一种蛹虫草白化菌株及其子实体的栽培方法

摘要

本发明涉及一种蛹虫草白化菌株AB6 Cordyceps militaris albino strain AB6 CCTCC NO：M 2011073及其子实体的栽培方法，其特征是通过将上述蛹虫草白化菌株或其新鲜子实体进行组织分离，接入综合PDA斜面培养基制备斜面母种，斜面母种再接至液体培养基中制备一级菌种，一级菌种接入液体培养基中制备生产种，最后生产菌种在生产用培养基中培养获得一种人工栽培的蛹虫草白化子实体得到蛹虫草白色菌株子实体。本发明的蛹虫草白化菌株子实体生物转化率达到30％～45％，其腺苷含量为1～1.16mg/g，虫草素含量为1.5～12.9mg/g，虫草酸含量为10～14.8mg/g，粗蛋白含量为20～28％，粗纤维含量为15～17.2％，可作为食品或原料使用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种蛹虫草菌株，具体来说是涉及一种蛹虫草白化菌株AB6 Cordycepsmilitaris albino strain AB6CCTCC NO：M 2011073及其子实体的栽培方法。

背景技术

传统医学与现代科学研究都表明，冬虫夏草含有多种对人体有益的营养有效成分，例如虫草素、虫草酸、腺苷等，其具有抗菌，抗肿瘤，抗氧化，滋阴壮阳，保肝益肺和提高免疫力等功效，因而越来越受到人们的喜爱，市场需求不断扩大。但野生冬虫夏草产量十分有限，因此急需开发出人工栽培虫草的方法。

发明内容。

本发明的目的在于开发出一种蛹虫草白化菌株，另一目的是开发其白化子实体的栽培方法。

本发明所提供的蛹虫草白化菌株AB6是2008年在蛹虫草子实体栽培过程中以获得的蛹虫草白化子实体通过组织分离优化而获得，并于2011年3月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址是武汉市武昌珞珈山，简称为CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M 2011073。该菌株与产生橙黄色子实体的正常蛹虫草的ITS序列相似率达98％，利用RAPD技术对菌株间差异进行分析，筛选36条随机引物，未获得可区分两菌株的随机引物，可推测两菌株在遗传物质上具有极高的相似性。该菌株菌丝受光照刺激产生黄色色素的能力明显低于正常的蛹虫草，两者在PDA平板上的菌落形态在颜色方面有显著的差别；该菌株经人工培养产生的子实体呈白色，部分子实体可见浅黄色的分生孢子，但无法形成子囊和子囊孢子。

我们通过将上述蛹虫草白化菌株或其新鲜子实体进行组织分离，接入综合PDA斜面培养基制备斜面母种，斜面母种再接至液体培养基中制备一级菌种，一级菌种接入液体培养基中制备生产种，最后生产菌种在生产用培养基中培养获得一种人工栽培的蛹虫草白化子实体，从而实现了本发明的目的。

本发明所述的蛹虫草白化子实体的栽培方法，其特征包括以下的步骤：

(1)将蛹虫草白化菌株AB6 Cordyceps militaris albino strainAB6CCTCC NO：M 2011073或其新鲜子实体进行组织分离，按黄豆大小接入综合PDA斜面培养基，20～25℃下，暗培养4～7天后，光照7～10天，菌丝长满斜面，选取菌丝生长整齐且基生菌丝发达的作为斜面母种，所述的综合PDA培养基pH 5.0～7.0，其原料组成为每1000mL水中加入马铃薯200g，葡萄糖20g，KH₂PO₄3g，MgSO₄·7H₂O 1.5g，维生素B₁0.02～0.05g，琼脂15～20g，其制备方法是按所述组成分别称重后，先将马铃薯去皮切成小条放入锅中，加入3.5～4.5倍质量的水，煮沸20～30分钟左右至马铃薯软而不烂时，用6～8层纱布过滤，取滤汁于锅中，补至原加水量后，加入琼脂熔化，再加入葡萄糖，磷酸二氢钾，硫酸镁和维生素B₁搅拌均匀；

