抗前列腺癌的雄性激素受体拮抗剂

摘要

本发明抗前列腺癌的雄性激素受体拮抗剂，涉及一类硫代咪唑二酮，其两个氮原子都有取代基团；而且涉及使用这样的化合物作为药物治疗雄性激素受体相关的疾病或失调，例如前列腺癌、脱发或青春痘。

说明书

技术领域

本发明涉及一类硫代咪唑二酮，其两个氮原子都有取代基团；而且涉及使用这样的化合物作为药物治疗雄性激素受体(Androgen Receptor，‘AR’)相关的疾病或失调，例如前列腺癌、脱发或青春痘。

背景技术

雄激素受体(androgen receptor，AR)是一个有11万道尔顿分子量的配体依赖性的反式转录调节蛋白，属于甾体激素核受体超家族成员，主要存在于靶细胞的核内。雄性激素受体无论是在前列腺癌的病源还是它的恶化过程都扮演非常重要的作用。它和特殊的甾体激素配基如睾硐或者更有效的双氢睾硐(DTH)在配体结合域的结合，导致构象变化，从而与热休克蛋白(hsp)解离，引起雄激素受体活化使之与DNA亲和力增高，活化的雄激素受体以二聚体形式与靶细胞核中特定的DNA序列-雄激素反应元件(ARE)结合，并且向细胞核内移动与其它转录因子相互作用，从而调节靶基因的表达，对细胞的增殖、生存和分化产生相应的生物效应。雄性激素受体在许多男性荷尔蒙相关的疾病中扮演重要角色，例如前列腺癌、良性前列腺肿大、青春痘和男性脱发等。

具有选择性的雄性激素受体拮抗剂(AR antagonist)的主要作用是直接阻止睾硐或双氢睾酮(DHT)与雄激素受体结合，阻断雄激素对细胞的作用，使细胞产生“饥饿”现象，从而使细胞凋亡。其可用于：a)男性避孕；b)治疗一系列男性荷尔蒙相关的失调例如性欲过强和性欲失调；c)治疗包括良性前列腺肿大、青春痘、秃顶和毛发增生等病症；d)防止与雄性激素减少相关的症状例如去势后的发热；e)专门用于防止或抑制变性妇女在转性治疗过程中的肌肉增长；f)抗癌变生长药物以及配合激素疗法治疗前列腺癌；g)预防、阻止或消除前列腺癌。

前列腺癌在男性恶性肿瘤中高居发病率第一死亡率第二，仅2008年美国就有186320个新的前列腺癌患者被诊断而26660病人因此丧生。中国的发病率虽然远低于西方，但随着生活水平和诊断技术的不断提高，前列腺癌的发病率呈不断上升趋势。前列腺癌是一种进展比较迅速的恶性肿瘤，如果得不到早期诊治，从发现症状开始，平均存活期只有3～5年。在前列腺癌治疗的具体方法上，手术去势{根治性前列腺切除术(TLRRP)，经尿道前列腺切除术(TURP)和双侧睾丸切除术}和药物去势{促黄体生成激素释放激素(LHRH)拮抗剂和促性腺激素释放激素(GnRH)拮抗剂}是初期治疗首选手段，同时结合内分泌、免疫、分化、基因和放射等治疗方法。雄激素大部分来自睾丸，少部分来自肾上腺；外科去势只能去除来自睾丸的雄激素，肾上腺仍然可分泌大量甾体产生一些雄激素进入前列腺组织并释放至血液中。前列腺癌对雄激素有较高的敏感性。为了达到治疗前列腺癌的目的，必须抑制雄激素的合成，阻止与细胞核内的雄激素受体(AR)的相互作用，从而阻断雄激素的生理作用。通常的雄激素阻断治疗(ADT)主要围绕着雄激素产生的下丘脑-垂体-睾丸这个性腺轴进行，药物治疗分为：1)内分泌轴阻断治疗；2)直接抑制雄激素合成和3)雄激素受体拮抗剂。雄激素受体拮抗剂(AR Antagonist)与抗雄性激素药物合用，是现阶段控制去势失效的前列腺癌(Castration Resistant Prostate Cancer，简称CRPC)最有效的药物治疗方法，它对大多数的晚期前列腺癌开始都非常有效，但是前列腺癌细胞最终会适应低浓度雄性激素的环境而对治疗产生耐药性，结果在三至五年内前列腺癌几乎在所有的这些病人中都会复发并导致死亡。

