由间接竞争时间分辨荧光免疫分析体系检测烟草中菌核净残留的方法

摘要

本发明涉及一种由间接竞争时间分辨荧光免疫分析体系检测烟草中菌核净残留的方法，其中：所述的CI-TRFIA检测体系是以菌核净-OVA作为包被抗原，以菌核净多克隆抗体作为识别抗体，以Eu-N1标记的羊抗兔IgG作为二抗，建立与菌核净农药对应的标准抑制曲线；所述的检测烟草中菌核净残留是指：对烟草样品前处理后，通过CI-TRFIA检测体系对其进行检测，判断与样品对应的烟草中菌核净残留量。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种由CI-TRFIA检测体系检测烟草中菌核净残留的方法。

背景技术：

菌核净(N-3，5-二氯苯基丁二酰胺)是一种高效、低毒的亚胺类杀菌剂。它 具有广谱、杀菌、内吸、渗透、持效期长等特点，广泛用于烟草赤星病和水稻 纹枯病的防治。考虑到菌核净残留对人类健康和环境存在潜在风险，建立烟草 中菌核净残留的检测方法势在必行。然而，我国烟草中菌核净的残留限量尚未 制定，检测标准也仅有烟草行业标准制定的气相色谱法[烟草及烟草制品菌核净 农药残留量的测定气相色谱法.中华人民共和国烟草行业标准.YC/T218-2007]。 Liu等[Liu H C，Li Q W，Tang L B.Capillary gas chromatographic determination of  dimethachlon residues in fresh tobacco leaves and cut-tobacco.Zhejiang Univ.Sci.B， 2007，8(4)：272～276]报道了菌核净在鲜烟叶和烟丝中的气相色谱法检测方法，检 测线性范围为0.01～0.1mg/kg。刘蓉蓉等采用菌核净-2-戊二酸半酯为半抗原，制 备了菌核净多克隆抗体，并采用酶联免疫吸附方法(ELISA)检测烟草中菌核净 残留[刘蓉蓉，刘贤金，刘媛，方敦煌，胡秋辉.菌核净残留免疫分析半抗原的 制备和鉴定.食品科学，2007，2：223-226][刘蓉蓉.菌核净的免疫检测技术研究，南 京：南京农业大学硕士学位论文，2007]，抗体的抑制终浓度I₅₀为2830μg/L，检 测灵敏度偏低。

时间分辨荧光免疫分析是20世纪80年代发展起来的非放射型免疫分析方 法，它采用稀土族元素作为标记物，克服了ELISA的稳定性差的缺点，也避免 了放射性免疫分析(RIA)的同位素污染等问题，具有灵敏度高、抗基质干扰能力 强、试剂稳定等优点。

建立菌核净农药高灵敏度检测的CI-TRFIA分析体系，并通过CI-TRFIA分 析体系检测烟草中菌核净残留，目前未报道。

发明内容：

本发明的目的在于：针对目前菌核净检测方法研究较少，且已报道的气相 色谱检测方法和酶联免疫检测方法灵敏度偏低的问题，本发明提供了一种菌核 净残留的时间分辨荧光免疫分析方法，并将其应用于烟草中菌核净残留检测， 开发了简便快速、无需样本净化的前处理方法。

本发明的目的是这样实现的：一种由CI-TRFIA检测体系检测烟草中菌核净 残留的方法，其特征在于：

所述的CI-TRFIA检测体系中，以菌核净-OVA作为包被抗原，以菌核净多 克隆抗体作为识别抗体，以Eu-N1标记的羊抗兔IgG作为二抗，建立与菌核净 农药对应的标准抑制曲线，方法是：将菌核净-卵清蛋白OVA连接物作为包被抗 原固定于酶标板，再加入梯度稀释的菌核净标准品和菌核净多克隆抗体，让菌 核净标准品与包被抗原共同竞争结合抗体，再采用Eu-N1标记的羊抗兔IgG作 为二抗，通过时间分辨检测模式读数后，绘制菌核净时间分辨免疫分析的标准 抑制曲线，建立线性回归方程，计算抑制中浓度，确定最低检测限和线性检测 范围；