(2)将步骤(1)得到的斜面母种按每100mL培养基接入2～10块黄豆大小的菌块的接种量接至液体培养基中，20～25℃下，100～120r/min，振荡培养5～7天，选取菌丝球大小均匀一致的菌种作为一级菌种，所述的液体培养基pH 6.5～7.0，其组成是每1000mL培养基中含葡萄糖10～30g，蛋白胨2～6g，KH₂PO₄1～4g，MgSO₄·7H₂O 1～4g和余量的水；

(3)将步骤(2)得到的一级菌种按液体培养基体积2％～10％的接种量接入液体培养基中，20～25℃下，100～120r/min，振荡培养3～7天，选取菌丝球大小均匀一致的菌株作为生产菌种；

(4)在无菌的环境下，按生产菌种和水的体积比1∶3～8的比例将步骤(3)得到的生产菌种用水稀释，再按每1000mL生产菌种接种入0.5～1.2kg生产用培养基的比例进行接种，在18～25℃，空气相对湿度50％～65％下，先进行暗培养3～4天，待菌丝长满培养基后，进行光照培养，光强400～10001x，10～12h/d，空气相对湿度80％～90％，18～23℃，经7～14天长出子实体原基，再培养40～50天，待部分子实体顶部变成圆形，或出现孢子时，即进行采收，得到蛹虫草白化子实体，所述的生产种培养基是按1kg大米和1～2L营养液的比例组成，其中每升营养液由碳源10～30g，氮源8～15g，无机磷盐3～7g，以及余量的水组成，pH6.0～7.5。

步骤(2)所述的一级菌种还可以用同样的方法进一步扩大培养为二级菌种。

步骤(4)所述的蛹虫草白化子实体还可以在60℃下烘3～4小时得到干品，以便于保存和再利用，所述的碳源、氮源和无机磷盐是微生物培养基中常用的，碳源可以是可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖等，氮源是蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、甘氨酸或硝酸铵，无机磷盐是NaH₂PO₄或Na₂HPO₄，碳源、氮源和无机磷盐可为食品级或生化试剂级；大米购自农贸市场，大米和营养液混合后，封口，121℃灭菌40min，冷却至室温备用。

本发明的蛹虫草白化子实体的生物转化率达到30％～45％，即每千克培养料能产出300g～450g的新鲜子实体。

本发明的蛹虫草白化子实体含有多种有效成分和营养成分，其腺苷含量为1～1.16mg/g，虫草素含量为1.5～12.9mg/g，虫草酸含量为10～14.8mg/g，粗蛋白含量为20～28％，粗纤维含量为15～17.2％，可作为食品或原料使用。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。

实施例1：

称取马铃薯200g，葡萄糖20g，KH₂PO₄3g，MgSO₄·7H₂O 1.5g，维生素B₁0.02g，琼脂20g，将马铃薯(已去皮)切成小条放入锅中，加入3.5倍质量的水，煮沸20分钟左右至马铃薯软而不烂时，用6层纱布过滤，取滤汁于锅中，补至原加水量后，加入琼脂熔化，再加入葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁和维生素B₁搅拌均匀，调节pH至5.0，趁热按5mL/管的量分装于18mm×180mm试管里，塞上棉塞，包上油纸，于121℃，15磅蒸汽压，灭菌20分钟，冷却到45℃倒成斜面，得到综合PDA斜面培养基。

将新鲜蛹虫草白化子实体进行组织分离，取菌肉按黄豆大小的接种量接入无菌的综合PDA斜面培养基，20℃，暗培养7天后，光照10天，菌丝长满斜面，选取菌丝生长整齐且基生菌丝发达的作为斜面母种直接使用或保藏于4℃下备用。

称取葡萄糖10g，蛋白胨2g，KH₂PO₄1g，MgSO₄·7H₂O1g，将各成分分别用水溶解后混合，调节pH至6.5，用水定容至1升，按装量为50％的比例装入耐高温的容器内，于121℃下，15分钟常规灭菌，冷却至室温，得到液体培养基，备用。

将选取的斜面母种按每100mL培养基10块黄豆大小的菌块的接种量接至无菌液体培养基中，20℃下，100r/min，振荡培养7天，选取菌丝球大小均匀一致的菌种作为一级菌种。

