利用乳酸菌生产γ-氨基丁酸的半连续发酵方法

摘要

本发明公开了一种利用乳酸菌生产γ-氨基丁酸的半连续发酵方法。该方法包括如下步骤：将乳酸菌接种到MRSG培养基中，然后采用分段添加底物、分段控温和分段控氧的方式进行发酵，得到所述γ-氨基丁酸；所述MRSG培养基的溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质组成：葡萄糖7-12g/L，蛋白胨20-30g/L，牛肉提取物30-40g/L，硫酸锰0.05-1g/L，维生素B6 0.01-0.05g/L，谷氨酸钠2-5g/L。采用本发明提供的方法，γ-氨基丁酸的产量可达到13.1-38.7g/L。

说明书

技术领域

本发明涉及利用乳酸菌生产γ-氨基丁酸的半连续发酵方法。

背景技术

γ-氨基丁酸广泛分布于从哺乳动物到单细胞有机生物体中，可以由谷氨酸脱羧酶转化L-谷氨酸或谷氨酸盐而成。研究证明，γ-氨基丁酸是中枢神经系统的抑制性神经递质，具有重要的生理功能，诸如降低血压、促使精神安定、促进脑部血流、增进脑活力、营养神经细胞、增加生长激素分泌、健肝利肾、改善更年期综合症等。2007年日本可口可乐公司推出了面向大众的，具有放松和抗紧张效果的γ-氨基丁酸功能性饮料“AQUARIUSSHARPCHARGE”。日本原装进口的PFI GABA RelaxS(伽玛氨基丁酸片)，其中主要成分是γ-氨基丁酸，可以舒缓和抑制过度兴奋和激烈的神经信息传导，从而使人安定平和下来。饲料中添加γ-氨基丁酸可增强猪甲状腺功能，缓解高温应激对甲状腺的不良影响，从而增强动物的基础代谢率、促进蛋白质的合成，而动物生长期体重的增加主要是蛋白质的增加。以美国的柏瑞特Dr.Brandt皱痕舒展霜(网上俗称γ-氨基丁酸霜)为例，因为加入了13％的γ-氨基丁酸用来放松神经以阻断对肌肉的牵动，立即减少细皱纹，以及因为压力产生的纹路，对紧致肌肤有非常好的效果。

γ-氨基丁酸的制备，一般分为化学合成、植物富集提取和生物合成三大类。其中化学合成γ-氨基丁酸的方法很多，但成本较高，反应条件不易控制，安全性较差。植物富集提取方法生产γ-氨基丁酸是以植物为原料，经过富集、提取、分离、提纯制得，虽然比化学方法易操作，但由于植物γ-氨基丁酸含量较低，成本仍然较高。而生物合成方法具有操作条件温和、成本低的特点，因此在实际生产中，与化学合成法和分离提取法相比具有很大的优势。

目前发现，具有谷氨酸脱羧酶活性的微生物菌种主要有大肠杆菌，乳酸菌以及曲霉菌等。大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶活性最高，但是其存在安全卫生方面的隐患。乳酸菌是一类普遍认为安全的细菌，广泛用于食品加工中。乳酸菌具有多种生理功能，如调节肠道菌群，增强免疫力，抑菌抗氧化，降低血压等。所以本发明采用实验室筛选的具有高谷氨酸脱羧酶活性的乳酸菌进行发酵。

研究表明，谷氨酸脱羧酶是一种诱导酶，该酶的合成受到氧气的抑制，但是乳酸菌的生长繁殖却需要氧气。因此，为了诱导谷氨酸脱羧酶产生，进一步提高谷氨酸脱羧酶的活性，又不影响乳酸菌的生长，必须在发酵过程中不断调节发酵液中氧气的含量以提高γ-氨基丁酸的产量。另外，乳酸菌的最适生长温度与最适发酵温度不同，也需要在发酵过程中不断地调节发酵温度。基于这些因素，为了达到γ-氨基丁酸产量的最大化，应该在发酵过程中将分段控氧和分段控温两者结合起来，但目前未见到这方面的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生产γ-氨基丁酸的方法。

本发明提供的方法包括如下步骤：将乳酸菌接种到MRSG培养基中，然后采用分段添加底物、分段控温和分段控氧的方式进行发酵，得到所述γ-氨基丁酸；所述MRSG培养基的溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质组成：葡萄糖7-12g/L，蛋白胨20-30g/L，牛肉提取物30-40g/L，硫酸锰0.05-1g/L，维生素B6 0.01-0.05g/L，谷氨酸钠2-5g/L。

进一步，上述MRSG培养基的溶质是如下1)或2)：

1)葡萄糖710.92g/L，蛋白胨20-29.67g/L，牛肉提取物30-39.66g/L，硫酸锰0.05-0.06g/L，维生素B6 0.01-0.02g/L，谷氨酸钠2g/L；

2)葡萄糖10.92-12g/L，蛋白胨29.67-30g/L，牛肉提取物39.66-40g/L，硫酸锰0.06-1g/L，维生素B60.02-0.05g/L，谷氨酸钠2g/L。

