一种遗传性脊髓小脑共济失调相关基因

摘要

本发明属于分子病理学领域，涉及一种遗传性脊髓小脑共济失调相关基因(突变型)。具体地，所述遗传性脊髓小脑共济失调相关基因编码SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，更具体地，所述脊髓小脑共济失调相关基因的核酸序列如SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8所示。本发明还涉及含有所述脊髓小脑共济失调相关基因的重组载体、含有该重组载体的重组细胞、以及所述脊髓小脑共济失调相关基因的编码蛋白。此外，本发明还涉及一种遗传性脊髓小脑共济失调相关基因的外显子及其编码蛋白。本发明为遗传性脊髓小脑共济失调的辅助分子诊断、分子分型、产前诊断、药物靶点选择和临床治疗提供了依据。

说明书

技术领域

本发明属于分子病理学领域，涉及一种遗传性脊髓小脑共济失调相关基因(突变型)(下文中也称为“SCA相关基因”或“SCA相关基因突变型”)。本发明还涉及含有所述遗传性脊髓小脑共济失调相关基因的重组载体、含有该重组载体的重组细胞、所述遗传性脊髓小脑共济失调相关基因的编码蛋白。本发明还涉及一种遗传性脊髓小脑共济失调相关基因的外显子及其编码蛋白。

背景技术

遗传性脊髓小脑共济失调(hereditary spinocerebellar ataxias，SCA)是一种具有高度的临床和遗传异质性的神经系统退行性疾病，其遗传方式多呈常染色体显性遗传(autosomal dominant，AD)，患者多于中青年发病，临床上以小脑性共济失调为主要特征，同时还可伴有眼球运动障碍、慢眼活动、视神经萎缩、视网膜色素变性、锥体束征、锥体外系表现、肌萎缩、周围神经病和痴呆等表现。发病率约为5-7/100,000(Schols L，et al.Autosomal dominant cerebellarataxias：clinical features，genetics，and pathogenesis.Lancet Neurol2004；3：291-304.；Tsuji S，et al.Sporadic ataxias in Japan--apopulation-based epidemiological study.Cerebellum 2008；7：189-97.)。该病发病机制未完全明确，目前尚无有效的治疗方法。

随着分子遗传学研究的发展，到目前已经定位了31种亚型，其中19个遗传性脊髓小脑共济失调致病基因已被克隆，包括：ATAXIN1、ATAXIN2、MJD、Puratrophin-1、SPTBN2、CACNA1A、ATXN7、ATXN8OS/ATXN8、ATXN10、TTBK2、PPP2R2B、KCNC3、PRKCG、ITPR1、TBP、FGF14、AFG3L2、PLEKHG4、以及DRPLA(Di Bella D，et al.Mutations in the mitochondrialprotease gene AFG3L2cause dominant hereditary ataxia SCA28.N atGenet 2010；42：313-21.；Matilla-Duenas A，et al.Cellular andmolecular pathways triggering  neurodegeneration  in thespinocerebellar ataxias.Cerebellum 2010；9：148-66.；Sato N，et al.Spinocerebellar ataxia type 31is associated with″inserted″penta-nucleotide repeats containing(TGGAA)n.Am J Hum Genet2009；85：544-57.)。但是，全球范围内约有33％的SCA患者并没有上述的19个遗传性脊髓小脑共济失调致病基因突变的情况，其致病基因尚不清楚。

