枯草芽孢杆菌发酵产纳豆激酶的研究

摘要

纳豆激酶(nattokinase，NK)是日本传统发酵食品纳豆在发酵过程中由纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilsnatto)产生的一种具有纤溶活性的丝氨酸蛋白酶。研究结果表明，纳豆激酶不但有很强的溶栓功能，且还有安全性能好，易被人体吸收，作用迅速，药效时间长，可由微生物直接发酵生产因而造价低廉等优点。 本研究利用目标菌所具有的耐热性及显著的纤溶活性等生物学特性设计选育方案，从国内外的纳豆产品中分离出了1株纳豆激酶高产菌株-NT-6，并以此为出发菌株，通过盐酸羟胺和紫外线复合诱变处理，利福平抗性平板筛选和发酵筛选相结合的方法，获得了一株突变株-NU9012，其产酶能力比诱变前提高了68％，在未经优化的摇瓶发酵条件下，纳豆激酶的酶活力达到了648IU/mL。 在单因素实验和正交试验的基础上，先用Plackett-Burman(PB)方法对影响菌株NU9012液体发酵诸因素的效应进行评价，并筛选出了有显著正效应的木糖浓度和显著负效应的接种量及K2HPO4浓度这3个因素，利用响应面分析法(RSM)确定了它们的最佳工艺参数。实验结果表明，菌株NU9012发酵产NK的最佳培养基组成为：木糖1.88％，胰蛋白胨2.0％，CaC120.03％、MgSO40.05％、K2HPO40.21％和KH2PO40.1％，培养基初始pH值为7.0；最佳的发酵条件为：种龄18h，接种量3.51％，温度30±1℃。装液量100mL/250mL，发酵周期为3d。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章绪论

1.1纳豆激酶溶栓机制的研究

1.1.1血栓的形成及溶栓机制

1.1.2纳豆激酶的溶栓机制

1.2纳豆激酶的研究进展

1.2.1纳豆激酶的基因和蛋白质结构

1.2.2纳豆激酶的酶学性质

1.2.3产纳豆激酶优良菌株的选育

1.2.4纳豆激酶发酵工艺的研究

1.3立题依据和研究内容

1.3.1立题依据

1.3.2研究内容

第2章纳豆激酶高产菌株的选育

2.1引言

2.2材料与仪器

2.2.1菌种来源

2.2.2培养基

2.2.3试剂

2.2.4主要仪器

2.3实验方法

2.3.1产纳豆激酶菌株的分离

2.3.2种子液的制备

2.3.3发酵培养

2.3.4粗酶液的制备

2.3.5纳豆激酶活力的测定方法

2.3.6产纳豆激酶菌株的鉴定

2.3.7菌体生长曲线的绘制

2.3.8诱变育种的方法

2.3.9选育所得菌株产NK能力遗传稳定性的分析方法

2.4结果与讨论

2.4.1产纳豆激酶菌株的分离

2.4.2纤维蛋白平板法酶活标准曲线的绘制

2.4.3产酶菌株的筛选

2.4.4菌株NT-6的鉴定

2.4.5菌株NT-6指数生长期的确定

2.4.6盐酸羟胺对菌株NT-6生长的抑制情况

2.4.7紫外线照射时间对菌株NT-6致死率及正变率的影响

2.4.8利福平浓度的确定

2.4.9菌株NT-6的诱变结果

2.4.10菌株NU9012产NK能力遗传稳定性的分析

2.5小结

第3章菌株NU9012液体发酵条件的优化

3.1引言

3.2材料与仪器

3.2.1菌种

3.2.2培养基

3.2.3试剂

3.2.4主要仪器

3.3实验方法

3.3.1菌种的保存与活化

3.3.2种子液的制备

3.3.3发酵培养

3.3.4粗酶液的制备

3.3.5纳豆激酶活力的测定方法

3.3.6发酵液残糖的测定(费林试剂法)

3.3.7菌体生长曲线的绘制

3.3.8菌株NU9012产纳豆激酶液体发酵条件的优化

3.3.9发酵罐放大实验

3.4结果与讨论

3.4.1纳豆激酶活力测定的方法

3.4.2种龄和接种量对NU9012液体发酵产NK的影响

3.4.3发酵培养基的组成对NU9012产酶的影响

3.4.4液体发酵条件对NU9012产酶的影响

3.4.5应用Plackett-Burman试验设计法筛选影响NU9012发酵产NK的重要因素

3.4.6应用响应面分析法确定重要因素的最佳水平

3.4.7发酵罐放大实验

3.5小结

结论

展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间取得的科研成果