干酪乳杆菌LC2W在制备Alpha-糖苷酶抑制剂中的用途

摘要

本发明公开了干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC2W菌株(CGMCCNO.0828)在制备麦芽糖酶抑制剂、α-葡萄糖苷酶抑制剂的用途。以乳为生长介质、采用该菌发酵制备α-糖苷酶抑制剂，其对麦芽糖酶抑制率可达到58至88％，可作为生产具有抑制α-葡萄糖苷酶活性、控制餐后血糖波动饮料、膳食补充剂的功能配料使用。

说明书

技术领域

本发明属于发酵乳微生物用途领域，特别涉及干酪乳杆菌LC2W在制备 Alpha-糖苷酶抑制剂中的用途。

背景技术

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一组以长期葡萄糖(简称血糖)水平 增高为特征的代谢疾病群，是由遗传因素与环境因素共同作用引起的一种慢 性高血糖态。近年来，糖尿病在全世界广泛流行，目前已成为继肿瘤、心血 管疾病之后第三类严重危害人类健康的慢性疾病。据国际糖尿病联合会 (IDF)2007年最新公布的数字，目前全球糖尿病患者为2.46亿人，到2025 年这一数字预计将增至3.8亿。2009年糖尿病国际论坛首次公布了我国最新 的大中城市糖尿病患病率调查结果，城市患病率已高达9.7％。糖尿病已成 为严重危害我国大众健康的公共卫生问题，对社会经济发展产生越来越严重 的影响。

目前，糖尿病的发病原因尚未完全明了，缺乏根治的医疗措施，患者需 要长期甚至终身服药，因此抗糖尿病药物在控制血糖的同时，不可避免地会 出现一定程度的药物不良反应(adverse drug reaction，ADRS)，有些反应较严 甚至引起死亡，降血糖药物的安全性就成为着重考虑的问题之一。目前，常 用口服降糖药物的优缺点见表1。

表1.常用口服降糖药的优缺点比较

“欧洲糖尿病诊断协作研究”(Diabetes Epidemiology：Collabora tive  Analysis of Diagnostic Criteria in Europe，DECODE)指出，餐后高血糖与糖尿 病大血管并发症关系密切。为了减少或延迟糖尿病大血管并发症的发生和发 展，除严格控制空腹血糖水平外，控制餐后血糖的急剧波动更为重要。其中， 控制进食后碳水化合物的吸收是一种降低餐后高血糖的治疗方法。研究表 明，如果食用者饮食中碳水化合物占50％以上，则α-葡萄糖苷酶抑制剂的 降糖效果更为明显，因此其适用于以碳水化合物为主食的人群，尤其是中老 年糖尿病患者。

目前食品中的α-葡萄糖苷酶抑制剂主要分离自中草药等植物，主要包 括以下几种类型：多糖类，异黄酮和皂甙类，生物碱，多酚类。国内目前对 α-葡萄糖苷酶抑制剂的研究起步较晚，由于受技术和成本限制，大多是从 中草药，如苷草、茶叶、桑、虎杖和五味子中筛选，也有少数研究尝试从新 型微生物的次级代谢产物中提取，但有关其活性成分的报道不多。目前从天 然产物中分离和提取的α-葡萄糖苷酶抑制剂主要来自草本植物和放线菌 属，只有少数关于乳酸菌产物降血糖的报道。

α-葡萄糖苷酶抑制剂的靶向酶包括α-淀粉酶、麦芽糖酶和蔗糖酶等。 目前已知的α-葡萄糖苷酶抑制剂的副作用是由于其抑制了多糖的水解而引 起的胀气、腹泻、腹部痉挛等，尤其是以抑制α-淀粉酶为主的葡萄糖苷酶 抑制剂，其副作用更为明显，而以抑制麦芽糖酶、蔗糖酶等双糖酶为主的α -葡萄糖苷酶抑制剂所引起的胃肠道紊乱的副作用则小得多。国内外对α-葡 萄糖苷酶抑制剂的筛选，主要针对一些植物中草药或放线菌的次级代谢产 物，关于利用乳酸菌发酵的方法制备α-葡萄糖苷酶抑制剂尚未见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题就是目前的α-葡萄糖苷酶抑制剂副作用明 显，提供一种新的α-葡萄糖苷酶抑制剂，其以麦芽糖酶(EC：3.2.1.20)为 靶向酶，胃肠道紊乱副作用较小。