已知转谷氨酰胺酶6(transglutaminase 6，简称为TG6)，主要在中枢神经系统的神经元细胞内表达，其中包括小脑的浦肯野细胞。据文献报导，TG6可能参与多种疾病如帕金森氏病、亨廷顿舞蹈病、阿尔茨海默病等发病过程(Jeitner TM，Muma NA，Battaile KP，Cooper AJ.Transglutaminase activation in neurodegenerativediseases.Future Neurol 2009；4：449-67.)。尸体解剖发现，在谷蛋白共济失调患者的小脑中有TG6蛋白的沉积；动物实验也发现，血管内注射抗TG2/3/6单链抗体，可以导致小鼠共济失调样表型(Hadjivassiliou M，Aeschlimann P，Strigun A，Sanders DS，Woodroofe N，Aeschlimann D.Autoantibodies in gluten ataxiarecognize a novel neuronal transglutaminase.Ann Neurol 2008；64：332-43.以及Boscolo S，Lorenzon A，Sblattero D，Florian F，Stebel M，Marzari R，et al.Anti transglutaminase antibodies cause ataxia inmice.PLoS One 2010；5：e9698.)。

已知上述的TG6由TGM6基因编码。TGM6基因在GenBank中有两种剪接形式，一种剪接形式的ID号为NC_000020.10，另一种剪接形式的ID号为NT_011387.8。NC_000020.10的编码序列(codingsequence，简称为CDS)如SEQ ID NO：1所示，其由2121个碱基组成，编码的蛋白由706个氨基酸组成，所述蛋白的氨基酸序列如SEQID NO：2所示。NT_011387.8的编码序列如SEQ ID NO：3所示，其由1878个碱基组成，编码的蛋白由625个氨基酸组成，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。TGM6基因的两种剪接形式的编码序列(SEQ ID NO：1)或(SEQ ID NO：3)中第10号外显子如SEQID NO：5所示。

新的遗传性脊髓小脑共济失调相关基因的克隆有利于SCA患者的分子诊断，也可为研究SCA的发病机理提供重要线索。

发明内容

本发明人经过不懈的努力，发现了一种遗传性脊髓小脑共济失调相关基因，并由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及一种分离的遗传性脊髓小脑共济失调相关基因(突变型)，所述遗传性脊髓小脑共济失调相关基因突变型有两种剪接形式，一种剪接形式的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，另一种剪接形式的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。

