一种新的肋脉羊肚菌M8-13液体发酵物在保健品及医药开发中的应用

摘要

本发明涉及一种新分离的羊肚菌(Morchella)M8-13及其在医药及保健品开发中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种新分离的羊肚菌M8-13及其在医药及保健品开发中的应用。

背景技术

羊肚菌(Morchella sp.)是世界著名的(药)食用菌，在美国被称为“陆地鱼”，欧美一些发达国家认为它是人体营养的高级补品。在世界各地均有分布。羊肚菌子实体含有多种化学成分，据分析测定，每100g干品羊肚菌中含水分12.869g，脂肪3.829g，蛋白质22.069g，其中蛋白质含量是木耳的2倍，香菇的1.5倍(龙正海等，1997)，且极易被人体吸收，这一点是其他高蛋白食品难以比拟的。羊肚菌含有10种氨基酸，特别是人体所必需的氨基酸含量丰富，高出一般食用菌的25％一40％。羊肚菌中维生素和矿物质元素种类齐全，含量高，含维生素B及烟酸、生物素、毗哆醇、叶酸、多种氨基酸等。每100克羊肚菌含矿物质元素钾2.89g，磷1.59g，分别是冬虫夏草的7倍和4倍：锌的含量是香菇的4.3倍，猴头菌的4倍；铁的含量是香菇的31倍，猴头菌的12倍(陈向东等，2002)。羊肚菌中还含有钙、镁、钠、铬等人体所需的元素，尤以有机锗含量高。多种矿物质的存在，使羊肚菌更显得身价不凡。国内外的研究主要集中在多糖、氨基酸和脂肪类化合物，另外关于酶、吡喃酮抗生素、无机元素、色素、醇、甾醇和皂苷类也有报道【1-3】。由于羊肚菌的菌丝体不但含有子实体的各种营养物质和活性成分，而且还能较好的保持子实体独特的风味，并适于工业化发酵生产，所以羊肚菌菌丝体深层发酵研究近年来得到了迅速的发展，开发利用菌丝体、发酵液的报道也很多。深层发酵技术具有易操作、菌丝体增殖快、生产周期短、产量大等优点，以深层发酵菌丝体和发酵液为主要原料提取羊肚菌各种营养成分和活性成分，可明显降低成本，提高生产效率。但是，目前国内还没有成熟羊肚菌菌丝体及多糖等方面的产品上市。

羊肚菌营养丰富具有较高的药用价值，开发出系列保健品将具有广阔的市场前景。野生羊肚菌资源量有限、人工栽培不成功、野生羊肚菌国际市场供不应求等因素，使羊肚菌价格逐年上涨(达2000元/公斤)。因此，通过羊肚菌发酵开发保健品将为解决人类在免疫机能低下、抗药性等多方面医学难题。

大型真菌多糖免疫增强机制主要是从免疫器官、免疫细胞和免疫分子各层次刺激巨噬细胞、淋巴细胞、T淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、杀伤细胞、B细胞，增加他们的数量，增强他们的活性，进而促使免疫系统发挥作用。多糖从免疫器官层次上促进胸腺和脾脏的生长和分化，增加他们的重量，进而促进免疫器官中的T细胞、B细胞和巨噬细胞的数量增加。多糖从免疫细胞层次上促进T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、杀伤细胞、自然杀伤细胞的成熟、分化和分泌。羊肚菌科(Morchellaceae)，不仅营养丰富，风味独特，羊肚菌还具有较高的药效，其菌体内含有大量的多糖等成分，具有较强抗肿瘤作用，调节免疫功能，抗疲劳，并能减轻癌症患者放化疗引起的毒副作用。由此可见，羊肚菌是是一种具有开发前景的珍稀食用菌，并可出口创汇，其在医药、食品、健品、化妆品等领域具有较高的应用价值。羊肚菌含有较高的蛋白质碳水化合物多种氨基酸多种维生素等营养成分；与冬虫夏草功能相同，是一种不含任何激素无任何副作用的天然补品，常吃不但可提高免疫力，还可消除面部的色斑黄斑雀斑使皮肤变白变嫩[2]。但目前，对羊肚菌有效成分的提取与纯化研究尚不够深入，关于羊肚菌对细菌等的抑制作用基本没有查到相关报道。

