一种快速鉴定菊花真菌病害病原菌种类的方法

摘要

本发明属于植物病原菌的分子生物学检测领域，公开了一种快速鉴定菊花真菌病害病原菌种类的方法。该方法包括：(1)植物病样制备；(2)聚合酶链式反应(PCR)、电泳检测及片段纯化；(3)测序及结果比对确定病原菌种类。本方法突破了传统的植物真菌病害鉴定周期长、专业性强等局限性，提供的检测方法可在6小时内即可完成检测与鉴定菊花真菌病害，检测广谱性强，灵敏度高，工序简单。

说明书

技术领域

本发明属于植物病原菌的分子生物学检测领域，涉及一种快速鉴定菊花真菌病害病原菌种 类的方法

背景技术

菊花(Dendranthema morifolium Tzvel.(Chrysanthemum morifolium Ramat.))为 菊科菊属多年生宿根草本植物，是我国十大传统名花，世界上最早栽培的观赏植物之一，具有 很高的经济和观赏价值，在花卉产业中占据重要的地位。菊花在移栽、扦插、以及种植过程中 易感染真菌病害，其中以菊花黑斑病和枯萎病最为普遍，本专利将以这两种菊花真菌病害为例。 菊花黑斑病症状为：发病初，叶片出现大小不等的浅黄和褐色斑，逐渐发展成边缘黑褐色、中 间灰黑色的近圆形不规则斑块，后期病斑上长出黑色小点，严重时病斑相连，叶片发黑焦枯乃 至脱落，病株从下部叶片开始顺次向上枯死至全株。菊花枯萎病症状为：发病初时叶色变浅发 黄，萎蔫下垂，茎部、枝条、根部逐渐变成淡褐色直至变黑腐烂坏死，湿度大时病部产生白霉。

以往检测植物真菌病害病原菌主要有形态学观察法、酶联免疫法、基因芯片法、质谱技术 等。常规直接或培养后镜检的形态学鉴定来发现和确认病原菌，其操作繁琐、费时、并且需要 高度的专业知识。尤其对于那些生长条件特殊、形态相似的菌株要通过传统的表型特征鉴定方 法来加以鉴别显得非常困难，许多时候只能鉴定到属这一级别。酶联免疫法在国外已经形成商 品化生产，但是每种病原菌都需要特异的酶标记抗体，标记过程比较复杂，价格比较昂贵，且 存在假阴性和假阳性问题。基因芯片技术虽然能够同时进行多种真菌的鉴定，但只局限于已知 的常见病原真菌，对非常见菌、突变菌或者新菌种则无能为力，且成本过高。质谱技术在微生 物鉴定中具有快速准确的优点，但由于质谱鉴定必须是纯化培养的单克隆菌落，操作复杂且所 需的专业技术要求较高，设备购置和维护费高昂。

随着分子生物学手段的发展与应用，利用真菌核糖体DNA上的内部转录间隔区(ITS)进 行真菌种类鉴定已经得到广泛认可。但现有方法利用ITS序列对病原真菌进行鉴定前，须先经 过纯菌株的分离纯化，真菌DNA的提取，PCR扩增以及亚克隆等一系列繁琐的过程。这种方 法存在如下缺点：(1)至少需要7天时间，费时费力；(2)对目前无法培养或难培养的真菌 很难进一步鉴定和分析；(3)分离和培养单胞存在较高的技术难度；(4)繁琐的真菌DNA提 取步骤；(5)PCR扩增片段需要经过连接、转化、质粒提取等步骤后才能测序。这些缺点极 大地限制了田间病原菌的快速鉴定，贻误了病情。目前，大量的真菌病害导致了菊花观赏品质 下降，造成了巨大的经济损失。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种快速鉴定菊花真菌病害病原菌种类的方法，能够快速 鉴定菊花真菌病害的病原菌种类。

技术方案：为实现上述目的，本发明的快速鉴定菊花真菌病害病原菌种类的方法，包括如 下步骤：

(1)植物病样制备：用蒸馏水冲洗干净待检病样品(叶片、茎或根部)，从其中取一块 5mm×5mm左右大小的病害组织，置于2ml离心管中，加入无菌水200μl，剧烈震荡10s， 其溶液作为步骤(2)PCR反应中的模板；

(2)PCR、电泳检测、片段纯化及测序：取步骤(1)离心管中的溶液作为模板，进行 PCR反应，引物分别为：ITS-F：5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAG-3’(SEQ ID NO.1)， ITS-R：5’-TCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTC-3’(SEQ ID NO.2)；PCR反应后将产物进 行琼脂糖凝胶电泳，确认扩增条带后，采用Biospin Gel Extraction kit(BioFlux)试剂盒进 行切胶纯化回收，将回收产物上ABI PRISM 3730XL DNA Analyzer测序仪测序，测序引物分 别为：SEQ-F：5’-GTCATTTAGAGGAAGTAAAAG-3’(SEQ ID NO.3)，SEQ-R：5’- GCTTATTGATATGCTTAAGTTC-3’(SEQ ID NO.4)；

(3)测序结果比对确定病原菌种类：将测序结果在美国国立生物技术信息中心(NCBI) 上进行BLAST比对，从而确定导致菊花真菌病害的病原菌种类。

步骤(2)所述PCR反应体系50μl中包括25μl 2×MightAmp Buffer Ver.2，1μl MightAmp DNA Polymerase(TaKaRa)，1μl上游引物ITS-F，1μl下游引物ITS-R，1μl步骤 (1)离心管中的溶液作为模板，加灭菌水补足至50μl。