遗传性脊髓小脑共济失调相关基因(突变型)的第一种剪接形式(SEQ ID NO：6)由2121个碱基组成，具体序列如下(突变后的碱基G用边框标出)：

ATGGCAGGGATCAGAGTCACCAAGGTGGACTGGCAGCGGTCGAGGAATGGCGCTGCCCACCACACCCAGGAGTACCCCTGCCCTGAGCTGGTGGTTCGCAGGGGCCAGTCGTTCAGCCTCACGCTGGAGCTGAGCAGAGCCCTGGACTGTGAGGAGATCCTCATCTTCACGATGGAGACAGGACCCCGGGCTTCTGAGGCCCTCCACACCAAAGCTGTGTTCCAGACATCGGAGCTGGAGCGGGGTGAGGGCTGGACAGCAGCAAGGGAGGCTCAGATGGAGAAAACTCTGACCGTCAGTCTCGCCAGCCCTCCCAGTGCTGTCATTGGCCGCTACCTGCTGAGCATCAGGCTTTCCTCTCACCGCAAACACAGCAACCGGAGGCTGGGCGAGTTTGTTCTCCTTTTCAACCCATGGTGTGCAGAGGACGATGTGTTTCTGGCCTCAGAGGAGGAGAGACAGGAGTACGTGCTCAGCGACAGCGGCATCATCTTCCGAGGCGTGGAGAAGCACATACGAGCCCAGGGCTGGAACTACGGGCAGTTTGAGGAGGACATCCTGAACATCTGCCTCTCCATCCTGGATCGAAGCCCCGGTCACCAAAACAACCCAGCCACCGACGTGTCCTGCCGCCACAACCCCATCTACGTCACCAGGGTCATCAGTGCCATGGTGAACAGCAACAACGACCGAGGTGTGGTGCAAGGACAGTGGCAGGGCAAGTACGGCGGCGGCACCAGCCCGCTGCACTGGCGCGGCAGCGTGGCCATTCTGCAGAAGTGGCTCAAGGGCAGGTACAAGCCAGTCAAGTACGGCCAGTGCTGGGTCTTCGCCGGAGTCCTGTGCACAGTCCTCAGGTGCTTGGGGATAGCCACACGGGTCGTGTCCAACTTCAACTCAGCCCACGACACAGACCAGAACCTGAGTGTGGACAAATACGTGGACTCCTTCGGGCGGACCCTGGAGGACCTGACAGAAGACAGCATGTGGAATTTCCATGTCTGGAATGAGAGCTGGTTTGCCCGGCAGGACCTAGGCCCCTCTTACAATGGCTGGCAGGTTCTGGATGCCACCCCCCAGGAGGAGAGTGAAGGTGTGTTCCGGTGCGGCCCAGCCTCAGTCACCGCCATCCGCGAGGGTGATGTGCACCTGGCTCACGATGGCCCCTTCGTGTTTGCGGAGGTCAACGCCGACTACATCACCTGGCTGTGGCACGAGGATGAGAGCCGGGAGCGTGTATACTCAAACACGAAGAAGATTGGGAGATGCATCAGCACCAAGGCGGTGGGCAGTGACTCCCGCGTGGACATCACTGACCTCTACAAGTATCCGGAAGGGTCCCGGAAAGAGAGGCAGGTGTACAGCAAGGCGGTGAACAGGCTGTTCGGCGTGGAAGCCTCTGGAAGGAGAATCTGGATCCGCAGGGCTGGGGGTCGCTGTCTCTGGCGTGACGACCTCCTGGAGCCTGCCACCAAGCCCAGCATCGCTGGCAAGTTCAAGGTGCTAGAGCCTCCCATGCTGGGCCACGACCTGAGACTGGCCCTGTGCTGGCCAACCTCACCTCCCGGGCCCAGCGGGTGAGGGTCAACCTGAGCGGTGCCACCATCCTCTATACCCGCAAGCCAGTGGCAGAGATCCTGCATGAATCCCACGCCGTGAGGCTGGGGCCGCAAGAAGAGAAGAGAATCCCAATTACAATATCTTACTCTAAGTATAAAGAAGACCTGACAGAGGACAAGAAGATCCTGTTGGCTGCCATGTGCCTTGTCACCAAAGGAGAGAAGCTTCTGGTGGAGAAGGACATTACTCTAGAGGACTTCATCACCATCAAGGTTCTGGGCCCAGCCATGGTGGGAGTGGCAGTTACAGTGGAAGTGACAGTAGTCAACCCCCTCATAGAGAGAGTGAAGGACTGTGCGCTGATGGTGGAGGGCAGCGGCCTTCTCCAGGAACAGCTCAGCATCGACGTGCCTACCCTGGAGCCTCAGGAGAGGGCCTCAGTCCAGTTTGACATCACCCCCTCCAAAAGTGGCCCAAGGCAGCTGCAGGTGGACCTTGTAAGCCCTCACTTCCCGGACATCAAGGGCTTTGTGATCGTCCATGTGGCCACTGCCAAGTGA  (SEQ ID NO：6)

突变型遗传性脊髓小脑共济失调相关基因(SEQ ID NO：6)与野生型遗传性脊髓小脑共济失调相关基因(SEQ ID NO：1)在序列上的区别是：野生型SCA相关基因(SEQ ID NO：1)第1550位的碱基为T，突变型SCA相关基因(SEQ ID NO：6)的第1550位碱基突变为G。

