一种产纳豆激酶枯草芽孢杆菌及该菌种发酵生产纳豆激酶的方法

摘要

本发明涉及一种产纳豆激酶枯草芽孢杆菌及其发酵生产纳豆激酶的方法，菌种名称为TK-1，分类名称Bacillius subtilis，保藏编号为：CGMCC No.4731，保藏日期：2011年4月2日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。发酵培养基中含有豆粕，发酵的方法主要包括：发酵培养基包括豆粕。本发明中的枯草芽孢杆菌以豆粕为原料固态发酵产纳豆激酶，豆粕的价格就比较低，且豆粕中蛋白质含量很高，利于菌体的生长，获得的纳豆激酶酶活最高达到5670FU/g干基，活菌数最高可以达到7×109cfu/g。

说明书

技术领域

本发明属于微生物领域，尤其是一种产纳豆激酶枯草芽孢杆菌及其发酵生产纳豆激酶的方法。

背景技术

纳豆激酶是一种由纳豆芽孢杆菌产生的一种碱性丝氨酸蛋白酶，具有较强的溶栓特性，利用固态发酵方式产纳豆激酶，具有简单易行、成本低廉等特点。纳豆激酶，可直接分解血栓，每克湿纳豆溶栓效果相当于尿激酶1600IU。纳豆激酶对血栓的作用时间长达8-12小时，而尿激酶作用时间只有30分钟。尿激酶只能注射，纳豆激酶即可注射也可口服，而且可以在毛细血管中发挥作用。纳豆在日本已食用1000年，是一种安全的食用血栓预防剂。目前，利用枯草芽孢杆菌发酵产纳豆激酶的培养基种类很多，大都成本比较高。

发明内容

本发明的目的是提供一种产纳豆激酶枯草芽孢杆菌及该菌种发酵生产纳豆激酶的方法，本方法以豆粕为原料利用枯草芽孢杆菌固态发酵产纳豆激酶。

本发明实现目的的技术方案如下：

一种产纳豆激酶枯草芽孢杆菌，名称为TK-1，分类名称Bacillius subtilis，保藏编号为：CGMCC No.4731，保藏日期：2011年4月2日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

一种利产纳豆激酶枯草芽孢杆菌发酵生产纳豆激酶的方法，发酵培养基包括豆粕。

而且，所述发酵培养基为：豆粕∶水的重量比为1∶1-2，pH6.5-7.5，豆粕用水浸泡3-4h。

而且，发酵培养基确定为：豆粕∶水的重量比为1∶1.2，pH7.0，豆粕用水浸泡3-4h。

而且，所述发酵培养基灭菌为：经110℃高压灭菌20min。

而且，发酵的接种与培养条件为：以5-15％的种子液接种量，将产纳豆激酶枯草芽孢杆菌TK-1(CGMCC No.4731)种子液接入发酵培养基中，并搅拌，培养温度30-45℃，培养箱湿度60-70％RH，培养24h。

而且，发酵的接种与培养条件为：以10％的种子液接种量，将种子液接入发酵培养基中，搅拌，培养温度37℃，培养箱湿度65％RH，培养24h。

本发明的优点和积极效果是：

1、本发明中的枯草芽孢杆菌以豆粕为原料固态发酵产纳豆激酶，豆粕的价格就比较低，且豆粕中蛋白质含量很高，利于菌体的生长，获得的纳豆激酶酶活最高达到5670FU/g干基，活菌数最高可以达到7*10⁹cfu/g。

2、本发明以食品级豆粕为主要原料发酵产纳豆激酶，豆粕是大豆提取豆油后得到的一种副产品，含蛋白质40-50％，其主要成分还有氨基酸，丰富的微量元素和较少含量的脂肪，含水量一般在10％-20％，丰富的营养成分可以满足纳豆芽孢杆菌生长及产酶的需要，目前国内还未有只以豆粕为原料利用纳豆芽孢杆菌产纳豆激酶的记载。

附图说明：

图1本发明枯草芽孢杆菌液态种子液生长曲线；

图2本发明枯草芽孢杆菌固态培养基生长曲线；

图3本发明枯草芽孢杆菌固态发酵豆粕产纳豆激酶曲线测定。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

一种产纳豆激酶枯草芽孢杆菌，名称为TK-1，分类名称Bacillius subtilis，保藏编号为：CGMCC No.4731，保藏日期：2011年4月2日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

1、斜面培养基：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，氯化钠0.5％，琼脂2％，pH7.0～7.2，121℃灭菌20分钟，培养条件：37℃培养48h。

菌株枯草芽孢杆菌TK-1在斜面培养基上37℃温度下培养48小时，在斜面试管中加入20ml无菌水，用接种环刮取少量菌苔于无菌水，振荡混匀，制成菌悬液，取1ml菌悬液接种于盛有99ml液态种子培养基的500ml锥形瓶中，于37℃，150rpm摇床上培养8小时，获得种子液。