本发明的技术方案如下：

干酪乳杆菌LC2W(Lactobacillus caseiLC2W)在制备麦芽糖酶抑制剂 中的用途。

本发明中，干酪乳杆菌LC2W是现有技术，是已经公开的菌株，其菌种 保藏号：CGMCC NO.0828。

干酪乳杆菌LC2W(Lactobacillus casei LC2W)在制备Alpha-糖苷酶抑 制剂中的用途。

干酪乳杆菌LC2W(Lactobacillus casei LC2W)在制备可减缓碳水化合 物在肠道吸收作用的乳制品中的用途。所述的乳制品用于作为糖尿病治疗的 辅助手段，或者用于控制餐后血糖波动。所述的乳制品优选发酵乳或者乳酸 菌饮料。

一种由干酪乳杆菌LC2W(Lactobacillus caseiLC2W)制备Alpha-糖苷 酶抑制剂的方法，包括以下步骤：干酪乳杆菌LC2W发酵液加热灭活，调整 pH到4.2-4.8，较合适的是pH 4.6，固液分离获得上清液；调整上清液的pH 到6.2-7.0，较合适的是pH 6.8，进行醇提。

其中，所述的醇提的方法是常规的加入醇类除去沉淀物的方法，所得的 上清液即为Alpha-糖苷酶抑制剂提取物。常规的加入醇类进行醇提的方法 中，一般是加入乙醇。本发明的优选乙醇，更优选95％(v/v)乙醇。较佳 的将上清液浓缩至原体积的1/5至1/3，加入2-3倍体积的95％(v/v)乙醇， 0-6℃放置24h后，固液分离获得上清液，上清减压浓缩去除乙醇后，获得 Alpha-糖苷酶抑制剂粗浓缩物。该浓缩物对麦芽糖酶抑制率可达到58至 88％。其中，固液分离的方法是常规的，较佳的是离心或过滤。

其中，所述的干酪乳杆菌LC2W发酵液是干酪乳杆菌LC2W在灭菌乳 中发酵而得的。所述的灭菌乳优选脱脂乳。发酵的方法是常规方法，本发明 优选的发酵条件如下：发酵温度可以是30-40℃，优选35-37℃，更优选35℃； 脱脂乳浓度可以是2-12％，优选8％-12％，更优选10％；发酵时间可以是 24-120小时，优选72-96小时，更优选96小时；接种量可以是1％-5％，优 选2％-5％，更优选3％；发酵过程的pH值可以是自然pH值，也可以控制在 pH5.5-7.0，优选pH6.0-7.0，更优选pH6.5。

一种干酪乳杆菌LC2W(Lactobacillus casei LC2W)的发酵方法，包括 将干酪乳杆菌LC2W在培养基中发酵，其中，所述的培养基是灭菌乳，优选 灭菌脱脂乳。发酵温度可以是30-40℃，优选35-37℃，更优选35℃。灭菌 乳浓度可以是2-12％，优选8％-12％，更优选10％。发酵时间可以是24-120 小时，优选72-96小时，更优选96小时。接种量可以是1％-5％，优选2％-5％， 更优选3％。发酵过程的pH值可以是自然pH值，也可以控制在pH5.5-7.0， 优选pH6.0-7.0，更优选pH6.5。

本发明还提供所述的Alpha-糖苷酶抑制剂在食品、保健品或者药品中的 用途。所述的食品、保健品或者药品具有抑制α-葡萄糖苷酶活性，可以用 于控制餐后血糖波动。所述的Alpha-糖苷酶抑制剂可作为饮料、膳食补充剂 的功能配料使用。

本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

相比于现有技术，本发明的有益效果如下：本发明提供了干酪乳杆菌 LC2W(Lactobacillus casei，LC2W)菌株(CGMCC NO.0828)在制备麦芽糖 酶抑制剂和α-葡萄糖苷酶抑制剂的用途。以乳为生长介质、采用该菌发酵制 备α-糖苷酶抑制剂，其对麦芽糖酶抑制率可达到58至88％，可作为生产具 有抑制α-葡萄糖苷酶活性、控制餐后血糖波动饮料、膳食补充剂的功能配 料使用，用于糖尿病的辅助治疗手段。

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。

图1显示相关乳酸菌脱脂乳发酵产物麦芽糖酶抑制率。

图2显示11株干酪乳杆菌脱脂乳发酵产物麦芽糖酶体外抑制活性。

具体实施方式

α-葡萄糖苷酶抑制剂的靶向酶包括α-淀粉酶、麦芽糖酶和蔗糖酶等。 本发明以麦芽糖酶(EC：3.2.1.20)为靶向酶，从不同来源的乳酸菌中筛选出 对麦芽糖酶(EC：3.2.1.20)具有抑制作用的菌株干酪乳杆菌LC2W，并确定 了以乳为发酵基质、制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法。

本发明采用一种特定的体外筛选模型，比较了分离自健康人体肠道、相 关商业化酸奶菌种、乳酸菌对麦芽糖酶的抑制作用，发现干酪乳杆菌LC2W 具有强烈抑制麦芽糖酶的活性，因此利用该菌株制备α-葡萄糖苷酶抑制剂。

本发明选取多个菌株，用这些菌株分别发酵脱脂乳，对发酵产物进行处 理后得待测样品，用以体外测定麦芽糖酶抑制率。

本发明中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25℃。

脱脂乳发酵方法

菌株的活化从-80℃深冷冰箱中取出保藏之菌株，室温解冻。在无菌 条件下，取少许冻干菌粉用1mL无菌生理盐水(0.85％NaCl溶液)溶解后， 接种环蘸取少许，在MRS(Merck，Germany)平板上划线分离，37℃厌氧 培养48h(N₂∶H₂∶CO₂＝85∶10∶5)，连续活化2次；

种子的制备10％(w/w)脱脂乳，118℃灭菌15min。从新鲜培养的 MRS平板上挑取少量的菌苔，转接到1mL 10％(w/w)无菌脱脂乳中，37℃ 静置培养24h，再按2％(v/v)的接种量在10％(w/w)无菌脱脂乳进一步 扩大培养至10mL；

发酵脱脂乳的制备：按2％(v/v)的接种量将种子转接到10％(w/w) 无菌脱脂乳中(每250mL三角瓶装料100mL)，37℃静置培养72h。

发酵脱脂乳待测样品的制备

待发酵完毕，将发酵样品于沸水浴加热5分钟，待冷却至室温后，于4℃ 10000rpm离心15min，取上清液。上清液用1mol/L NaOH调pH值至6.8， 室温静置30min，再以4℃10000rpm离心15min，取上清液，用0.22μm 滤膜过滤去除杂质及菌体，作为待测样品备用，用以体外测定麦芽糖酶抑制 率。

体外测定麦芽糖酶抑制率

底物配制称取0.3603g麦芽糖(GCS，纯度≥99.5％)溶于100mL水， 得10mmol/L麦芽糖液；

麦芽糖酶的配制因批次不同，单位质量酶活力稍有区别，根据生产厂 家标称的酶活力，采用超纯水配制成10U/mL麦芽糖酶，-80℃保藏备用；

酶反应在1.5mL Eppendorf管中依次加入H₂O 200μL，酶200μL，上 述方法制备所得的待测样品500μL，麦芽糖100μL，于37℃水浴保温30min。 反应完毕后，立即置于100℃沸水浴5min。待冷却至室温后，4℃20000rpm 离心2min，静置待测(其中，空白对照以H₂O代替待测液)；

测定吸取上述上清液20μL于780μL葡萄糖测定工作液(葡萄糖氧化 酶法测定用试剂盒)中，37℃水浴保温20min，550nm下测定OD值(A)。 其中，空白对照测定所得OD值为B。