遗传性脊髓小脑共济失调相关基因(突变型)的第二种剪接形式(SEQ ID NO：8)由1878个碱基组成，具体序列如下(突变后的碱基G用边框标出)：

ATGGCAGGGATCAGAGTCACCAAGGTGGACTGGCAGCGGTCGAGGAATGGCGCTGCCCACCACACCCAGGAGTACCCCTGCCCTGAGCTGGTGGTTCGCAGGGGCCAGTCGTTCAGCCTCACGCTGGAGCTGAGCAGAGCCCTGGACTGTGAGGAGATCCTCATCTTCACGATGGAGACAGGACCCCGGGCTTCTGAGGCCCTCCACACCAAAGCTGTGTTCCAGACATCGGAGCTGGAGCGGGGTGAGGGCTGGACAGCAGCAAGGGAGGCTCAGATGGAGAAAACTCTGACCGTCAGTCTCGCCAGCCCTCCCAGTGCTGTCATTGGCCGCTACCTGCTGAGCATCAGGCTTTCCTCTCACCGCAAACACAGCAACCGGAGGCTGGGCGAGTTTGTTCTCCTTTTCAACCCATGGTGTGCAGAGGACGATGTGTTTCTGGCCTCAGAGGAGGAGAGACAGGAGTACGTGCTCAGCGACAGCGGCATCATCTTCCGAGGCGTGGAGAAGCACATACGAGCCCAGGGCTGGAACTACGGGCAGTTTGAGGAGGACATCCTGAACATCTGCCTCTCCATCCTGGATCGAAGCCCCGGTCACCAAAACAACCCAGCCACCGACGTGTCCTGCCGCCACAACCCCATCTACGTCACCAGGGTCATCAGTGCCATGGTGAACAGCAACAACGACCGAGGTGTGGTGCAAGGACAGTGGCAGGGCAAGTACGGCGGCGGCACCAGCCCGCTGCACTGGCGCGGCAGCGTGGCCATTCTGCAGAAGTGGCTCAAGGGCAGGTACAAGCCAGTCAAGTACGGCCAGTGCTGGGTCTTCGCCGGAGTCCTGTGCACAGTCCTCAGGTGCTTGGGGATAGCCACACGGGTCGTGTCCAACTTCAACTCAGCCCACGACACAGACCAGAACCTGAGTGTGGACAAATACGTGGACTCCTTCGGGCGGACCCTGGAGGACCTGACAGAAGACAGCATGTGGAATTTCCATGTCTGGAATGAGAGCTGGTTTGCCCGGCAGGACCTAGGCCCCTCTTACAATGGCTGGCAGGTTCTGGATGCCACCCCCCAGGAGGAGAGTGAAGGTGTGTTCCGGTGCGGCCCAGCCTCAGTCACCGCCATCCGCGAGGGTGATGTGCACCTGGCTCACGATGGCCCCTTCGTGTTTGCGGAGGTCAACGCCGACTACATCACCTGGCTGTGGCACGAGGATGAGAGCCGGGAGCGTGTATACTCAAACACGAAGAAGATTGGGAGATGCATCAGCACCAAGGCGGTGGGCAGTGACTCCCGCGTGGACATCACTGACCTCTACAAGTATCCGGAAGGGTCCCGGAAAGAGAGGCAGGTGTACAGCAAGGCGGTGAACAGGCTGTTCGGCGTGGAAGCCTCTGGAAGGAGAATCTGGATCCGCAGGGCTGGGGGTCGCTGTCTCTGGCGTGACGACCTCCTGGAGCCTGCCACCAAGCCCAGCATCGCTGGCAAGTTCAAGGTGCTAGAGCCTCCCATGCTGGGCCACGACCTGAGACTGGCCCTGTGCTGGCCAACCTCACCTCCCGGGCCCAGCGGGTGAGGGTCAACCTGAGCGGTGCCACCATCCTCTATACCCGCAAGCCAGTGGCAGAGATCCTGCATGAATCCCACGCCGTGAGGCTGGGGCCGCAAGAAGAGAAGAGAATCCCAATTACAATATCTTACTCTAAGTATAAAGAAGACCTGACAGAGGACAAGAAGATCCTGTTGGCTGCCATGTGCCTTGTCACCAAAGGAGAGAAGCTTCTGGTGGAGAAGGACATTACTCTAGAGGACTTCATCACCATCAAGCGTGCCTACCCTGGAGCCTCAGGAGAGGGCCTCAGTCCAGTTTGA  (SEQ ID NO：8)