现有技术中的问题

羊肚菌作为一种珍稀食药用真菌，其研究仍停留在形态学和生态学水平，对其营养生化特征的研究很少。国内至今没有对羊肚菌多糖进行过较系统研究。近几年，国内学者对羊肚菌多糖的研究取得了一定进展。贾建会等^[11]以深层发酵的羊肚菌菌丝体和发酵液为主要原料提取羊肚菌多糖，对影响多糖提取率的几个因素分别进行了对比实验，并对多糖进行了纯化及组分鉴定。魏芸等^[12]从液体深层发酵所得的羊肚菌发酵液中提取了3种羊肚菌纯多糖，分析了其组分和结构。李群^[13]用蒽酮比色法进行了羊肚菌多糖含量的测定，为羊肚菌多糖的深入研究奠定了基础。

而羊肚菌菌丝体在营养成分上与子实体相当^[15]。由于羊肚菌不能进行大规模的人工栽培，因此在食用羊肚菌子实体的同时，人们更侧重于羊肚菌菌丝体的发酵研究。

1958年J.Sguest首次在发酵罐内培养羊肚菌菌丝球，并进行了25000加仑的生产试验，上世纪60年代以来，美、法等国开始大规模生产其菌丝体，用以制造调味品，其产品深受消费者的欢迎。目前^[14]国外已经能够进行500L以下规模的发酵生产，并出现了专门适于羊肚菌发酵的设备。我国研究虽然较为滞后，目前仍处于中小试阶段，但近年来研究取得了较大的进展。人们对羊肚菌液体菌种、液体培养基进行了广泛的研究：刘士旺等^[16](1998)探索了羊肚菌液体培养条件并筛选了培养基，赵良启等^[17](1999)通过摇瓶正交试验研究了尖顶羊肚菌液体发酵的合适条件。而今，人们都致力于寻找羊肚菌菌丝的最优发酵条件，以求羊肚菌菌丝产量达到更高，使效益更高。

发明内容

在实践中已经证明，只有获得较高活力、生产性能优良的菌株，才有可能实现成功发酵和生产，降低生产成本。通过自然选育淘汰活力差、发酵能力弱的菌株，为进一步菌株改良和发酵生产打下一个坚实的起点和基础。因此，本发明从菌种选育着手，主要对本实验室已有的24株羊肚菌进行产多糖和菌丝体干重的初步筛选。从菌种方面的优势作为以后大规模发酵生产的前提，旨在提高胞外多糖量的同时生物量也达到较高水平。

在一个实施方案中，本发明提供了一种肋脉羊肚菌(MorchellaCostata)M8-13，其保藏号为CGMCC3899。

在另一个实施方案中，本发明提供了所述肋脉羊肚菌M8-13用于发酵生产肋脉羊肚菌菌丝体的用途。

在另一个实施方案中，本发明提供了所述肋脉羊肚菌M8-13或其菌丝体在制备保健品中的用途。优选地，其中所述保健品用于：降血脂、抑氧化、抗辐射、抗肿瘤、增强免疫功能、抗疲劳，以及减轻癌症患者放化疗引起的毒副作用。

在另一个实施方案中，本发明提供了所述肋脉羊肚菌M8-13或其菌丝体在制备用于治疗疾病药物中的用途。优选地，其中所述疾病包括：肿瘤、高血脂、免疫功能失调。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种用所述肋脉羊肚菌M8-13或其菌丝体发酵生产真菌多糖的方法，包括：

(1)发酵培养所述肋脉羊肚菌M8-13的孢子；

(2)离心沉淀步骤(1)的发酵液中多糖；

(3)提取并纯化步骤(2)中沉淀的多糖。

优选地，其中步骤(3)的提纯方法为水提醇沉法。

在另一个实施方案中，本发明提供了所述肋脉羊肚菌M8-13或其菌丝体在用于抑菌的药物的制备中的用途，优选地，其中所述细菌为金黄色葡萄球菌。

附图说明

图1示出了羊肚菌M8-13子实体(左)及培养的菌丝体(右)。

图2示出了羊肚菌M8-13固体培养物(左)及M8-13胞内物质对金黄色葡萄球菌的抑制(中)，对照菌株(右)。

图3示出了M8系列羊肚菌生物量的比较，小写字母表示5％差异显著水平，大写字母表示1％差异显著水平；相同字母表示差异不显。

图4示出了M8系列羊肚菌第5天产胞外多糖的比较，小写字母表示5％差异显著水平，大写字母表示1％差异显著水平；相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著。

图5示出了M8和M9系列羊肚菌第5天产胞内多糖的比较，小写字母表示5％差异显著水平，大写字母表示1％差异显著水平；相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著。