雄性激素受体拮抗剂(AR antagonist)药物例如尼鲁米胺(Niluamide)、氟他胺(Flutamide)和比卡鲁胺(Bicalutamide，商标名Casodex)的最初设计是用来避免激素疗法的副作用以及消除前列腺癌病人的耐药性。尽管这些雄性激素受体拮抗剂在与激素疗法配合使用时对首次接受治疗的晚期前列腺癌病人效果良好，但无论作为单独使用还是复合疗法它们对抗药性的前列腺癌疗效十分有限。近年来研究表明，比卡鲁胺作为雄激素受体(AR)拮抗剂的特异性较弱，并有一定的激活受体作用(agonism)(氟他胺也被发现有类似的问题)。最新研究显示雄性激素受体信号通道的重新活化可能是对激素疗法产生抗药性的根本原因，其限制了目前市场普遍使用的雄性激素受体拮抗剂药物例如比卡鲁胺治疗前列腺癌的疗效，特别是对于晚期抵抗性前列腺癌。此外，这些雄性激素受体拮抗剂药物的疗效还普遍受限于它们显著的副作用，例如对肝脏或中枢神经系统有毒性。所以，前列腺癌临床治疗迫切需要高活性低毒性且无残余激活性质(agonism)的新一代雄性激素受体拮抗剂。本发明中，在化学结构上取代如三氟甲基苯腈和三氟甲基硝基苯的经典雄性激素受体结合元素，有可能提高特异性并减少或消除现在临床上使用的雄性激素受体拮抗剂药物的副作用(例如对肝脏或中枢神经系统的毒性)，这些化合物能与雄激素受体结合，抑制受体向细胞核内移动和降低其转录活性，有望成为治疗晚期前列腺癌的雄性激素受体拮抗候选药物。

发明内容

本发明包括具有如下化学结构通式(I)的化合物，使用这类化合物(包括它们的盐)及其药物组合物作为雄性激素受体拮抗剂(AR antagonist)的方法。

具有化学结构通式(I)的化合物：

其中R₁选自

其中R’是甲基、乙基或CF₃；Y是甲基、CF₃、氰基或卤素；

其中W是氧原子、硫原子或两个氢原子；

其中R₃和R₄是各自独立的甲基或它们一起形成一个C_3-5的环烷基；

其中R₂选自诸如苯基的芳香基及其取代物、诸如吡啶的杂芳香基及其取代物、烷基及其取代物、诸如3-或4-吡啶或者四氢吡喃或者3-吡咯烷或者四氢呋喃的饱和杂环及其取代物。

具有化学结构通式(I)的化合物，R₁选自

其中R’是甲基、乙基或CF₃；Y’是甲基、CF₃；

其中R₃和R₄一起形成C_3-5的环烷基。

具有化学结构通式(I)的化合物，R₁选自

Y”是氰基或卤素。

具有化学结构通式(I)的化合物，其中R₂是芳香基并具有如下取代基团：-C(O)NHR”、-C(O)OR”、-SO₂Me、-SO₂NHR”、氰基、羟基、烷氧基、-C(S)NHR”、-C(O)OR”、卤素或5至6元杂芳香基；其中R”选自氢原子、C_1-6的烷基、C_1-6的环烷基或C_1-6的烯基。

具有化学结构通式(I)的化合物，其中R₂是杂芳香基并具有如下取代基团：-C(O)NHR”、-C(O)OR”、-SO₂Me、-SO₂NHR”、氰基、羟基、烷氧基、-C(S)NHR”、-C(O)OR”、卤素或5至6元杂芳香基；其中R”选自氢原子、C_1-6的烷基、C_1-6的环烷基或C_1-6的烯基。

以上的化合物，具有如下化学结构通式(II)

其中R₁’选自

其中R’是甲基、乙基或CF₃；Y’是甲基、CF₃；

其中R₃’和R₄’一起形成C_3-5的环烷基；

其中B选自氰基、甲基、CF₃或卤素；

其中A选自-C(O)NHCH₃、-C(O)NH₂、-C(O)OCH₃、-C(O))CH₂CH₃、氰基、羟基、烷氧基、-SO₂Me、甲基、-SO₂NHMe或-SO₂NH₂；

其中W是氧原子。

化合物也可以具有如下化学结构通式(III)

其中R₁”选自

Y”是氰基或卤素；

其中B选自氰基、甲基、CF₃或卤素；

其中A选自-C(O)NHCH₃、-C(O)NH₂、-C(O)OCH₃、-C(O))CH₂CH₃、氰基、羟基、烷氧基、-SO₂Me、甲基、-SO₂NHMe或-SO₂NH₂；

其中W是氧原子。

化合物也可以具有如下化学结构式

本发明包括合成上面描述化合物的方法。

使用以本发明中的化合物或其可药用盐或前药为活性成分的药物组合物，治疗与雄性激素受体活性相关病症的方法，包括治疗前列腺癌(包括对激素疗法敏感和不敏感的病人)、脱发、暗疮及青春痘等。