突变型遗传性脊髓小脑共济失调相关基因的第二种剪接形式(SEQ ID NO：8)与野生型遗传性脊髓小脑共济失调相关基因对应的剪接形式(SEQ ID NO：3)在序列上的区别是：野生型SCA相关基因(SEQ ID NO：3)第1550位的碱基为T，突变型SCA相关基因(SEQ ID NO：8)的第1550位碱基突变为G。

本发明的又一方面涉及遗传性脊髓小脑共济失调相关基因突变型的两种剪接形式(SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8)所编码的蛋白质，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9所示。

其中，遗传性脊髓小脑共济失调相关基因突变型第一种剪接形式所编码的蛋白质由706个氨基酸组成，具体序列如下(突变后的色氨酸用边框标出)(SEQ ID NO：7)：

MAGIRVTKVDWQRSRNGAAHHTQEYPCPELVVRRGQSFSLTLELSRALDCEEILIFTMETGPRASEALHTKAVFQTSELERGEGWTAAREAQMEKTLTVSLASPPSAVIGRYLLSIRLSSHRKHSNRRLGEFVLLFNPWCAEDDVFLASEEERQEYVLSDSGIIFRGVEKHIRAQGWNYGQFEEDILNICLSILDRSPGHQNNPATDVSCRHNPIYVTRVISAMVNSNNDRGVVQGQWQGKYGGGTSPLHWRGSVAILQKWLKGRYKPVKYGQCWVFAGVLCTVLRCLGIATRVVSNFNSAHDTDQNLSVDKYVDSFGRTLEDLTEDSMWNFHVWNESWFARQDLGPSYNGWQVLDATPQEESEGVFRCGPASVTAIREGDVHLAHDGPFVFAEVNADYITWLWHEDESRERVYSNTKKIGRCISTKAVGSDSRVDITDLYKYPEGSRKERQVYSKAVNRLFGVEASGRRIWIRRAGGRCLWRDDLLEPATKPSIAGKFKVLEPPMLGHDLRLALCANLTSRAQRVRVNLSGATILYTRKPVAEILHESHAVRLGPQEEKRIPITISYSKYKEDLTEDKKILLAAMCLVTKGEKLLVEKDITLEDFITIKVLGPAMVGVAVTVEVTVVNPLIERVKDCALMVEGSGLLQEQLSIDVPTLEPQERASVQFDITPSKSGPRQLQVDLVSPHFPDIKGFVIVHVATAK(SEQ ID NO：7)

遗传性脊髓小脑共济失调相关基因突变型第一种剪接形式所编码的蛋白质(SEQ ID NO：7)与野生型SCA基因所对应的剪接形式编码的蛋白质(SEQ ID NO：2)在序列上的区别是：SEQ ID NO：3第517位的氨基酸为亮氨酸(Leu)，SEQ ID NO：7的第517位的氨基酸为色氨酸(Trp)。

遗传性脊髓小脑共济失调相关基因突变型第二种剪接形式所编码的蛋白质(SEQ ID NO：9)所示的蛋白质由625个氨基酸组成，具体序列如下(突变后的色氨酸用边框标出)：