2、种子培养

液态种子液培养基：蛋白胨1％，葡萄糖2％，磷酸氢二钾0.1％，硫酸镁0.05％，pH7.0～7.2。培养条件：取斜面保存的枯草芽孢杆菌接种于液态种子液培养基，37℃，150rpm培养，每两小时取样600nm条件下测OD值。对数生长期在6-16h。确定接种发酵培养基的时间为8小时。并测定生长曲线，见图1。

3、固态培养(发酵培养)

发酵培养基：新鲜豆粕20g，加水比1∶1.2，水的pH7.0。用水浸泡3-4h。

接种与培养条件：以10％的种子液接种量，将种子液接入固态培养基中，培养温度37℃，培养箱湿度65％RH，培养24小时，并测定生长曲线，每2小时取样，检测活菌数，见图2。每2小时取样，每10g培养基用50ml生理盐水，在4℃下浸提4小时后，4500rpm 20min离心取上清液，按酶活测定方法测纳豆激酶活力，见图3。由图可知，最佳发酵时间为24小时。

4、含不同浓度豆粕发酵培养基灭菌情况

实例1

豆粕不加蒸馏水浸泡，经121℃高压灭菌20min。

结果：豆粕发生褐变，少部分豆粕成焦糊状。

实例2

豆粕以1∶1.2加水比加入蒸馏水，拌匀，浸泡3-4h后，经121℃高压灭菌20min。

结果：豆粕褐变程度较轻。

实例3

豆粕以1∶1.2加水比加入蒸馏水，拌匀，浸泡3-4h后，经115℃高压灭菌30min。

结果：豆粕褐变程度较轻。

实例4

豆粕以1∶1.2加水比加入蒸馏水，拌匀，浸泡3-4h后，经110℃高压灭菌20min。

结果：豆粕未发生褐变，灭菌后无杂菌。

以例4灭菌方式灭菌发酵培养基，能够达到最佳灭菌效果，也解决了培养基灭菌后发生褐变的问题。

5、产纳豆激酶枯草芽孢杆菌TK-1发酵生产纳豆激酶的方法，实施例如下

以下实施例用的种子液为步骤1中获得的种子液。

实施例1

发酵培养基：新鲜豆粕20g，加水比1∶1.2，水的pH7.0。用水浸泡3-4h。

接种与培养条件：以10％的种子液接种量，将种子液接入固态培养基中，用无菌镊子夹碎培养基，并搅拌，使种子液和培养基混匀，培养温度37℃，培养箱湿度65％RH。培养24h。

测得酶活为5670FU/g干基

实施例2

发酵培养基：新鲜豆粕20g，加水比1∶2，水的pH7.5。用水浸泡3-4h。

接种与培养条件：以10％的种子液接种量，将种子液接入固态培养基中，用无菌镊子夹碎培养基，并搅拌，使种子液和培养基混匀，培养温度37℃，培养箱湿度65％RH。培养24h。

测得酶活为2500FU/g干基

实施例3

发酵培养基：新鲜豆粕20g，加水比1∶1.2，水的pH7.0。用水浸泡3-4h。

接种与培养条件：以10％的种子液接种量，将种子液接入固态培养基中，用无菌镊子夹碎培养基，并搅拌，使种子液和培养基混匀，培养温度40℃，培养箱湿度65％RH。培养24h。

测得酶活为2250FU/g干基

实施例4

发酵培养基：新鲜豆粕20g，加水比1∶1.2，水的pH7.0。用水浸泡3-4h。

接种与培养条件：以20％的种子液接种量，将种子液接入固态培养基中，用无菌镊子夹碎培养基，并搅拌，使种子液和培养基混匀，培养温度37℃，培养箱湿度65％RH。培养24h。

测得酶活为4250FU/g干基

实施例5

发酵培养基：新鲜豆粕20g，加水比1∶1，水的pH7.0。用水浸泡3-4h。

接种与培养条件：以10％的种子液接种量，将种子液接入固态培养基中，用无菌镊子夹碎培养基，并搅拌，使种子液和培养基混匀，培养温度37℃，培养箱湿度65％RH。培养24h。

测得酶活为3550FU/g干基

结果

以酶活高低为依据，发酵培养基确定为：新鲜豆粕20g，加水比1∶1.2(重量比)，水的pH7.0。用水浸泡3-4h；接种与培养条件为：以10％的种子液接种量，将种子液接入固态培养基中，用无菌镊子夹碎培养基，并搅拌，使种子液和培养基混匀，培养温度37℃，培养箱湿度65％RH，培养24h。