附图说明

附图1是小鼠口服实例6化合物后的药动力学，显示了血液药物浓度随时间的变化。

具体实施方式

化合物的合成

本发明具有化学结构通式(I)的化合物可用下面描述的合成路线及条件来制备。

通用合成路线1

如上通用合成路线1所示，异硫氰酸酰酯3(isothiocyanate)可以通过苯胺1与硫光气(thiophosgene)反应得到。中间体6的制备是通过在有TMSCN或氰化钠存在的情况下对苯胺4(或烷基氨)和酮5进行脱水。这步缩合反应也可以通过在有硫酸镁存在的情况下用苯胺4(或烷基氨)和相应的酮氰醇(ketonecyanohydrin)进行反应。最终的产物硫代乙内酰脲(化学结构通式I)可从中间体3和中间体6的反应中得到。苯胺或烷基氨1可以购买得到或用已知文献方法制备(例如还原硝基苯)。

实例1的合成

4-异硫氰酸-3-三氟甲氧基-苄腈(中间体3a)的合成

在硫光气(4.21g，36.6mmol)的水悬浮液(30mL)中慢慢加入4-氨基-2-甲基-苄腈1a(5g，34.9mmol)。将得到的混合物在室温(25oC)搅拌一小时后用乙酸乙酯萃取三次(3×25mL)。合并有机层，水洗(1×50mL)，干燥(MgSO4)，真空抽干得到浅褐色固体3a(中间体7，6.5g，100％收率)，直接用于下一步反应。

2-氟-N-甲基-4-硝基-苯甲酰胺(中间体8)的合成

将氯化亚砜(15g，130mmol)缓慢的滴入2-氟-4-硝基-苯甲酸7(20g，110mmol)的二甲基甲酰胺(DMF，20mL)溶液在-5℃。搅拌1小时后逐滴加入甲胺(400mL，800mmol)。缓慢升温到室温。到入125ml冰水，乙酸乙酯萃取，盐水洗涤，硫酸镁干燥，浓缩，结晶得到黄色固体化合物8(20g，90％)。¹H NMR(acetone-d₆，500MHz)δ(ppm)7.66(1H，dd，J＝8.5，8.5Hz)，6.41(1H，dd，J＝8.6，2.1Hz)，6.32(1H，dd，J＝13.6，2.0Hz)，3.05(3H，d，J＝4.4Hz)。质谱：163(M+H⁺)。

4-氨基-2-氟-N-甲基-苯甲酰胺(中间体9)的合成

将化合物8(3g，15.1mmol)溶解在乙酸乙酯和乙酸(12mL+12mL)的溶液中。加入8g铁粉回流，LCMS检测，直至反应结束，冷却到室温。过滤固体，用50mL的乙酸乙酯洗涤固体，合并有机相，盐水洗涤，硫酸镁干燥，浓缩，得到黄色固体化合物9(2.5g，97％)。¹H NMR(acetone-d₆，500MHz)：δ(ppm)7.69(1H，dd，J＝8.7，8.8Hz)，7.15(1H，s)，6.51(1H，dd，J＝8.6，2.1Hz)，6.38(1H，dd，J＝14.7，2.1Hz)，5.70(1H，br s)，2.88(3H，d，J＝4.3Hz)。质谱：169(M+H⁺)。

4-(1-氰基-环丁氨基)-2-氟-N-甲基-苯甲酰胺(中间体10)的合成

将TMS-CN(29.7g，300mmol)，环丁酮(14g，200mmol)，化合物9(16.8g，100mmol)溶解在200mL乙酸中，加热80℃24小时。反应结束后加入200mL水，用乙酸乙酯萃取，盐水洗涤，硫酸镁干燥浓缩，用正己烷和乙醚(20mL-20mL)洗涤，过滤得到产物10(20g，84％)。¹H NMR(CDCl₃，300MHz)：δ(ppm)7.92(1H，dd，J＝8.4，8.4Hz)，6.76(1H，q，J＝4.3Hz)，6.48(1H，dd，J＝8.3，1.9Hz)，6.29(1H，dd，J＝14.3，1.9Hz)，4.72(1H，br s)，2.97(3H，d，J＝4.4Hz)，2.85-2.75(2H，m)，2.4-2.35(2H，m)，2.3-2.15(1H，m)，1.95-1.85(1H，m)。质谱：246(M-H)。

4-[7-(4-氰基-2-三氟甲氧基-苯基)-8-氧代-6-硫代-5，7-二氮杂螺[3，4]辛烷-5-基]-2-氟-N-甲基-苯甲酰胺(实例1)的合成

实例1

将化合物10(392mg，1.58mmol)和3a(494mg，2.02mmol)溶解在DMF(5mL)，微波加热110℃，12h。加入甲醇(10mL)and HCl(2N，5mL)加热回流1h。乙酸乙酯萃取，盐水洗涤，硫酸镁干燥，浓缩。PE∶EA/1∶1过柱得到化合物实例1(250mg，25％)。¹H NMR(CDCl₃，500MHz)：δ(ppm)8.30(1H，dd，J＝8.6，3.5Hz)，7.70(2H，dd，J＝8.0，1.5Hz)，7.63(1H，d，J＝8.5Hz)，7.26(1H，m)，7.15(1H，dd，J＝11.5，1.5Hz)，6.60(1H，br s)，3.00(3H，d，J＝5Hz)，2.65(2H，m)，2.52(2H，m)，2.27(1H，m)，1.70(1H，m)。质谱：493(M+H)。