步骤(2)所述PCR反应设定为98℃预变性2min，98℃变性10s，55℃退火30s，72℃ 延伸1min，循环30～35次，72℃延伸7min。

步骤(3)所述的测序结果比对确定病原菌种类为：将测序结果在NCBI上进行BLAST比 对，与所测序列最接近的且相似率达98％以上的即为导致该菊花真菌病害的病原菌种类。

有益效果：本发明通过比对真菌和菊花ITS序列，设计了只能扩增出真菌ITS序列的引物， 采用极高PCR反应性能的MightyAmp DNA Polymerase扩增菊花病原真菌的ITS序列，产 物纯化后直接测序，通过BLAST在线比对，能在较短时间内对其进行分类和鉴定。相对于之 前的PCR鉴定植物病原真菌的方法(至少需要7天时间)，省去了纯菌株的分离纯化、真菌 DNA的提取以及亚克隆等繁琐过程，减少了技术难度，省力省时，还能鉴定出不可培养或难 培养的真菌，大大提高了鉴定的效率和范围。

本发明提供了一种快速鉴定菊花真菌病害病原菌种类的方法，能在6小时内鉴定出病原菌 种类，为有针对性地开展菊花真菌病害的防治，及时解决菊花的真菌病害问题提供了强有力的 技术支持，推动菊花产业的发展。

附图说明

图1为实施例1中病叶样本图

图2为实施例2中病根样本图

图3为实施例1中PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图

图4为实施例2中PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图

图5本发明快速鉴定菊花真菌病害病原菌种类的方法流程图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

实施例1

取田间表现叶片发黄、发黑的菊花植株为材料(如图1所示)，将病叶用蒸馏水冲洗干净， 从其中取一块5mm×5mm左右大小的病害组织，置于2ml离心管中，加入无菌水200μl，剧 烈震荡10s，其溶液作为下一步PCR反应中的模板；

PCR反应所用上下游引物分别为：

ITS-F：5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAG-3’(SEQ ID NO.1)，

ITS-R：5’-TCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTC-3’(SEQ ID NO.2)。

PCR反应体系50μl中包括25μl 2×MightAmp Buffer Ver.2，1μl MightAmp DNA Polymerase(TaKaRa)，1μl上游引物ITS-F，1μl下游引物ITS-R，1μl步骤(1)离心管中的 溶液作为模板，加灭菌水补足至50μl。PCR反应设定为98℃预变性2min，98℃变性10s， 55℃退火30s，72℃延伸1min，循环30～35次，72℃延伸7min。

PCR反应后将产物进行琼脂糖凝胶电泳，确认扩增条带后(如图3所示)，采用Biospin Gel Extraction kit(BioFlux)试剂盒进行切胶纯化回收。将回收产物上ABI PRISM 3730XL DNA Analyzer测序仪测序，测序引物分别为：SEQ-F，SEQ-R；

SEQ-F：5’-GTCATTTAGAGGAAGTAAAAG-3’(SEQ ID NO.3)，

SEQ-R：5’-GCTTATTGATATGCTTAAGTTC-3’(SEQ ID NO.4)。

将测序结果在NCBI上进行BLAST比对，与所测序列最接近的且相似率达98％以上的为 链格孢Alternaria alternata，说明导致该田间菊花黑斑病的病原菌为链格孢A/ternaria alternata。

实施例2

取田间表现叶色变浅发黄，萎蔫下垂，茎部、枝条、根部逐渐变成淡褐色的菊花植株为材 料(如图2所示)，将根茎部用蒸馏水冲洗干净，从其中取一块5mm×5mm左右大小的病害 组织，置于2ml离心管中，加入无菌水200μl，剧烈震荡10s，其溶液作为下一步PCR反应 中的模板；

PCR反应所用上下游引物分别为：

ITS-F：5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAG-3’(SEQ ID NO.1)，

ITS-R：5’-TCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTC-3’(SEQ ID NO.2)。

PCR反应体系50μl中包括25μl 2×MightAmp Buffer Ver.2，1μl MightAmp DNA Polymerase(TaKaRa)，1μl上游引物ITS-F，1μl下游引物ITS-R，1μl步骤(1)离心管中的 溶液作为模板，加灭菌水补足至50μl。PCR反应设定为98℃预变性2min，98℃变性10s， 55℃退火30s，72℃延伸1min，循环30～35次，72℃延伸7min。

PCR反应后将产物进行琼脂糖凝胶电泳，确认扩增条带后(如图4所示)，采用Biospin Gel Extraction kit(BioFlux)试剂盒进行切胶纯化回收。将回收产物上ABI PRISM 3730XL DNA Analyzer测序仪测序，测序引物分别为：SEQ-F，SEQ-R；

SEQ-F：5’-GTCATTTAGAGGAAGTAAAAG-3’(SEQ ID NO.3)，

SEQ-R：5’-GCTTATTGATATGCTTAAGTTC-3’(SEQ ID NO.4)。

将测序结果在NCBI上进行BLAST比对，与所测序列最接近的且相似率达98％以上的为尖孢 镰刀菌Fusarium oxysporum，说明导致该田间菊花枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum。