一种降血清胆固醇马克斯克鲁维酵母冻干菌粉的制备方法

摘要

本发明涉及一种降血清胆固醇马克斯克鲁维酵母冻干菌粉的制备方法，适用于降血清胆固醇功能性益生菌制剂及发酵乳制品的生产。本发明利用筛选自藏灵菇的马克斯克鲁维酵母K1和M3两株降血清胆固醇的菌种，经过活化和扩大培养、发酵、离心浓缩和加入冻干保护剂、预冻和冻干，制备冻干菌粉。本发明优化冻干保护剂组合配方，使菌种存活率达到65％以上，且冻干菌粉活菌数达到10

说明书

技术领域

本发明涉及降血清胆固醇马克斯克鲁维酵母冻干菌粉的制备方法，适用于 降血清胆固醇功能性益生菌制剂及发酵乳制品的生产。

背景技术

益生菌是指一类通过肠道定殖作用改善宿主特定部位微生态平衡并兼有若 干其他有益生理功能的微生物。它们通过改善肠道微生物生态平衡，控制肠道 感染，降低血清胆固醇水平，提高乳糖不耐症者对乳糖的利用，并能刺激特异 性或非特异性免疫反应，具有免疫增强的作用。益生菌制品的活菌应该代谢稳 定，活性较强，通过消化道后大量存活，进入肠道后发挥益生菌作用。目前用 于生产益生菌制剂的优良菌种有双歧杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、酵母属、 克鲁维酵母属等。

酵母菌包括乳糖发酵性和乳糖非发酵性二类。其中乳糖发酵性酵母有克鲁 维酵母属(如马克斯克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母、保加利亚 克鲁维酵母)、假丝酵母属(如乳酒假丝酵母)和酒香酵母属等，是制作发酵乳制 品和益生菌制剂的良好菌种。

早在1963年人们就证实摄取含有某种乳杆菌或者双歧杆菌发酵的酸奶具有 降低血清胆固醇含量的功效。迄今为止，国内外学者对乳酸菌降胆固醇作用机 理的研究尚存在不同观点，主要集中于以下三点：1.乳酸菌菌体细胞直接吸收 同化胆固醇；2.乳酸菌的胆盐水解酶活性使结合态胆盐降解为游离态胆盐，后 者溶解度下降与胆固醇发生共同沉淀作用；3.其他理论，如吸收同化与共沉淀 联合作用。

有关酵母菌的益生性也有文献报道。酵母菌作为益生菌的应用起源于饲料， 如Saccharomyces boulardii被用于不同类型痢疾的治疗。Psomas等(2003年)研 究了Saccharomyces boulardii具有降低胆固醇的功效。

本发明所用马克斯克鲁维酵母菌K1和M3作为益生菌，可在生长代谢过程 中产生大量高活力的胆盐水解酶，经过体外牛津杯试验和动物实验证明有降低 机体血清胆固醇含量的功效，其降血清胆固醇的作用机理与乳酸菌有相似之处。

目前，国内利用乳酸菌制备冻干菌粉专利较多，如中国农业大学李博等人 申请的“一种开菲尔冻干菌粉及其制备方法和应用”(CN1911118)是利用开菲尔 粒中一系列未分离鉴定菌种制备冻干菌粉；内蒙古农业大学张和平等人申请的 “干酪乳杆菌Zhang高密度培养方法、使用它们制备冻干菌粉的方法与所得到 的冻干菌粉及其用途”(CN101418270)是利用干酪乳杆菌Zhang制备冻干菌粉； 上海谱莱生物技术有限公司方曙光申请的“一种嗜酸乳杆菌冻干菌粉的制备方 法”(CN101486986)是利用嗜酸乳杆菌制备冻干菌粉；上海谱莱生物技术有限公 司方曙光申请的“一种双歧杆菌冻干菌粉的制备方法”(CN101486987)是利用双 歧杆菌制备冻干菌粉。但关于利用降血清胆固醇马克斯克鲁维酵母制备冻干菌 粉的方法未见国内外相关文献报道和专利报道。

发明内容

本发明的目的在于提供降血清胆固醇马克斯克鲁维酵母菌K1和M3冻干菌 粉的制备方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

所述方法中，马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)K1和M3菌株均 分离筛选自吉林省普通家庭的藏灵菇，并已于2006年9月11日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.1812(菌株 K1)和CGMCC No.1811(菌株M3)。

所述方法中，马克斯克鲁维酵母菌K1和M3在含有抗生素的马铃薯乳糖选 择性培养基上的菌落大小为3～4mm，表面光滑，边缘整齐，呈圆形，有光泽， 微隆起，乳白色，不透明；个体形态呈卵圆形或短椭圆形(K1菌株)、长椭圆形 或圆柱形(M3菌株)，不形成假菌丝；无性繁殖为多边芽殖，在马铃薯乳糖培养 基中生长出芽率较高，有性繁殖形成子囊孢子。马克斯克鲁维酵母菌K1和M3 作为益生菌，均可降低机体血清胆固醇含量。

所述方法中，马克斯克鲁维酵母菌K1和M3的活化培养基为马铃薯乳糖液体 培养基，其成分为：马铃薯200g，乳糖20g，蒸馏水1000mL。其制法为：将马铃 薯去皮切块，称取200g加入1000mL蒸馏水，煮沸15～20min，双层纱布过滤， 补加蒸馏水至1000mL，加入乳糖，搅拌溶化，分装，于115℃灭菌20min。

所述方法中，马克斯克鲁维酵母菌K1和M3的发酵培养基为改良马铃薯乳糖 液体培养基，其成分为：马铃薯200g，乳糖20g，酵母浸粉10g，蒸馏水1000mL。 其制法为：将马铃薯去皮切块，称取200g加入1000mL蒸馏水，煮沸15～20min， 双层纱布过滤，补加蒸馏水至1000mL，冷却至室温，调节pH6.0，加入乳糖和酵 母浸粉，搅拌溶化，分装，于115℃灭菌20min。

所述方法中，利用活化培养基，将保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心的马克斯克鲁维酵母菌K1和M3分别于接种量1％(V/V)，培养温 度28℃，培养时间21h的条件下进行活化，并在相同条件下进行扩大培养，得到 扩大培养液。

所述方法中，在上述试验结果基础上，利用发酵培养基，将菌株K1和M3扩 大培养液分别于接种量2％～3％(V/V)，发酵温度32℃，发酵时间21～24h的条 件下进行发酵，得到发酵液。

所述方法中，在上述试验结果基础上，利用离心机，将菌株K1和M3发酵 液分别于4℃、8000r/min条件下离心10min，弃掉上清液，收集得到菌泥。

所述方法中，在上述试验结果基础上，利用九阳牌食物料理机，将新鲜去 皮马铃薯直接打浆成为马铃薯泥，于115℃灭菌15min；按上述离心前发酵液1/10 体积的量，取灭菌马铃薯泥作为冻干基质，并分装于600mL的冻干瓶中，每个 冻干瓶装量为100mL。

所述方法中，采用单因素多水平试验，确定马克斯克鲁维酵母菌K1和M3 冻干菌粉的冻干保护剂组合(W/V)：1％谷氨酸钠和3％脱脂奶粉。

所述方法中，在上述试验结果基础上，将K1和M3离心所得菌泥分别置于 冻干基质中，并按比例加入冻干保护剂，混合均匀后，于-30℃条件下，预冻13h 至冻结状态，得到预冻物。

所述方法中，在上述试验结果基础上，利用6L LABCONCO真空冷冻干燥 机(美国)将预冻物于冻干温度-55℃、真空度0.16mBar的条件下，冻干48h至 完全干燥状态，得到冻干菌粉。

所述方法中，马克斯克鲁维酵母K1和M3冻干菌粉具有降低血清胆固醇、 提高机体抗氧化能力、促进肠道菌群平衡等诸多益生功效。

上述方法得到的降血清胆固醇马克斯克鲁维酵母K1和M3冻干菌粉的制备 方法属于本发明保护范围。

具体实施方式

下述实施例对本发明作进一步说明而不限制本发明的保护范围。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为重量对体积的百分含量。

实施例1、降血清胆固醇马克斯克鲁维酵母K1和M3冻干菌粉的制备方法

1、活化

将保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的马克斯克鲁维 酵母菌K1和M3分别接种于10mL马铃薯乳糖液体培养基中，于28℃条件下， 培养21h。如此传代培养3次得到活化后的菌种培养液，其活菌数可达10⁷cfu/mL 以上。

2、扩大培养

将上述0.5mL活化后的菌株K1和M3培养液分别接种于50mL马铃薯乳糖 液体培养基中，在28℃条件下，培养21h，得到扩大培养液。

3、发酵

将上述20～30mL菌株K1和M3扩大培养液分别接种于1000mL改良马铃 薯乳糖液体培养基中，在32℃条件下，发酵21～24h，得到发酵液，采用平板 菌落计数法测定活菌数，结果见表2。

4、离心浓缩与加入保护剂

利用九阳牌食物料理机，将新鲜去皮马铃薯直接打浆成为马铃薯泥，115℃ 灭菌15min；按上述离心前发酵液1/10体积的量，取灭菌马铃薯泥作为冻干基 质，分装于600mL的冻干瓶中，每个冻干瓶装量为100mL；将上述1000mL菌 株K1和M3发酵液于4℃、8000r/min条件下离心10min，弃掉上清液，收集得 到K1和M3菌泥，分别加入冻干基质中；按表1配方加入冻干保护剂，混合均 匀后，得到浓缩物，采用平板菌落计数法测定活菌数，结果见表2。

表1冻干保护剂组合试验结果

由表1可见，选取冻干保护剂组合为1％谷氨酸钠+3％脱脂奶粉+5％甘油时， 冻干菌粉活菌数最高，菌株K1为2.9×10⁹cfu/g，菌株M3为2.6×10⁹cfu/g；选取冻 干保护剂组合为3％脱脂奶粉+5％甘油及1％谷氨酸钠+5％甘油时，冻干菌粉活菌 数次之，其中菌株K1为2.6×10⁹cfu/g及2.5×10⁹cfu/g，菌株M3为2.4×10⁹cfu/g及 2.3×10⁹cfu/g；选取冻干保护剂组合为1％谷氨酸钠时，冻干菌粉活菌数最低，菌 株K1为1.8×10⁹cfu/g，菌株M3为1.6×10⁹cfu/g。当保护剂组合中含有甘油成分时， 冻干物不易被完全干燥，导致冻干菌粉难以成为粉末状，影响后期保存效果与 菌种存活率。最终选取1％谷氨酸钠+3％脱脂奶粉为冻干保护剂组合配方，其中 菌株K1活菌数为2.3×10⁹cfu/g，菌株M3活菌数为2.0×10⁹cfu/g。

5、预冻、冻干

将上述菌株K1和M3浓缩物于-30℃条件下预冻13h至冻结状态，得到预 冻物；利用6L LABCONCO真空冷冻干燥机(美国)，将上述预冻物于冻干温度 -55℃、真空度0.16mBar的条件下，冻干48h至完全干燥状态，得到冻干菌粉， 采用平板菌落计数法测定活菌数，结果见表2。

表2发酵液、浓缩物和冻干菌粉的活菌数

由表2可见，发酵液活菌数均达10⁸cfu/mL以上；离心浓缩后，其活菌数可 达10⁹cfu/mL以上；冷冻干燥后，由于冻干保护剂组合的保护作用，菌株K1和 M3存活率分别为69.70％和66.67％，达到较高水平，且冻干菌粉的活菌数仍达 10⁹cfu/mL以上，可作为降血清胆固醇功能性益生菌制剂及发酵乳制品的发酵剂。

实施例2、马克斯克鲁维酵母K1和M3冻干菌粉降血清胆固醇的动物实验

1、动物分组与处理

将40只Wistar大鼠(由北京维通利华实验动物技术公司提供)随机分为4组， 分别是高脂模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组。所有组均饲喂高脂饲料(基 础饲料78.8％、胆固醇1％、蛋黄粉10％、猪油10％、胆盐0.2％，均由北京维通利 华实验动物技术公司提供)，适应性饲养1周。1周后，所有组继续饲喂高脂饲料， 同时将低剂量组、中剂量组、高剂量组分别按0.5g/kg·d、1.5g/kg·d和2.5g/kg·d剂 量灌胃马克斯克鲁维酵母K1和M3混合冻干菌粉(K1和M3冻干菌粉混合比例为 1∶1，活菌数达10⁹cfu/g以上，灌胃时以温热蒸馏水按1∶10比例稀释复原)，高脂 模型组灌胃同剂量蒸馏水，如此连续饲喂6周。

2、血清制备与检测

在试验第1、3、5、7周末，分别对大鼠眼眶静脉丛采血，将盛有全血的离 心管室温静置10min后，3000r/min离心10min，吸取上清液，为血清样品。采用 胆固醇氧化酶-过氧化物酶-4-氨基安替比林和酚法测定血清总胆固醇(TC)的含 量，结果见表3；采用甘油磷酸氧化酶-过氧化物酶-4-氨基安替比林和酚法测定 血清甘油三脂(TG)的含量，结果见表4。

表3冻干菌粉降大鼠血清TC含量的实验结果

注：^**表示与对照组比较P＜0.01

由表3可见，动物实验进行至第7周后，高、中、低剂量组大鼠的血清TC含 量与高脂模型组对比，均出现极显著差异(P＜0.01)，且中剂量组效果最为明显， 表明马克斯克鲁维酵母K1和M3冻干菌粉具有极显著降低高胆固醇血症大鼠血 清总胆固醇含量的功效。

表4冻干菌粉降大鼠血清TG含量的实验结果

注：^**表示与对照组比较P＜0.01

由表4可见，动物实验进行至第7周后，高、中、低剂量组大鼠的血清TG含 量与高脂模型组对比，均出现极显著差异(P＜0.01)，且低剂量组效果最为明显， 表明马克斯克鲁维酵母K1和M3冻干菌粉具有极显著降低高胆固醇血症大鼠血 清甘油三脂含量的功效。

综上所述，马克斯克鲁维酵母K1和M3冻干菌粉具有极显著降低机体血清胆 固醇和甘油三脂含量的功效。此外，进一步的大鼠动物实验结果表明，马克斯 克鲁维酵母K1和M3冻干菌粉尚有明显提高机体抗氧化能力、促进肠道菌群平衡 等诸多益生功效。

本专利所属项目1：北京市自然科学基金“藏灵菇益生菌产生物活性物质及生理 功能的研究”

项目编号：5062006

项目起止时间：2006.01-2008.12

项目负责人：刘慧

本专利所属项目2：北京市自然科学基金“藏灵菇克鲁维酵母菌降胆固醇作用及 机理的研究”

项目编号：5092008

项目起止时间：2009.01-2011.12

项目负责人：刘慧