4-[7-(4-氰基-2-氟-苯基)-8-氧代-6-硫代-5，7-二氮杂螺[3，4]辛烷-5-基]-2-氟-N-甲基-苯甲酰胺(实例2)的合成

实例2

实例2是用类似合成实例1的方法通过中间体10和7b的反应得到(收率：23％)，7b是用类似合成7a的方法从相应的苯胺反应得到。¹H NMR(CDCl₃，500MHz)：δ(ppm)8.30(1H，dd，J＝8.6，3.5Hz)，7.57(3H，m)，7.26(1H，m)，7.15(1H，dd，J＝12.0，2.0Hz)，6.71(1H，br s)，3.00(3H，d，J＝5Hz)，2.65(2H，m)，2.52(2H，m)，2.27(1H，m)，1.70(1H，br m).质谱：427(M+H⁺)。

4-[7-(4-氰基-2-甲基-苯基)-8-氧代-6-硫代-5，7-二氮杂螺[3，4]辛烷-5-基]-2-氟-N-甲基-苯甲酰胺(实例3)的合成

实例3

实例3是用类似合成实例1的方法通过中间体10和7c的反应得到(收率：21％)，7c是用类似合成7a的方法从相应的苯胺反应得到。¹H NMR(CDCl₃，500MHz)：δ(ppm)8.30(1H，dd，J＝8.6，3.5Hz)，7.67(2H，m)，7.38(1H，d，J＝8.0Hz)，7.26(1H，m)，7.20(1H，dd，J＝11.5，2.0Hz)，6.71(1H，br s)，3.00(3H，d，J＝5Hz)，2.65(2H，m)，2.52(2H，m)，，2.15(3H，s)，2.15(1H，m)，1.68(1H，br m).质谱：423(M+H⁺)。

4-[7-(4-氰基-2-三氟甲基-苯基)-8-氧代-6-硫代-5，7-二氮杂螺[3，4]辛烷-5-基]-2-氟-N-甲基-苯甲酰胺(实例4)的合成

实例4

实例4是用类似合成实例1的方法通过中间体10和7d的反应得到(收率：22％)，7d是用类似合成7a的方法从相应的苯胺反应得到。¹H NMR(CDCl₃，500MHz)：δ(ppm)8.30(1H，dd，J＝8.6，3.5Hz)，8.12(1H，d，J＝1.5Hz)，8.01(1H，dd，J＝8.5，2.0Hz)，7.58(1H，d，J＝8.0Hz)，7.26(1H，m.br)，7.15(1H，dd，J＝11.5，2.0Hz)，6.71(1H，br s)，3.00(3H，d，J＝5Hz)，2.70(2H，m)，2.52(2H，m)，2.15(1H，m)，1.68(1H，br m)。质谱：477(M+H⁺)。

4-[7-(4-氰基-2-氯-苯基)-8-氧代-6-硫代-5，7-二氮杂螺[3，4]辛烷-5-基]-2-氟-N-甲基-苯甲酰胺(实例5)的合成

实例5

实例5是用类似合成实例1的方法通过中间体10和7e的反应得到(收率：23％)，7e是用类似合成7a的方法从相应的苯胺反应得到。¹H NMR(CDCl₃，500MHz)：δ(ppm)8.39(1H，t，J＝9.0Hz)，7.89(1H，s)，7.72(1H，dd，m)，7.54(1H，d，J＝8.0Hz)，7.26(1H，m.br)，7.20(1H，d，J＝11Hz)，6.71(1H，br s)，3.00(3H，d，J＝5Hz)，2.70(2H，m)，2.52(2H，m)，2.26(1H，m)，1.69(1H，m，br)。质谱：443(M+H⁺)。

4-[7-(4-氰基-3-甲氧基-苯基)-8-氧代-6-硫代-5，7-二氮杂螺[3，4]辛烷-5-基]-2-氟-N-甲基-苯甲酰胺(实例6)的合成

实例6

实例6是用类似合成实例1的方法通过中间体10和7f的反应得到(收率：20％)，7f是用类似合成7a的方法从相应的苯胺反应得到。¹H NMR(CDCl₃，500MHz)：δ(ppm)8.39(1H，t，J＝9.0Hz)，7.62(1H，d，J＝8.0Hz)，7.26(1H，m.br)，7.18(1H，d，J＝10.0Hz)，7.10(2H，m)，6.71(1H，br s)，3.97(3H，s)，3.00(3H，d，J＝5Hz)，2.70(2H，m)，2.52(2H，m)，2.26(1H，m)，1.69(1H，br m).。质谱：439(M+H⁺)。