具体实施方式

本发明的菌株的筛选、鉴定、多糖的测定筛选、抗菌活性的筛选等都是在中国，青海西宁，青海大学谢占玲教授的实验室中进行的。羊肚菌是世界著名的野生食(药)用菌，肉质脆嫩鲜美、营养和药用价值极高，故在食品、医药、保健、化妆品等领域显示出极大的开发潜力。近年来，由于人工砍伐森林、水土流失、鼠害、人类的过度活动及对经济利益追逐等，青藏高原羊肚菌资源急剧减少。

本发明的发明人收集并成功分离纯化青藏高原羊肚菌属24株分离株纯培养物(分别属黄羊肚菌和黑羊肚菌涵盖了5-6个种)，试验菌株：M8和M9系列菌由青海大学生物科学系微生物实验室2008年5月和2009年5月从青藏高原采羊肚菌分离得到。发明人还选用羊肚菌51009(Morchella esculenta 51009，中国农科院)菌株做对照。

实施例1羊肚菌的收集

将采集自青藏高原的羊肚菌表面处理干净，用95％的乙醇擦拭后，放于干净的平皿或广口瓶中，置于烘箱中40℃下，待孢子大量弹出后，挑取其孢子，在PDA(土豆20％、蔗糖2％、琼脂1.5-2％，pH自然)平板上划线。25℃培养一天后用显微镜观察，待观察到有单个孢子萌发后，再将萌发处的培养基切下转移于另一PDA平板上。保存在PDA斜面培养基中。

发明人对这些菌株进行液体培养，所有菌株都先在PDA固体培养基上活化，液体发酵培养基(KH₂PO₄ 0.1％，MgSO₄ 0.1％，蔗糖2％，蛋白胨0.5％)，再其转到150mL三角瓶装的液60mL的液体发酵培养基中，在25℃下、100r/min的条件下进行培养。

在所培养的24株羊肚菌中，对其生物量、胞外多糖及其对应黄色葡萄球菌的抑制作用进行研究。通过对其形态学特征的分析(子实体的形态特征，例如菌丝体的宽度和生长习性)及它的ITS序列，鉴定菌株肋脉羊肚菌(Morchella Costata)M8-13。对23株羊肚菌进行了胞内和胞外抗菌实验筛选，供试菌种为乳酸大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌；并用蒽酮硫酸法测定了23株羊肚菌的菌丝体胞内多糖含量。

实施例2筛选生物量及胞外多糖产量高的菌株：

将斜面液体石蜡封存的菌种转接至PDA固体培养基上，25℃下恒温光照培养，其中M8系列和M51009培养5天。在PDA培养基中进行菌种活化后，再将其转到150mL三角瓶装液60mL的液体发酵培养基中，每种菌株做3个平行对照，25℃和100r/min的条件下进行培养。

(1)胞外多糖的沉淀：

分别将培养到第3天、第4天、第5天的羊肚菌发酵液吸出4mL，以3500r/min离心15min，每个离心管吸3mL上清液，加入9mL无水乙醇，-10℃沉淀24小时。

(2)胞外多糖的测定：

将沉淀的多糖以3500r/min离心15min，弃上清，加入3mL蒸馏水在60℃水浴中溶解，稀释30倍，配成多糖溶液，用蒽酮硫酸法测定多糖，取多糖溶液2mL，置于冰水浴5min后，在冰水浴中加蒽酮显色剂(蒽酮∶H₂SO₄＝1g∶500mL，待蒽酮溶解后即成)6mL，混匀，沸水浴15min，然后再次置于冰水浴中5min，室温下平衡10min，使用UV-9200紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)在620nm处比色，结果如图4所示。葡萄糖标准曲线方程为：y＝9.5256x-0.0027(R²＝0.9993)

表1菌株的胞外多糖含量

(3)菌丝体干重的测定：

将发酵8天的发酵液以纱布过滤以获得菌丝体，用蒸馏水反复冲洗3次，置烘箱中55℃下烘至恒重，称重，结果如图3所示。

表2菌株的菌丝体干重

实施例3胞内多糖测定：

称取0.020g左右干燥的羊肚菌菌丝体，分两次添加共1mL水研磨，煮沸提取30min，冷却后2500r/min离心20min。取上清液置于一离心管中，再向残渣中加1mL水，煮沸提取30min，收集上清液置于上述同一离心管中。于上清液中加入7mL无水乙醇使多糖析出，沉淀30min后以2500r/min离心20min，弃去上清液，残渣再加3.5mL乙醇搅拌清洗后同样离心弃去上清液。用约80℃热水将沉淀溶解，冷却后定容至2mL，蒽酮硫酸法测定多糖，同上，参见图5。