上述MRSG培养基的pH值可为3.8-4.8。

上述分段添加底物包括如下步骤：在发酵的第12-24小时、30-42小时、50-62小时和70-82小时时分别往所述MRSG培养基中加入谷氨酸脱羧酶的底物。

进一步，上述谷氨酸脱羧酶的底物的加入量为每升MRSG培养基加入5-20g；所述谷氨酸脱羧酶的底物为L-谷氨酸或谷氨酸盐(如谷氨酸钠)。

上述分段控温包括如下步骤：在发酵过程中的前12-24小时内控制发酵温度35-39℃，优选是37℃；然后控制发酵温度28-32℃，优选是30℃。

上述分段控氧包括如下步骤：在发酵过程中的前12-24小时内控制发酵体系为兼性厌氧环境；然后控制发酵体系为厌氧环境。

上述兼性厌氧环境为密闭搅拌，厌氧环境为通氮气搅拌。

上述发酵的时间为90-106小时。

上述乳酸菌是乳酸菌NBRC 12005。

本发明的特点是：

(1)本发明采用的MRSG培养基为实验室优化后得到，其中谷氨酸钠含量为2-20g/L，既可以保证诱导谷氨酸脱羧酶产生，又有利于减少氢氧化钠的用量，有利于在下游工程对γ-氨基丁酸进行分离提取。

(2)本发明采用在不同时间添加底物，底物添加时间为12-24h，30-42h，50-62h，70-82h；分段控温：发酵前12-24h，温度控制37℃，然后，将温度控制为30℃进行发酵；分段控氧：发酵前12-24h，兼性厌氧发酵，然后进行厌氧发酵。发酵90-102h终止后，发酵液中γ-氨基丁酸产量为13.1-38.7g/L。

(3)乳酸菌的生长繁殖需要好氧，而谷氨酸脱羧酶是一种诱导酶，它需要在厌氧的条件由底物谷氨酸钠诱导产生，氧气充足时抑制其诱导产生，甚至不产生。因此本发明在发酵前12-24h进行兼性厌氧发酵，一方面有利于乳酸菌的大量生长繁殖，另一方面有利于谷氨酸脱羧酶的诱导产生。谷氨酸脱羧酶利用底物谷氨酸钠发酵生产γ-氨基丁酸需要在厌氧的条件下进行，氧气能抑制谷氨酸脱羧酶的活性，因此本发明在第一次流加谷氨酸钠后采用厌氧的方式进行发酵。

(4)乳酸菌的最适生长温度是37℃，乳酸菌的最适发酵温度是30℃，所以本发明采用分段控温的方式进行发酵：发酵前12-24h，温度控制37℃，然后将温度控制为30℃。一方面有利于乳酸菌的大量生长繁殖，另一方面有利于乳酸菌利用底物谷氨酸钠生产γ-氨基丁酸。

(5)本发明所用的方法安全，环保，反应条件温和。

具体实施方式

实施例中所用的试剂和原料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1

一、种子液的制备

将一环乳酸菌NBRC 12005冻干粉接入100mL灭菌的MRS培养基中，30℃，160r/min摇瓶培养24h。再以5％的接种量接种到100mL灭菌的MRS培养基中，33℃，160r/min摇瓶培养24h，得到种子液。

其中：MRS培养基的组分为：酪蛋白胨10g/L，牛肉提取物10g/L，酵母提取物5g/L，葡萄糖5g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸二胺0.2g/L，吐温0.1g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，pH 6.5。

二、半连续发酵产γ-氨基丁酸

将种子液以5％的接种量接种到1L的MRSG培养基中，采用分批添加底物、分段控温、分段控氧的组合发酵：在发酵12h，30h，50h，70h分别加入5g的谷氨酸钠到发酵液中。发酵开始至12h内，温度控制37℃，兼性厌氧发酵；发酵第12-92h，温度控制30℃，厌氧发酵。

其中MRSG培养基是：葡萄糖7g/L，蛋白胨20g/L，牛肉提取物30g/L，硫酸锰0.05g/L，维生素B₆ 0.01g/L，谷氨酸钠2g/L，pH3.8。

总发酵时间92h，发酵终止，γ-氨基丁酸产量为13.1g。

实施例2

一、种子液的制备

步骤与实施例1相同。

二、半连续发酵产γ-氨基丁酸

将种子液以5％的接种量接种到1L的MRSG培养基中，采用分批添加底物、分段控温、分段控氧的组合发酵：在发酵16h，36h，56h，76h分别加入10g的谷氨酸钠到发酵液中。发酵开始至16h内，温度控制37℃，兼性厌氧发酵；发酵第16-96h，温度控制30℃，厌氧发酵。

其中MRSG培养基是：葡萄糖10.92g/L，蛋白胨29.67g/L，牛肉提取物39.66g/L，硫酸锰0.06g/L，维生素B₆ 0.02g/L，谷氨酸钠2g/L，pH4.8。

总发酵时间96h，发酵终止，γ-氨基丁酸产量为27.6g。

实施例3

一、种子液的制备

步骤与实施例1相同。

二、半连续发酵产γ-氨基丁酸

将种子液以5％的接种量接种到1L的MRSG培养基中，采用分批添加底物、分段控温、分段控氧的组合发酵：在发酵24h，42h，62h，82h分别加入20g的谷氨酸钠到发酵液中。发酵开始至24h内，温度控制37℃，兼性厌氧发酵；发酵第24-106h，温度控制30℃，厌氧发酵。

其中MRSG培养基是：葡萄糖12g/L，蛋白胨30g/L，牛肉提取物40g/L，硫酸锰1g/L，维生素B₆0.05g/L，谷氨酸钠2g/L，pH4.8。

总发酵时间106h，发酵终止，γ-氨基丁酸产量为38.7g。