4-[7-(3，4-二氰基-苯基)-8-氧代-6-硫代-5，7-二氮杂螺[3，4]辛烷-5-基]-2-氟-N-甲基-苯甲酰胺(实例7)的合成

实例7

实例7是用类似合成实例1的方法通过中间体10和7g的反应得到(收率：20％)，7g是用类似合成7a的方法(反应温度为0℃)从相应的苯胺反应得到。¹HNMR(CDCl₃，500MHz)：8.39(1H，t，J＝9.0Hz)，8.00(1H，d，J＝2.0Hz)，7.90(2H，m.br)，7.26(1H，m.br)，7.18(1H，dd，J＝11.5，2.0Hz)，6.71(1H，brs)，3.00(3H，d，J＝5Hz)，2.70(2H，m)，2.52(2H，m)，2.26(1H，m)，1.62(1H，m，br)。质谱：434(M+H⁺)。

下列实例是以类似于合成实例1-7的方法，采用平行化学的方式合成得到。

实例8：4-[7-(4-氰基-3-三氟甲氧基-苯基)-8-氧代-6-硫代-5，7-二氮杂螺[3，4]辛烷-5-基]-2-氟-N-甲基-苯甲酰胺。质谱(ESP)：493(M+H⁺)。

下列实例是以类似于合成实例1的方法，采用平行化学的方式合成得到，其中苯胺中间体9被其它相应的苯胺取代。

实例9：4-[5-(3-氟-4-甲基-苯基)-8-氧代-6-硫代-5，7-二氮杂螺[3，4]辛烷-7-基]-苯邻二腈。质谱(ESP)：391(M+H⁺)。

实例10：4-(8-氧代-6-硫代-5-对甲苯基-5，7-二氮杂螺[3，4]辛烷-7-基)-苯邻二腈。质谱(ESP)：373(M+H⁺)。

实例11：4-[5-(3-氟-4-甲基-苯基)-8-氧代-6-硫代-5，7-二氮杂螺[3，4]辛烷-7-基]-2-甲氧基-苯腈。质谱(ESP)：396(M+H⁺)。

实例12：2-甲氧基-4-(8-氧代-6-硫代-5-对甲苯基-5，7-二氮杂螺[3，4]辛烷-7-基]-苯腈。质谱(ESP)：378(M+H⁺)。

实例13：2-甲氧基-4-[5-(6-甲基-吡啶-3-基)-8-氧代-6硫代-5，7-二氮杂螺[3，4]辛烷-7-基]-苯腈。质谱(ESP)：379(M+H⁺)。

实例14：2-甲氧基-4-[5-(6-甲氧基-吡啶-3-基)-8-氧代-6硫代-5，7-二氮杂螺[3，4]辛烷-7-基]-苯腈。质谱(ESP)：395(M+H⁺)。

实例15：4-[5-(4-氟-苯基)-8-氧代-6-硫代-5，7-二氮杂螺[3，4]辛烷-7-基]-2-甲氧基-苯腈。质谱(ESP)：382(M+H⁺)。

实例16：2-甲氧基-4-[8-氧代-6-硫代-5-(4-三氟甲基-苯基)-5，7-二氮杂螺[3，4]辛烷-7-基]-苯腈。质谱(ESP)：432(M+H⁺)。

实例17：4-[5-(4-氯-苯基)-8-氧代-6-硫代-5，7-二氮杂螺[3，4]辛烷-7-基]-2-甲氧基-苯腈。质谱(ESP)：399(M+H⁺)。

实例18：4-[5-(3，4-二氟-苯基)-8-氧代-6-硫代-5，7-二氮杂螺[3，4]辛烷-7-基]-2-甲氧基-苯腈。质谱(ESP)：400(M+H⁺)。

实例19：4-[5-(3-氟-4-氰基-苯基)-8-氧代-6-硫代-5，7-二氮杂螺[3，4]辛烷-7-基]-2-甲氧基-苯腈。质谱(ESP)：407(M+H⁺)。

实例20：2-甲氧基-4-(8-氧代-6-硫代-5，7-二氮杂螺[3，4]辛烷-7-基]-苯腈。质谱(ESP)：364(M+H⁺)。

实例21：4-[7-(4-氰基-3-甲氧基-苯基)-8-氧代-6-硫代-5，7-二氮杂螺[3，4]辛烷-5-基]-苯甲酸甲酯。质谱(ESP)：422(M+H⁺)。

实例22：4-[7-(4-氰基-3-甲氧基-苯基)-8-氧代-6-硫代-5，7-二氮杂螺[3，4]辛烷-5-基]-苯甲酸乙酯。质谱(ESP)：436(M+H⁺)。

实例23：4-[5-(4-羟甲基-苯基)-8-氧代-6-硫代-5，7-二氮杂螺[3，4]辛烷-7-基]-2-甲氧基-苯腈。质谱(ESP)：394(M+H⁺)。

下列实例是以类似于合成实例1的方法，采用平行化学的方式合成得到，其中的中间体环丁酮被丙酮或丙酮氰醇取代。

实例24：4-[3-(3，4-二氰基-苯基)-5，5-二甲基-4-氧代-2-硫代-咪唑烷-1-基]-2-氟-N-甲基-苯甲酰胺。质谱(ESP)：422(M+H⁺)。