实施例4分离菌株M8-13菌株的纯化：

分离菌株M8-13的样品来自于羊肚菌属子实体孢子分离物。是通过在筛选培养基上一系列的次代培养而纯化。筛选培养基包含0.6％蛋白胨，0.1％K₂HPO₄，0.05％MgSO₄·7H₂O，和1％葡萄糖，pH 7.0。在28℃下培养3-5天。然后将生长良好的菌落通过次代培养转接到新鲜PDA培养基上。从均匀生长的菌落上，用接种环挑取一环转接到液体发酵培养基：KH₂PO4 0.1％，MgSO₄ 0.1％，蔗糖2％，蛋白胨0.5％。在25℃下，以100rmp的转速在摇床中培养。为了保藏，菌株被接种到PDA培养基上于4℃条件下保存。

实施例5羊肚菌M8-13形态学和分子学上的鉴定：

将羊肚菌M8-13的菌丝体在PDA培养基上持续培养5天，用来测量形态学特征，如菌丝宽度，孢子的形成和孢子的形状。用CTAB法(vanBurik et al.，1998)从在PDA培养基上生长5天的菌丝体中提取基因组DNA，利用具有正向ITS5引物，5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’和ITS4反向引物5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’PCR以Yang et al.(2007)方法扩增ITS DNA。测序后通过NCBI BLAST数据库对PCR产物进行序列分析。通过和其他菌株ITS序列的比较，结合形态学特征，根据序列相似度确定其分类地位。

ITS的PCR反应体系均采用以下体系：

PCR反应体系(25μL)

ITS基因PCR扩增程序如下：

1)预变性：94℃1min

2)变  性：94℃15s

退  火：58℃15s

延  伸：72℃1min

30个循环

3)补  平：72℃5min

PCR结束后取5μL扩增产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，紫外灯下检测并记录扩增产物在琼脂糖凝胶上的条带。所用试剂均购自上海生工。

从图1中可见，M8-13的菌丝体呈现典型的白色的干的羽绒状，遍及菌落各处(Fig.3A)。菌丝体由许多间隔组成((Fig.3B).)。为了鉴定羊肚菌8-13，它的菌丝体接种到固体培养基固体上，在25℃培养6天满皿。

在和18S核糖体基因部分序列相关的基因组鉴定，提取菌株M8-13中的基因组DNA作为PCR扩增的模板，通过PCR技术，扩增内部转录间隔区1，5.8S核糖体RNA基因，内部转录间隔区2和28S核糖体RNA基因部分序列。PCR扩增出的序列信息在NCBI数据库中被用来做BLAST研究。BLAST结果显示M8-13分析区段，其中99％和肋脉羊肚菌相一致。结合形态学和分子学的分析，我们将M8-13件定为肋脉羊肚菌，并根据菌种保藏的规则于2010年6月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所邮编：100101)，保藏号：CGMCC3899。

数据处理与误差分析：

采用DPS数据处理软件进行误差分析：对不同菌株之间显著性检验采用Duncan新复极差多重比较法。

实施例6羊肚菌M8-13抑菌试验：

(1)供试菌培养及制备：将保存的乳酸大肠杆菌(青海省畜牧兽医科学院提供)、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌转接至牛肉膏蛋白胨固体培养基上进行活化，置于25℃智能光照培养箱中培养18h。然后从中挑取细菌转接到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃下100r/min培养10h，得到各种原菌液。吸取20μL原菌液(分别为乳酸大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的原菌液)与180μL羊肚菌的发酵液(发酵液分别取培养到第3、4、6、8天)混匀，制成供试菌液1。用于胞外物质抗菌筛选。

(2)羊肚菌M8-13的发酵液进行筛选抗菌实验：

取50μL供试菌液1涂布于牛肉膏蛋白胨培固体养基上，25℃培养18h。菌落计数。每个受试样做2个平行实验，并做对照(20μL的供试菌液加180μL的蒸馏水)。

(3)羊肚菌菌丝体进行的抑菌试验筛选：

a.抗菌滤纸片制备

取0.010g干燥的羊肚菌菌丝体，加0.3mL水研磨。将已灭菌并干燥过的圆形滤纸片(d＝9.00mm)放入研磨好的菌丝体液体中，浸泡30min。

b.抑菌圈大小的测定

吸取20μL供试菌液1均匀涂布到牛肉膏蛋白胨平板上，涂匀。每个平板上贴两个抗菌滤纸片，滤纸片离平皿边缘至少15.00mm。置于25℃智能光照培养箱中培养18h后取出，用直尺测量抑菌圈直径。对照为M51009。