所述的检测烟草中菌核净残留是指：对烟草样品前处理后，通过CI-TRFIA 检测体系对其进行检测，判断与样品对应的烟草中菌核净残留量。

在本发明中：所述的Eu-N1标记的羊抗兔IgG是这样获得的：称取4mg Eu-N1，用350μL蒸馏水溶解，备用；将1mg亲和纯化后的羊抗兔IgG溶于150 μL蒸馏水，加入pH 9.8的15μL 0.5mol/L碳酸盐缓冲液，混合均匀后，将溶解 的Eu-N1与羊抗兔IgG混合，4℃静置过夜，次日将过夜的反应物装入截留分子 量为8000Da的透析袋中，对超纯水透析3天，截留物为Eu-N1标记的羊抗兔 IgG，于-20℃保存备用。

在本发明中：对烟草样品前处理是指：将烟草样品粉碎后，称取1g放入 100mL三角瓶中，加20mL丙酮混合均匀，180rpm振荡提取1小时，抽滤后浓 缩近干，再用10ml丙酮复溶残余物并定容，取100μL丙酮复溶物，用检测缓冲 液稀释10倍后，直接用于CI-TRFIA检测。

本发明采用了菌核净-OVA作为包被抗原、菌核净多克隆抗体作为识别抗体 和镧系元素螯合物Eu-N1标记的羊抗兔IgG作为二抗，建立了高灵敏度的菌核 净时间分辨荧光免疫分析方法，并将其应用于烟草中菌核净残留检测，开发了 简便快速、无需样本净化的前处理方法，为国内外首次报道。

本发明的优点在于：本发明采用了菌核净-OVA作为包被抗原、菌核净多克 隆抗体作为识别抗体和Eu-N1标记的羊抗兔IgG作为二抗，建立了高灵敏度的 菌核净时间分辨荧光免疫分析方法，并将其应用于烟草中菌核净残留检测，开 发了简便快速、无需样本净化的CI-TRFIA分析体系，它与传统的ELISA法相 比，具有检测信号高，抗基质干扰能力强等优点。本发明的抑制中浓度(I₅₀) 为32.00μg/L，最低检出限I₁₀为1.98μg/L，检测线性范围为3.97～128.76μg/L， 检测灵敏度明显优于现有报道的气相色谱检测方法和ELISA检测方法。

本发明的优点还在于：在烟草样品的前处理过程中，无需样品净化，用丙 酮提取，再经过检测缓冲液稀释后，直接用于时间分辨荧光免疫分析方法检测。 检测时间为165min，检测通量可达20～30样/板(以96孔，1个样做3个重复 计算)，样品中菌核净的最低实际检出浓度为1mg/L，在大量烟叶样品中菌核净 残留的快速筛查检测，具有较高的应用前景。

附图说明

图1a菌核净CI-TRFIA分析的标准抑制曲线。

图1b菌核净CI-TRFIA分析的线性回归方程。

图2是不同浓度烟叶基质对菌核净CI-TRFIA分析体系的影响。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步的描述。

实施例1.Eu-N1标记的羊抗兔IgG制备

称取4mg Eu-N1(芬兰Wallac公司提供)，用350μL蒸馏水溶解，备用。将1 mg亲和纯化后的羊抗兔IgG(武汉博士德公司提供)溶于150μL蒸馏水，加入15 μL 0.5mol/L碳酸盐缓冲液(pH 9.8)，混合均匀后，将溶解的Eu-N1与羊抗兔IgG 混合，4℃静置过夜。次日反应物装入透析袋中(截留分子量：8000)，透析3天， 截留物分装后于-20℃保存备用。

实施例2.CI-TRFIA(Competitive indirect time-resolved fluorescence  immunoassay)的建立

用洗涤缓冲液预洗酶标板1次，加入100μL终浓度为6.9mg/L，检测缓冲液 (无锡市江原实业技贸总公司)稀释的菌核净-OVA(实验室自制)，室温下以700 r/min振荡孵育30min后，洗涤缓冲液(无锡市江原实业技贸总公司)洗板4次； 在孔板中加入50μL稀释2000倍的菌核净多克隆抗体(实验室自制)及50μL不 同浓度的菌核净标准液，室温下以700r/min振荡孵育1h后，洗板4次；再加入100 μL稀释1000倍的Eu-N1标记的羊抗兔IgG，室温下以700r/min振荡孵育1h后， 洗板4次；每孔加入荧光增强液(无锡市江原实业技贸总公司)100μL，700r/min 振荡15min，用多功能微孔板分析仪(德国Bethold LB940多功能微孔板分析仪) 的时间分辨荧光检测模式读数。