MAGIRVTKVDWQRSRNGAAHHTQEYPCPELVVRRGQSFSLTLELSRALDCEEILIFTMETGPRASEALHTKAVFQTSELERGEGWTAAREAQMEKTLTVSLASPPSAVIGRYLLSIRLSSHRKHSNRRLGEFVLLFNPWCAEDDVFLASEEERQEYVLSDSGIIFRGVEKHIRAQGWNYGQFEEDILNICLSILDRSPGHQNNPATDVSCRHNPIYVTRVISAMVNSNNDRGVVQGQWQGKYGGGTSPLHWRGSVAILQKWLKGRYKPVKYGQCWVFAGVLCTVLRCLGIATRVVSNFNSAHDTDQNLSVDKYVDSFGRTLEDLTEDSMWNFHVWNESWFARQDLGPSYNGWQVLDATPQEESEGVFRCGPASVTAIREGDVHLAHDGPFVFAEVNADYITWLWHEDESRERVYSNTKKIGRCISTKAVGSDSRVDITDLYKYPEGSRKERQVYSKAVNRLFGVEASGRRIWIRRAGGRCLWRDDLLEPATKPSIAGKFKVLEPPMLGHDLRLALCANLTSRAQRVRVNLSGATILYTRKPVAEILHESHAVRLGPQEEKRIPITISYSKYKEDLTEDKKILLAAMCLVTKGEKLLVEKDITLEDFITIKRAYPGASGEGLSPV(SEQ ID NO：9)

遗传性脊髓小脑共济失调相关基因突变型第二种剪接形式所编码的蛋白质(SEQ ID NO：9)与野生型与野生型SCA基因所对应的剪接形式编码的蛋白质(SEQ ID NO：4)在序列上的区别是：SEQ IDNO：4第517位的氨基酸为亮氨酸(Leu)，SEQ ID NO：9的第517位的氨基酸为色氨酸(Trp)。

本发明所述一种遗传性脊髓小脑共济失调相关基因(突变型)的两种剪接形式，并不局限于上述SEQ ID NO 6或SEQ ID NO 8所示的具体核苷酸序列。考虑到遗传密码的兼并性，本发明所述SCA相关基因(突变型)的两种剪接形式，包括分别编码SEQ ID NO：7或SEQID NO：9所示氨基酸序列的任一核苷酸序列。

在本发明的一个具体的实施方式中，本发明人检测了一个SCA疾病患者家系，发现SCA患者中本发明所述遗传性脊髓小脑共济失调相关基因的第1550位碱基均由T变为G，其所编码的蛋白质第517氨基酸相应的由亮氨酸(Leu)突变为色氨酸(Trp)。

本发明的又一方面涉及一种重组载体，其含有本发明的遗传性脊髓小脑共济失调相关基因突变型；本发明的还一方面涉及一种重组细胞，其含有该重组载体。

本发明还涉及一种分离的遗传性脊髓小脑共济失调相关基因突变型的外显子(10号外显子)，其核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示(突变后的碱基G用边框标出)：

GGTCCCGGAAAGAGAGGCAGGTGTACAGCAAGGCGGTGAACAGGCTGTTCGGCGTGGAAGCCTCTGGAAGGAGAATCTGGATCCGCAGGGCTGGGGGTCGCTGTCTCTGGCGTGACGACCTCCTGGAGCCTGCCACCAAGCCCAGCATCGCTGGCAAGTTCAAGGTGCTAGAGCCTCCCATGCTGGGCCACGACCTGAGACTGGCCCTGTGCTGGCCAACCTCACCTCCCGGGCCCAGCGGGTGAGGGTCAACCTGAGCGGTGCCACCATCCTCTATACCCGCAAGCCAGTGGCAGAGATCCTGCATGAATCCCACGCCGTGAGGCTGGGGCCGCAAGAAG  (SEQ ID NO：10)

与野生型遗传性脊髓小脑共济失调相关基因的10号外显子(SEQID NO：5)相比，突变型的10号外显子(SEQ ID NO：10)的第214碱基由T突变为G。

本发明的又一方面涉及突变型遗传性脊髓小脑共济失调相关基因外显子(SEQ ID NO：10)编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示(突变后的色氨酸用边框标出)。

GSRKERQVYSKAVNRLFGVEASGRRIWIRRAGGRCLWRDDLLEPATKPSIAGKFKVLEPPMLGHDLRLALCANLTSRAQRVRVNLSGATILYTRKPVAEILHESHAVRLGPQE(SEQ ID NO：12)