结果：

根据多糖产量、菌丝体生物量、抑菌试验等综合判断，筛选出羊肚菌M8-13菌株为最佳菌株，可用于保健食品及药品的开发研究。羊肚菌M8-13菌株的培养特征见表3，子实体及菌丝体见图1。抑菌试验结果见表4，图2。

表3羊肚菌M8-13菌株的培养特征

+++”表示液体发酵培养中菌丝球数目在25左右

表4羊肚菌M8-13液体发酵菌丝体对金黄色葡萄球菌的抑制作用

羊肚菌M8-13对金黄色葡萄球菌的抑制作用较好，对乳酸大肠杆菌和枯草芽孢杆菌没有明显的抑制作用；羊肚菌M8-13，发酵第八天菌丝体干中可达5.867g/L，发酵第3天胞外多糖可达0.299g/L，菌丝体胞内物质对金黄色葡萄球菌的抑菌圈达到20毫米。平均生长速度每天8.0mm，菌丝体直径6.64-11.96μm，见表5，图3，图4。

表5羊肚菌M8-13液体发酵胞内、胞外多糖及生物量

这种菌株具有很强的医药保健品开发潜能。

参考文献(REFERENCES)

[1]兰进，曹文苓，徐锦堂.中国羊肚菌属真菌资源[J].资源科学，1999，21(2)：56-61.

[2]李娟，王臻，姚良同，等.羊肚菌多糖研究进展[J].微生物学杂志，2005，25(4)：89-91.

[3]陈向东，朱戎，兰进.羊肚菌研究进展[J].食用菌学报，2002，9(2)：56-61.

[4]刘敏莉.羊肚菌等野生菌无机元素分析[J].中国野生植物资源，1994，(2)：42-44.

[5]高尚士.保健珍品——羊肚菌[J].特种经济动植物，2000(3)：38.

[6]李华.羊肚菌子实体部分化学成分研究[D].吉林：吉林农业大学硕士学位论文，2006.05.01.

[7]白岚.真菌多糖的研究进展——真菌多糖的结构、提纯和应用[J].河北林果.

[8]Jeng-Leun Mau，Shih-JengHuang，Chin-Chu Chen.Antioxidant properties of methanolic extracts from Grifola frondosa，Morchella esculenta and Termitomyces albuminosus mycelia[J].FoodChemistry，2004，111-118.

[9]孙晓明，张卫明，吴素玲，等.羊肚菌抗疲劳作用研究[J].中国野生植物资研，2009，24(4)：445-448.

[10]唐茂芝，贝峰.食用菌类食品作为功能性食品的优势和特点[J].食品科技，1999，7(3)：5-6.

[11]贾建会，吕晓莲，樊利青.深层发酵羊肚菌多糖的提取分离及纯化研究[J].食品科学，2002，23(4)：59-62.

[12]魏芸，张天佑.羊肚菌多糖的分离纯化及组成结构分析[J].植物资源与环境学报，2000，9(2)：14-17.

[13]李群.蒽酮比色法测定羊肚菌多糖及试验评价[J].中国卫生检验杂志，2000，10(1)：31-32.

[14]付晓燕.羊肚菌菌丝体培养及菌丝分化研究[D].北京：首都师范大学，2006.05.20.

[15]赵桂云，马庆斌.羊肚菌液体培养基配方的研究[J].食用菌，2002，6：15-16.

[16]刘士旺，梁宗琦，刘爱英.羊肚菌液体培养研究初报[J].食用菌学报，1998，5(3)：31-37.

[17]赵良启，李志强，侯桂香.羊肚菌液态发酵的研究.菌物系统，1999，18(1)：94-99.

[18]欧超，王娣，李正鹏.羊肚菌液体深层发酵条件[J].食品与生物技术学报，2007，26(2)：26-33.

[19]王莹，孙永梅，孟祥艳.粗柄羊肚菌液体培养条件的优化[J].食用菌.2007(6)：6-8.

[20]邢增涛，孙芳芳，刘景圣.尖顶羊肚菌液体培养条件的研究[J].食用菌学报，2004，11(4)：38-43.

[21]张广伦，张卫明.羊肚菌的研究和利用[J].中国野生植物资源，1999，18(1)：1-4.

[22]宋椒艘，邹作华，王洪荫，等.EF-11营养液的研侧及其保健作用的试验研究[J].究食品科学，1996，17(7)：52-57.