将2mL一级菌种接种至100mL液体培养基中，20℃下，100r/min，振荡培养7天，选取菌丝球大小均匀一致的菌株作为生产菌种。

将葡萄糖10g，蛋白胨8g，NaH₂PO₄3g混合用水定容到1L，pH调节至6.0，得到营养液。将20g大米装入250毫升的玻璃培养瓶内，在加入营养液20mL，混合，用聚乙烯薄膜和橡皮筋封口，121℃灭菌40min，冷却至室温，得到生产用培养基，备用。

在无菌室内，将100mL的生产菌种用300mL的无菌水稀释，再接入50g无菌的生产用培养基中，在18℃，空气相对湿度50％下，先进行暗培养4天，待菌丝长满培养基后，进行光照培养，光强4001x，10h/d，空气相对湿度80％，18℃，经14天即可长出子实体原基，再培养50天，待部分子实体顶部变成圆形，即进行采收，得到蛹虫草白化子实体，将子实体在60℃下烘3小时，即可获得干品(水分含量不高于13％)，便于保存和再利用。

经统计，本次生物转化率达到30％，即每千克培养料能产出300g的新鲜子实体。经检测，得到的蛹虫草白化菌株子实体含腺苷1mg/g，虫草素12.9mg/g，虫草酸10mg/g，粗蛋白28％，粗纤维17.2％。

实施例2：

称取马铃薯200g，葡萄糖20g，KH₂PO₄3g，MgSO₄·7H₂01.5g，维生素B₁0.05g，琼脂15g，将马铃薯(已去皮)切成小条放入锅中，加入4.5倍质量的水，煮沸30分钟左右至马铃薯软而不烂时，用8层纱布过滤，取滤汁于锅中，补至原加水量后，加入琼脂熔化，再加入葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁和维生素B₁搅拌均匀，调节pH至7.0，趁热按10mL/管的量分装于20mm×200mm试管里，塞上棉塞，包上油纸，于121℃，15磅蒸汽压，灭菌30分钟，冷却到50℃倒成斜面，得到综合PDA斜面培养基。

将蛹虫草白化菌株AB6Cordyceps militaris albino strain AB6CCTCC NO：M 2011073从5℃保存下取出，按黄豆大小的接种量接入无菌的综合PDA斜面培养基中，25℃下，暗培养4天后，光照7天，选取菌丝生长整齐且基生菌丝发达的菌种作为活化母种即斜面母种。

称取葡萄糖30g，蛋白胨6g，KH₂PO₄4g，MgSO₄·7H₂O 4g，将各成分分别用水溶解后混合，调节pH至7.0，用水定容至1升，按装量为50％的比例装入耐高温的容器内，于121℃下，15分钟常规灭菌，冷却至室温，得到液体培养基，备用。

将活化母种按每100mL培养基2块黄豆大小的菌块的接种量接至无菌的液体培养基中，25℃下，120r/min，振荡培养5天，选取菌丝球大小均匀一致的菌种作为一级菌种。

将10mL一级菌种接种至100mL液体培养基中，25℃下，120r/min，振荡培养3天，选取菌丝球大小均匀一致的菌株作为生产菌种。

将可溶性淀粉30g，硝酸铵15g，Na₂HPO₄7g混合用水定容到1L，pH调节至7.5，得到营养液。将20g大米装入250毫升的玻璃培养瓶内，再加入营养液40mL，混合，用聚乙烯薄膜和橡皮筋封口，121℃灭菌40min，冷却至室温，得到生产用培养基，备用。

在无菌条件下，将100mL的生产菌种用800mL的无菌水稀释，再接入120g无菌的生产用培养基中，在25℃，空气相对湿度65％下，先进行暗培养3天，待菌丝长满培养基后，进行光照培养，光强10001x，12h/d，空气相对湿度90％，23℃，经7天即可长出子实体原基，再培养40天，待部分子实体出现孢子时，即进行采收，得到蛹虫草白化子实体，将子实体在60℃下烘4小时，即可获得干品(水分含量不高于13％)，便于保存和再利用。

经统计，本次生物转化率达到45％，即每千克培养料能产出450g的新鲜子实体。经检测，得到的蛹虫草白化菌株子实体含腺苷1.16mg/g，虫草素1.5mg/g，虫草酸14.8mg/g，粗蛋白20％，粗纤维15％。