与野生型遗传性脊髓小脑共济失调相关基因的10号外显子编码蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：11)相比，突变型所编码的蛋白中第72位的氨基酸由亮氨酸突变为色氨酸。

本发明所述一种遗传性脊髓小脑共济失调相关基因(突变型)的10号外显子，并不局限于上述SEQ ID NO 10所示的具体核苷酸序列。考虑到遗传密码的兼并性，本发明所述SCA相关基因(突变型)的外显子包括编码SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的任一核苷酸序列。

本发明的又一方面涉及一种重组载体，其含有本发明的遗传性脊髓小脑共济失调相关基因突变型的10号外显子。本发明的又一方面涉及一种重组细胞，其含有该重组载体。

发明的有益效果

本发明发现了一种新的遗传性脊髓小脑共济失调相关基因，对该基因的检测可能用于SCA患者的辅助诊断，特别是产前诊断，指导优生优育，并且可能有利于明确SCA患者的分子诊断及分子分型。本发明可以对SCA的发病机理提供重要线索，对SCA的诊断治疗具有十分重要的意义。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：遗传性脊髓小脑共济失调相关基因与SCA疾病关系的验证

发明人采集到一个四代遗传的常染色体显性SCA家系，家系内患者表现为进行性加重的行走困难和小脑性构音障碍，绝大部分患者存在腱反射活跃/亢进，部分患者伴有手部震颤和痉挛性斜颈，头部核磁共振成像检查(MRI)示小脑中度萎缩及脑干轻度萎缩。

分别对该家系内18名正常人(男7名，女11人)、9名SCA患者(男5名，女4名)、以及3名临床诊断不明确者(男2名，女1名)的基因组中遗传性脊髓小脑共济失调相关基因进行检测，通过PCR扩增，产物纯化，测序的方法获得遗传性脊髓小脑共济失调相关基因10号外显子的序列，根据序列测定结果属于突变型遗传性脊髓小脑共济失调相关基因(SEQ ID NO：10)还是野生型遗传性脊髓小脑共济失调相关基因(SEQ ID NO：5)，验证遗传性脊髓小脑共济失调相关基因与SCA的相关性。

具体步骤如下：

1)DNA提取

分别采取上述的18名正常人、9名SCA患者、以及3名临床诊断不明确者的外周静脉血，每人5mL，经枸橼酸钠抗凝，常规酚/氯仿法提取基因组DNA，分光光度计测DNA含量，并稀释至20ng/μL；

2)PCR检测

根据遗传性脊髓小脑共济失调相关基因10号外显子的核苷酸序列设计如下的引物：

正向引物：5′gCCAgTTTgACTTCCATgAgCC  3′(SEQ IDNO：13)

反向引物：5′CCTCTgACCTCCACAACCCTCC 3′(SEQ IDNO：14)