麦芽糖酶抑制率(％)计算公式：Maltase inhibitory rate(％) ＝[(B-A)/B]×100％

被测试菌株及其产物对麦芽糖酶抑制率结果

本发明首先选取了分离自健康人体肠道的干酪乳杆菌JH28(吴彬彬等， 一株具有抑制麦芽糖酶活性的乳酸菌的筛选与鉴定，食品工业科技，2010 年11期，175-177)、某商业化菌株干酪乳杆菌Y(从市售养乐多产品中分离 得到，是其中唯一的活性益生菌成分)，购自跨国菌种供应商丹尼斯克公司 的广泛用于酸奶的保加利亚乳杆菌LB340、Lb64，嗜酸乳杆菌TA40、TA45， 嗜热链球菌TH4、及乳酸菌干酪乳杆菌LC2W(CGMCC NO.0828)、鼠李糖 乳杆菌YHOC137(黄文利等，几株产胞外多糖乳酸菌生物学性质的研究， 乳业科学与技术，2007年01期，18-20)、干酪乳杆菌WPC 09(陈帅等，干 酪乳杆菌WPC09对β-乳球蛋白抗原性降低的研究，乳业科学与技术，2010 年06期，251-253)为目标菌群。以上菌株均能单独在脱脂乳中生长且凝乳。 按照所述的方法，上述被测试菌株在脱脂乳中生长72h及96h后，其产物 对麦芽糖酶抑制率结果见图1。从图1可见，从市售酸奶产品中分离的嗜酸 乳杆菌如TA40、TA45，保加利亚乳杆菌LB340、Lb64，嗜热链球菌TH4 的脱脂乳发酵产物均无麦芽糖酶抑制活性。而干酪乳杆菌LC2W、Y、JH28、 WPC 09均有不同程度的麦芽糖酶抑制活性。

鉴于上述结果，本发明又收集了14株国内外广泛应用的及本实验室保 存的干酪乳杆菌相关菌株，分别测定其在脱脂乳中的生长性能及发酵产物对 麦芽糖酶的抑制活性。14株供试干酪乳杆菌经过活化后，按照所述的方法接 种于10％(w/w)无菌脱脂乳中，37℃静置培养24h后，测定pH值，观察 凝乳状况，结果见表2。从表2可见，干酪乳杆菌ZHANG(CGMCCNO.1697)、 LP33、JH23发酵24h未观察到凝乳现象，其余11株干酪乳杆菌均表现出不 同程度的凝乳现象。

表2.14株干酪乳杆菌脱脂乳中的发酵性能

++凝固，且凝乳质地均匀细致，凝块结实，无乳清析出；+有乳清析出；--24h内未凝乳。

其中，LC01、LC431购自汉森公司；

NJ，购自常州益菌加生物科技有限公司；

LC11、LPC37购自丹尼斯克公司；

ATCC334、ATCC393为干酪乳杆菌标准菌株；

LP33由景岳生物科技(股)公司(台湾)提供；

JH23(王豪，一株具有抑制单胺氧化酶作用的干酪乳杆菌筛选，微生物 学报，2010年02期，197-203)；

BD-2为光明乳业专利菌株CGMCCNO.0849；

Zhang(CGMCCNO.1697)。

本发明又对上述11株干酪乳杆菌进行脱脂乳发酵，分别测定发酵48h、 96h的麦芽糖酶抑制活性，如图2。可见，其中干酪乳杆菌LC01、LC431、 LC2W及Y较其他菌株具有更显著的麦芽糖酶抑制活性。

因此，本发明对具有较强体外麦芽糖酶抑制活性的4株干酪乳杆菌菌株 进一步确认。干酪乳杆菌LC2W发酵48h、96h 10％(w/w)无菌脱脂乳发 酵产物的麦芽糖酶抑制活性均高于其他菌株，发酵96h达到36.57％。

干酪乳杆菌LC2W发酵条件

本发明进一步测定不同温度下以干酪乳杆菌LC2W发酵10％脱脂乳的 产物的麦芽糖酶抑制活性。25℃、30℃、35℃、40℃下分别发酵72h，其产 物的体外麦芽糖酶抑制率分别为27.65％、32.28％、35.24％及34.78％。其中， 35℃下发酵产物的麦芽糖酶抑制活性最高。