本发明中测定酶活所用的方法和试剂如下：

酶活测定：粗酶液制备：1克发酵物用5ml无菌生理盐水在4℃下，浸提4小时，浸提液经 4500rpm离心20分钟，上清液即为粗酶液。

酶活单位的定义：一个酶活性单位(FU)定义为：在指定实验流程的条件下，1分钟，滤液在275nm处的吸光度值增加0.01所需的酶量。

所用试剂及配置方法如下：

(1)0.05mol/L硼酸盐缓冲液(pH8.5，含NaCl)：19.07gNa₂B₄O₇·10H₂O和9.0gNaCl溶于900ml蒸馏水中。用高浓度盐酸调节pH，用蒸馏水定容至1000ml。

(2)0.2mol/L三氯醋酸(TCA)溶液：用蒸馏水中溶解32.68gTCA，定溶至1000ml。

(3)0.72％纤维蛋白原溶液：用吸液管吸取10ml0.05mol/L硼酸盐缓冲液于爱伦美氏瓶，加入96mg纤维蛋白原(SIGMA，FIBRINOGEN(Fraction I)Type I-S：From Bovine Plasma，PRODUCT NUMBER F8630)，瓶子始终保持站立。用玻璃棒碾碎不溶物直至完全溶解。用滤纸过滤混合物(ADVANTEC，No.6，7cm)，移除不溶物。准备使用。(注释I)。

(4)凝血酶溶液：用0.05mol/L硼酸盐缓冲液溶解凝血酶(SIGMA，From Bovine Plasma，PRODUCT NUMBER T6634)，制成1000U/mL溶液。一点一点的分装到瓶子里，冷冻保存。使用前，凝血酶在0.05mol/L硼酸盐缓冲液中混匀。

(5)1mol/L醋酸溶液：用蒸馏水溶解60.1g醋酸，定溶至1000ml。

(6)1mol/L醋酸盐缓冲液(pH6.0)：用蒸馏水溶解129.6g CH₃COONa·3H₂O。加入47.6ml1mol/L醋酸溶液，并用蒸馏水定容至1000ml。

(7)10％Triton X-100溶液：在蒸馏水中加热溶解10g Triton X-100，并用蒸馏水定容至100ml。(注释II)

(8)稀释液：用蒸馏水溶解0.344g(最终浓度2mmol/L)CaSO₄·2H₂O和0.585g(最终浓度10mmol/L)NaCl。加入2.0ml 1mol/L醋酸缓冲液(pH6.0)，0.5ml(最终浓度0.005％)10％Triton X-100溶液，用蒸馏水定容至1000ml。

准备样品溶液

用稀释液稀释样品使滤液的校正吸光度值在0.04和0.08之间。浓缩液浓度通常在0.67-1.33FU/g之间。

实验步骤

1.将1.4ml 0.05mol/L硼酸盐缓冲液和0.4ml 0.72％纤维蛋白原溶液分装到同一个试管中，纤维蛋白原溶液在37±0.3℃水浴箱中提前孵育5分钟。

2.加入0.01ml凝血酶溶液，混匀。(注释III)

3.10分钟之后，加入0.1ml样品溶液，混合5秒，37±0.3℃孵育。

4.反应开始后20和40分钟时，分别混合5秒。

5.60分钟后，加入2ml 0.2mol/L TCA溶液终止反应，37±0.3℃孵育20分钟。

6.将混合液移入微量离心管中，15000rpm离心5分钟。

7.用巴氏吸管小心地将1ml上清液移入玻璃管中，275nm处读取吸光度值(AT)。

(空白试验)

8.将1.4ml 0.05mol/L硼酸盐缓冲液和0.4ml 0.72％纤维蛋白原溶液分装到同一个试管中，纤维蛋白原溶液在37±0.3℃水浴箱中提前孵育5分钟。

9.加入0.01ml凝血酶溶液，混匀。

10.10分钟之后，加入2ml 0.2mol/L TCA溶液，混合5分钟。

11.在混合液中加入0.1ml样品溶液，混合5秒，37±0.3℃孵育20分钟。

12.将混合液移入微量离心管中，15000rpm离心5分钟。

13.用巴氏吸管小心地将1ml上清液移入玻璃管中，275nm处读取吸光度值(AB)。(注释IV)

计算：纳豆激酶活力(FU/g)＝(AT-AB)/0.01*1/60*1/0.1*D，其中D：样品稀释率

注释

I酶活力因纤维蛋白原的份额而不同。因此，当纤维蛋白原的份额变化时，有必要乘以校正系数来校正酶活力。

II室温下，稀释液可以保存15天。

III每次用搅拌器来混合

IV为了检测结果的准确性，标准样品应该在每个检测批同时化验。

以下将结合具体的实施例对本发明的方法进行更具体的描述，但本发明并不限于具体实施例。