PCR反应体系：10μL

LA Taq酶(5U/μL)             0.1μL

2×GC Buffer I(加入了Mg²⁺)   5.0μL

2mM dNTP                     0.4μL

正向引物(100ng/μL)0.2μL

反向引物(100ng/μL)0.2μL

DNA模板            1μL

ddH₂O             加至10μL

反应条件如下面的表1所示：

表1：PCR反应条件

得到的PCR产物可以在4℃保存。

3)测序

将步骤2中获自18名正常人、9名SCA患者、以及3名临床诊断不明确者的PCR扩增产物进行DNA测序。

对于获自该SCA家系内的18名正常人的PCR扩增样品，测得的序列如SEQ ID NO：15所示(其中带下划线的部分属于内含子序列，突变前的碱基T用边框标示出)。

GCCAGTTTGACTTCCATGAGCCATAGTAAATTAAAGGAGCAAGGGGGTGCCTGCCGCTGACGTTGTGTGATGCCCTGCAGGGTCCCGGAAAGAGAGGCAGGTGTACAGCAAGGCGGTGAACAGGCTGTTCGGCGTGGAAGCCTCTGGAAGGAGAATCTGGATCCGCAGGGCTGGGGGTCGCTGTCTCTGGCGTGACGACCTCCTGGAGCCTGCCACCAAGCCCAGCATCGCTGGCAAGTTCAAGGTGCTAGAGCCTCCCATGCTGGGCCACGACCTGAGACTGGCCCTGTGCTGGCCAACCTCACCTCCCGGGCCCAGCGGGTGAGGGTCAACCTGAGCGGTGCCACCATCCTCTATACCCGCAAGCCAGTGGCAGAGATCCTGCATGAATCCCACGCCGTGAGGCTGGGGCCGCAAGAAGGTAAGTGTACGCTGGCTTGGTGGAATCAGGCCAAACCACCTCCTTTTTCAGGAGGGTTGTGGAGGTCAGAGG  (SEQ ID NO：15)

对于获自9名SCA患者的PCR扩增样品，测得的序列如SEQ IDNO：16所示(其中带下划线的部分属于内含子序列，突变后的碱基G用边框标示出)。

GCCAGTTTGACTTCCATGAGCCATAGTAAATTAAAGGAGCAAGGGGGTGCCTGCCGCTGACGTTGTGTGATGCCCTGCAGGGTCCCGGAAAGAGAGGCAGGTGTACAGCAAGGCGGTGAACAGGCTGTTCGGCGTGGAAGCCTCTGGAAGGAGAATCTGGATCCGCAGGGCTGGGGGTCGCTGTCTCTGGCGTGACGACCTCCTGGAGCCTGCCACCAAGCCCAGCATCGCTGGCAAGTTCAAGGTGCTAGAGCCTCCCATGCTGGGCCACGACCTGAGACTGGCCCTGTGCTGGCCAACCTCACCTCCCGGGCCCAGCGGGTGAGGGTCAACCTGAGCGGTGCCACCATCCTCTATACCCGCAAGCCAGTGGCAGAGATCCTGCATGAATCCCACGCCGTGAGGCTGGGGCCGCAAGAAGGTAAGTGTACGCTGGCTTGGTGGAATCAGGCCAAACCACCTCCTTTTTCAGGAGGGTTGTGGAGGTCAGAGG  (SEQ ID NO：16)

对于获自3名临床诊断不明确者的PCR扩增样品，其中两人的PCR扩增样品测得的序列如SEQ ID NO：15所示，其中一人的PCR扩增样品测得的序列如SEQ ID NO：16所示。

结果分析：

1)9名患者遗传性脊髓小脑共济失调相关基因的10号外显子的第214位均发生了T→G的突变。3名临床诊断不明确者，其中一人10号外显子的第214位也发生了T→G的突变。

2)10号外显子第214位的T→G突变(即由SEQ ID NO：5变为SEQ ID NO：10)，对应于遗传性脊髓小脑共济失调相关基因第1550位碱基发生了T→G的突变(即变为SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8)，该突变导致遗传性脊髓小脑共济失调相关基因的编码蛋白质的第517位氨基酸序列由亮氨酸(Leu)变为色氨酸(Trp)(分别对应于SEQID NO：7或SEQ ID NO：9)。

此外，通过与本实施例中外显子的PCR检测类似的方法，本发明人还检测了18名正常人、9名SCA患者、以及3名临床诊断不明确者的遗传性脊髓小脑共济失调相关基因的全长序列，发现除第1550位碱基之外的其它碱基没有任何变化。

此外，本发明人还进一步对该家系外的500个正常人的遗传性脊髓小脑共济失调相关基因进行了突变筛查，未发现上述的T→G突变，排除了单个核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)的可能性，确定上述的T→G突变是该常染色体显性遗传SCA家系的致病基因突变。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。