实例25：4-[3-(3-氟-4-甲基-苯基)-4，4-二甲基-5-氧代-2-硫代-咪唑烷-1-基]-苯邻二腈。质谱(ESP)：379(M+H⁺)。

实例26：4-(4，4-二甲基-5-氧代-2-硫代-3-对甲苯基-咪唑烷-1-基]-苯邻二腈。质谱(ESP)：361(M+H⁺)。

实例27：4-[4，4-二甲基-3-(6-甲基-吡啶-3-基)-5-氧代-2-硫代-咪唑烷-1-基]-苯邻二腈。质谱(ESP)：362(M+H⁺)。

实例28：4-[3-(6-甲氧基-吡啶-3-基)-4，4-二甲基-5-氧代-2-硫代-咪唑烷-1-基]-苯邻二腈。质谱(ESP)：378(M+H⁺)。

实例29：4-[3-(4-氟-苯基)-4，4-二甲基-5-氧代-2-硫代-咪唑烷-1-基]-苯邻二腈。质谱(ESP)：365(M+H⁺)。

实例30：4-[4，4-二甲基-5-氧代-2-硫代-3-(4-三氟甲基-苯基)-咪唑烷-1-基]-苯邻二腈。质谱(ESP)：415(M+H⁺)。

实例31：4-[3-(4-氯-苯基)-4，4-二甲基-5-氧代-2-硫代-咪唑烷-1-基]-苯邻二腈。质谱(ESP)：382(M+H⁺)。

实例32：4-[3-(3，4-二氟-苯基)-4，4-二甲基-5-氧代-2-硫代-咪唑烷-1-基]-苯邻二腈。质谱(ESP)：383(M+H⁺)。

实例33：4-[3-(4-氰基-3-氟-苯基)-4，4-二甲基-5-氧代-2-硫代-咪唑烷-1-基]-苯邻二腈。质谱(ESP)：390(M+H⁺)。

实例34：4-(4，4-二甲基-5-氧代-3-苯基-2-硫代-咪唑烷-1-基)-苯邻二腈。质谱(ESP)：347(M+H⁺)。

实例35：4-[3-(3，4-二氰基-苯基)-5，5-二甲基-4-氧代-2-硫代-咪唑烷-1-基]-苯甲酸甲酯。质谱(ESP)：405(M+H⁺)。

实例36：4-[3-(3，4-二氰基-苯基)-5，5-二甲基-4-氧代-2-硫代-咪唑烷-1-基]-苯甲酸乙酯。质谱(ESP)：419(M+H⁺)。

实例37：4-[3-(4-羟甲基-苯基)-4，4-二甲基-5-氧代-2-硫代-咪唑烷-1-基]-苯邻二腈。质谱(ESP)：377(M+H⁺)。

体外生物活性分析

本发明所涉及的化合物可以成为新一代雄激素受体拮抗剂。与目前前列腺肿瘤药物市场最常用的雄激素受体拮抗剂比卡鲁胺相比，我们首选的化合物是具有更有效的雄激素受体的拮抗活性和最小的或难以观察到的激动活性的雄激素受体拮抗剂。正如我们在发明背景部分所讨论的，高选择性的雄激素受体拮抗剂可有效的用于治疗雄激素受体有关的疾病，特别是对于激素疗法敏感的和激素疗法难治性的前列腺癌，以及青春痘和男性脱发等等。在实际临床使用时，本发明的化合物可以是单独或与一个或多个其它治疗药物结合使用。

本发明化合物对雄激素受体拮抗(antagonism)和激动(agonism)作用的检测可以通过在激素敏感的前列腺癌细胞(比如LNCaP，LAPC4)和激素难治性的前列腺癌细胞(比如LNCaP-AR，LAPC4-AR，LNCaP C4-2，22RV1，VCaP，LNCaP-AI和LNCaP-abl)来加以确认。我们首先选用的细胞，一是LNCaP，常用的激素疗法敏感的前列腺细胞模型；二是22RV1，常用的激素疗法难治的前列腺细胞模型。它们都表达雄激素受体，而且雄激素能诱导其前列腺特异抗原(Prostate-SpecificAntigen，PSA)的表达，并能促进这些细胞的生长。前列腺特异抗原是前列腺癌的一个重要生理指标，受到雄激素受体的调控，所以在相应的前列腺癌细胞模型上检测前列腺特异抗原(PSA)的水平可以用来比较我们所发明的化合物对雄激素受体功能的拮抗能力，同时细胞的生长抑制实验(采用MTT方法)也可用于评价这些化合物的前列腺癌症细胞生长的抑制能力。进一步在小鼠和大鼠等啮齿动物上测试我们所发明的化合物的口服药代动力学，以优选具有良好体内药动性质和稳定性的化合物，使之成为具有临床前景的前列腺癌候选药物。这些高选择性有效的雄激素受体拮抗剂也会在前列腺癌的动物模型进行体内药效的比较和评估，可供选择的前列腺癌体内模型包括LNCaP，LAPC4，LAPC9，CWR22，LNCaP-AR，LNCaP C4-2，VCaP，22RV1，LNCaP-abl和LNCaP-AI，以兼顾反应激素敏感的和激素难治性的前列腺癌临床实际病例。