如图1所示，采用了CI-TRFIA法建立了菌核净农药的标准抑制曲线。线性 回归方程为I＝33.08logC+0.20(R²＝0.97)，其中，I为抑制率，C为样本浓度 (μg/L)。计算得到方法的检出限I₁₀为1.98μg/L，抑制终浓度I₅₀为32.00μg/L， 检测线性范围(I₂₀～I₇₀)在3.97～128.76μg/L。

实施例3.烟叶基质对时间分辨荧光检测体系的影响研究

考虑到免疫学检测方法主要用于大量样本的快速筛查，所采用的样品前处 理方法通常不采用复杂的样本净化步骤，而是对样本进行简单提取后，再进行 稀释，减小或去除样本基质对检测的干扰。但是样本稀释又会导致检测方法的 实际灵敏度的降低。本实验通过研究烟叶在经丙酮提取后，不同浓度的基质对 CI-TRFIA分析体系(线性范围内)的影响，确定了烟叶样品前处理后对检测方 法所需的稀释倍数。

具体步骤如下：

称取3组1g烟叶(每组8份)，放入100mL三角瓶中，分别添加1mL稀释2倍 的菌核净标样(丙酮溶解)，充分混匀，避光静置2h；加20mL丙酮，180rpm振荡 提取1h，抽滤后旋转浓缩近干；3组残余物分别用0.3、1.0和10mL丙酮溶解，再用 检测缓冲液稀释10倍，直接用于CI-TRFIA检测。

由于烟叶的成分复杂，内源性物质对以“抗原-抗体”结合为基础的CI-TRFIA 检测反映体系干扰较大。由图2所示，33％烟叶基质对检测体系干扰严重，抗体 几乎完全失去识别能力；10％烟叶基质存在时，菌核净的抑制曲线与标准抑制曲 线相比斜率明显降低，曲线的平行性较差；1％烟叶基质存在时，曲线的平行性 较好，可以通过基质影响因子(I_m)对检测结果进行矫正，因此确定烟叶样品前 处理的稀释倍数为100倍。计算得到的1％烟叶基质的基质影响因子为17.1。

菌核净基质影响因子计算公式：I_m＝[(B₀-B_m0)/B₀]×100

式中：B₀-TRFIA检测方法中，0％烟叶基质中(标准抑制曲线)，零浓度的 菌核净对应的荧光值。Bm0-TRFIA检测方法中，1％烟叶基质中，零浓度的菌 核净对应的荧光值。

实施例4.烟草中菌核净CI-TRFIA的添加回收实验

为考察本发明所建立的烟草中菌核净CI-TRFIA分析方法的精密度和重现 性，进行了烟草的添加回收实验。具体步骤如下：

在CI-TRFIA检测的线性范围内，连续3天对空白烟叶样本进行1、7和24 mg/L的3个水平的添加(由于样品在前处理中稀释了100倍，且在CI-TRFIA 加样时与等体积的抗体混合，因此菌核净在CI-TRFIA检测体系中的终浓度分别 为5、35和120μg/L)。1g烟叶样品经过20ml丙酮提取后，浓缩近干再用10ml 丙酮复溶残余物并定溶。取100ul丙酮定容物，用检测缓冲液稀释10倍后用于 检测，检测结果经过基质影响因子进行矫正。

样品中菌核净浓度的实际浓度的折算公式：C_x＝C_d[(100-I_m)/100]

式中：C_x-样品中菌核净的实际浓度，C_d-样品中菌核净的计算浓度。

如表1所示，连续3天的样品的总添加回收率为73％～128％，变异系数(CV) 在4.3～13.2之间。添加回收实验表明，该方法可以用于烟草中菌核净农药的快速 筛选检测。

表1烟叶中菌核净农药的CI-TRFIA检测方法的添加回收率和变异系数

以上实施例不是对本发明的具体限制。