启动子区域。CHCC11379galk启动子内的点突变 用灰色代码标识。嗜热链球菌ST111(Genbank保藏号AY704368)的公开galK 序列已作标记以用于比较。-35：-35-启动子区域；-10：-10-启动子区域； RBS：核糖体结合位点。

本文描述本发明的优选实施方案，包括发明人已知的实施本发明的最佳模 式。那些优选实施方案的变化在所属领域技术人员阅读上述发明内容时可变得 显而易见。发明人期望熟练技术人员在适当时使用所述变化，且发明人希望可 用除本文特定描述的内容以外的方法实施本发明。因此，本发明包括随附权利 要求书中陈述的主题的所有修改和对等物，这是适用法律所允许的。此外，除 非本文另外指定或上下文另外明显矛盾，否则本发明涵盖上述要素的所有可能 变化的任何组合。

保藏物和专家解决方案

嗜热链球菌菌株CHCC11379已经在2009年8月26日以保藏号DSM22884保藏 在DSMZ(德国布伦瑞克D-38124，7B，德国微生物菌种保藏中心(Deutsche  Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Inhoffenstr.7B， D-38124Braunschweig，Germany))。嗜热链球菌(ST)菌株ST6008(也称为 CHCC6008)的样品已经以保藏号DSM 18111保藏在DSMZ，保藏日期为2006 年3月29日。CHCC11342(DSM 22932)和CHCC11976(DSM 22934)于2009 年9月8日保藏在DSMZ。

在DSMZ的其它保藏物：

CHCC10019(DSM19252)、CHCC3984(DSM19251)：保藏日期2007 年4月3日，

CHCC2008(DSM22584)：保藏日期2009年5月19日。

保藏物已经根据“国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约” (Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of  Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure)制备。

申请人要求被保藏微生物的样品只能供申请人批准的专家使用。

参考文献

Appl.Environ，Microbiol.71，7，第3659-67页(2005)

International Journal of Food Microbiology 113(2007)195-200

APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，2002年2月，第

784-790页

J Dairy Sci 92：477-482(2009)

WO2008/040734A1，WO2007/025097A2，US7241610B2， WO2007/144770A2，WO2004/085607A，WO2008/148561A

本专利文件中所述的所有参考文献皆以全文引用的方式并入本文中。

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