前列腺特异性抗原(PSA)抑制试验

为了检测我们所发明的化合物对雄激素受体的拮抗活性，我们在多种前列腺癌细胞上测定这些化合物对前列腺特异性抗原(PSA)的抑制活性，用人工合成的雄激素R1881(Methyltrienolone，雄激素受体激活剂)有效诱导PSA在细胞里的表达以增加抑制实验的敏感性。前列腺癌LNCaP和22RV1细胞是雄激素依赖性细胞，均可以从美国菌种保藏库(ATCC)购买。这两种细胞可在RPMI 1640培养液并含10％胎牛血清(FBS)，100单位/毫升的青霉素，100微克/毫升的链霉素和0.25微克/毫升的两性霉素B中培养生长，细胞需要保持在二氧化碳培养箱以保证37℃温度和5％二氧化碳的生长条件。传代在20至35次之间的LNCaP细胞和传代在30至50次之间的22RV1细胞可以用于本实验。LNCaP是一种激素敏感的细胞株，而22RV1是一种激素难治性的前列腺癌细胞株。为了检测前列腺特异性抗原(PSA)，首先将人类前列腺癌LNCaP或22RV1细胞转移培养至含有10％经过木炭处理的胎牛血清(Charcoal-stripped FBS)的RPMI 1640培养液，培养三天后，以每孔五千个细胞的浓度分配于标准96孔细胞培养板。次日，在每孔培养液里加入最终浓度为50微微摩尔(pM)浓度的人工合成的雄激素R1881和一定浓度梯度(最终浓度为0.001-10微摩尔浓度)的测试化合物或比卡鲁胺(作为对比化合物)。加入化合物后继续培养四天，用酶联免疫法(ELISA法)测定在上清培养液之的前列腺特异性抗原(PSA)浓度。酶联免疫(ELISA)试验可以灵敏检测细胞培养液中的前列腺特异性抗原的水平。具体实验过程是，在抗体覆盖的96孔板上加入培养液和标准品(每孔为200微升)，将该板置于保持500-600转速的滴点板振动器在室温下反应二个小时，然后冲洗96孔板五次；然后用缓冲液以一比二十的将HRP结合物进行稀释，再添加至每一个96孔板。这个96孔ELISA板在室温下连续震荡三十分钟并且像上一步一样冲洗五次，然后加入100微升的TMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺，浓度0.4克/升)，接着ELISA振动十分钟，加入100微升终止液来停止反应。使用光吸收酶标仪在450纳米光波(650纳米光波作为参考)来测量ELISA 96孔板，根据酶联免疫(ELISA)试剂盒提供的标准品所得到的标准曲线来推算每个96反应孔分泌到上清培养液的前列腺特异性抗原的浓度，最后计算出所测试的化合物和比卡鲁胺对激素疗法敏感的前列腺癌细胞LNCaP和激素疗法难治的前列腺癌细胞22RV1的前列腺特异性抗原(PSA)的百分之五十抑制浓度(IC₅₀)，其结果如表1所示。

表1：前列腺特异性抗原(PSA)测试数据

  化合物实例  LNCaP  IC₅₀(nM)  22RV1  IC₅₀(nM)  比卡鲁胺  1450  4720  化合物实例1  580  890  化合物实例2  510  630  化合物实例3  610  540  化合物实例4  450  1240  化合物实例5  750  1530  化合物实例6  190  210  化合物实例7  320  350  化合物实例8  220  250  化合物实例9  250  340  化合物实例10  120  180  化合物实例11  80  210  化合物实例12  150  260  化合物实例24  190  320  化合物实例25  100  190

  化合物实例  LNCaP  IC₅₀(nM)  22RV1  IC₅₀(nM)  化合物实例26  110  290

如表1所明确显示，在这些具有一致中心结构的化合物进行取代基的变化可以导致化合物在对雄激素受体的拮抗活性上的改变。不少化合物如这些实例化合物，与比卡鲁胺相比较，无论是在激素敏感(LNCaP)还是激素难治(22RV1)的前列腺癌细胞，对前列腺特异性抗原(PSA)的产生了抑制作用，特别是化合物实例6-12和24-26，其对雄激素受体的拮抗活性得以很大提高，有望在治疗前列腺癌方面成为比比卡鲁胺高效的新型化合物，并可能在其它与雄性激素受体相关的疾病例如青春痘和男性脱发等发展成为有效的治疗药物。