本发明进一步测定不同脱脂乳浓度下，35℃干酪乳杆菌LC2W发酵产物 对麦芽糖酶的抑制活性。以2％，4％，6％，8％，10％，12％的脱脂乳浓度分 别发酵72h，其产物的体外麦芽糖酶抑制率分别为18.70％，21.34％，25.98％， 29.56％，34.68％，35.12％。其中，10％脱脂乳浓度下发酵产物的对麦芽糖酶 抑制活性最高。

本发明进一步测定不同发酵时间下，35℃干酪乳杆菌LC2W发酵10％ 脱脂乳产物的麦芽糖酶抑制活性。测定发酵24h，48h，72h，96h，120h 所得的发酵产物中的麦芽糖酶抑制率，分别为25.02％，31.95％，36.17％， 37.34％，36.64％。其中，发酵96h产物中麦芽糖酶抑制率达到最高。

本发明进一步测定35℃干酪乳杆菌LC2W以不同接种量接种于10％脱 脂乳发酵96h产物的麦芽糖酶抑制活性。1％，2％，3％，5％接种量所得的 发酵产物中，麦芽糖酶抑制率分别为32.38％，35.56％，38.28％，37.96％。

本发明进一步测试了在自然pH条件下(不控制发酵过程的pH值)以 及在发酵过程中通过流加5M Na₂CO₃使发酵过程的pH值恒定在5.5、6.0、 6.5、7.0时，在35℃干酪乳杆菌LC2W按5％接种量发酵10％(w/w)无菌 脱脂乳96h所获得的产物对麦芽糖酶抑制率分别30.15％，39.08，42.21％， 36.75％。

制备Alpha-糖苷酶抑制剂

如上所述的方法，经过干酪乳杆菌LC2W发酵后的脱脂乳在加热灭活 后，冷却至室温，通过加入酸(如盐酸、柠檬酸、乳酸)的方式，将发酵物 的pH调整到4.2-4.8，其中较合适的是pH 4.6，通过离心或者过滤的方式获 得上清液，上清液通过加碱(如NaOH、NaHCO₃、Na₂CO₃等)将上清的pH 调整到6.2-7.0，其中较合适的是pH 6.8，然后减压浓缩至原来体积的1/5至 1/3，加入2-3倍体积的95％(v/v)乙醇，0-6℃放置24h后，通过离心或过 滤方式获得上清液，上清减压浓缩去除乙醇后，获得Alpha-糖苷酶抑制剂粗 浓缩物，根据浓缩程度不同，按照所述的测试方法，其对麦芽糖酶抑制率可 达到58至88％，可作为生产具有抑制α-葡萄糖苷酶活性、控制餐后血糖波 动饮料、膳食补充剂的功能配料使用。

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施 例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建 议的条件。本实施例中菌株的活化、种子的制备和发酵产物麦芽糖酶抑制率 的测定方法同上所述。

实施例1干酪乳杆菌LC2W无添加发酵乳

新鲜牛乳30℃30Mpa下均质，70℃杀菌30min后冷却到25℃，接种 干酪乳杆菌LC2W，接种量为3％(v/v)，37℃发酵24h，冷却至10℃，装 瓶。

发酵乳指标：干酪乳杆菌LC2W 2.3×10⁹CFU/mL，发酵产物对麦芽糖 酶抑制率25.42％。

实施例2干酪乳杆菌LC2W乳酸菌饮料

全脂新鲜牛乳预热40℃，分离得到脱脂鲜乳，85℃灭菌10min，降温 至25℃；以3％(v/v)的接种量接种干酪乳杆菌LC2W，37℃发酵72h。三 氯蔗糖溶解，并于95℃灭菌10min，将发酵液与水以1∶1.5混合均匀，并 加入三氯蔗糖及单甘油脂肪酸酯，使两者的终浓度分别为0.06‰及1.8‰， 均质，冷却至10℃，无菌灌装。乳酸菌饮料指标：干酪乳杆菌LC2W 4.5×10⁷CFU/mL，发酵产物麦芽糖酶抑制率28.56％。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发 明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。