前列腺癌细胞生长抑制试验

前列腺癌LNCaP和22RV1细胞可以在RPMI 1640培养液并含10％胎牛血清(FBS)，100单位/毫升的青霉素，100微克/毫升的链霉素和0.25微克/毫升的两性霉素B中分裂生长，当细胞达到80-90％汇合时，传代培养。为了测试我们的化合物对前列腺癌细胞的生长抑制能力，首先将人类前列腺癌LNCaP或22RV1细胞转移培养至含有10％经过木炭处理的胎牛血清(Charcoal-stripped FBS)的RPMI1640培养液，培养三天后，将细胞以每孔十万个数目于100微升体积加入标准96孔细胞培养板上，置于37℃温度的二氧化碳细胞培养孵化器过夜。小心移去细胞培养液，然后在每孔加入80微升预热的培养液，和10微升有一定浓度梯度(最终浓度从20至0.1微摩尔浓度)的测试化合物或比卡鲁胺作为对比化合物，在37℃温度下保持30分钟，最后在每孔加上10微升人工合成的雄激素R1881(最终浓度为50微微摩尔(pM)浓度)，接着在37℃温度下保持96小时。培养结束时，在每孔中加入10微升MTT反应液，继续在37℃温度下培养细胞二至四小时，使得在存活细胞中染料和线粒体脱氢酶的反应的得以完全，肉眼可以看见紫色的沉淀物。然后在96孔细胞培养板的每孔中加入100微升的洗涤试剂，室温下避光保持二小时，最后用酶标仪来检测其在570nm的吸收。实验结果的表达为测试化合物的抑制百分比，其增加的倍数是以在没有测试化合物含人工合成的雄激素R1881的测试数值作为100％基数进行标准化调整。据此计算百分之五十抑制(IC₅₀)值，结果如表2所示。

表2：细胞MTT实验数据

  化合物实例  LNCaP  IC₅₀(μM)  22RV1  IC₅₀(μM)  比卡鲁胺  5.7  8.9  化合物实例1  3.6  3.9  化合物实例6  0.9  1.2  化合物实例7  1.8  3.0

  化合物实例  LNCaP  IC₅₀(μM)  22RV1  IC₅₀(μM)  化合物实例10  0.8  2.9  化合物实例12  1.5  3.9  化合物实例24  2.9  3.0  化合物实例26  2.9  3.6

与正在临床广泛使用的比卡鲁胺相比较，我们在表2所举例的化合物，无论是对激素敏感前列腺癌细胞LNCaP还是对激素难治的细胞22RV1的生长产生更为有效的抑制作用。这些对癌细胞抑制活性较高的化合物例如实例6、10和12值得我们对其在体内外稳定性，药代动力学行为和体内抑制前列腺癌生长进行进一步研究，以确认发现优于比卡鲁胺的新一代雄激素受体拮抗药物。

口服药动学研究

健康雄性Balb小鼠30只，禁食12小时后随机分组，灌胃(50mg/kg)给予化合物实例6。于给药后0.5，1，2.0，4.0，6.0和24.0小时静脉取血0.5毫升，置肝素化的离心管中离心10min，分离取血浆供样品分析，我们采用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)以普萘洛尔(Propranolol)为内标检测测定给药后血浆中的药物浓度，计算它的的药动学参数及绝对生物利用度。结果灌胃化合物实例6后血药浓度维持较长的停留时间(见附图一)，其主要药动学参数如下：Cmax分别为20.3μg/mL；T_max为4hr；T_1/2为41hr；AUC_0-24h为367μg*hr/mL；AUC_0-∞为1154μg*hr/mL。根据静脉给药的AUC_0-∞计算，灌胃制剂的绝对生物利用度为41％。小鼠口服给药的初步药代动力学研究表明化合物实例6在小鼠体内吸收较快，消除半衰期较长，生物利用度较高，显示它可以成为理想的口服抗癌候选药物。

化合物的代谢稳定性

为了进一步确定化合物的代谢稳定性，我们采用人体肝脏微粒体与多个本发明的化合物孵化反应，然后用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)方法检测残余的化合物原体。将化合物样品溶解于二甲基亚砜(DMSO)，并进一步用反应缓冲液稀释，以确保二甲基亚砜含量在最终反应混合液中小于0.1％。化合物样品与人体肝脏微粒体在37度混合反应0至60分钟，用加入含有内标Terfenadine的冰乙腈在不同的时间点(0，5，10，20，30，45，60分钟)终止反应。样品混合物离心(4000rpm，10min)取清液，将不同时间点的上清液用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)方法进行分析。代谢稳定性的确定是通过在不同时间点剩余的原体化合物与0分钟的化合物浓度相比较。结果表明，化合物实例6最为稳定，半衰期(T_1/2)大于60分钟，在体外人体肝脏微粒体中几乎没有降解，而化合物实例10和12在人肝微粒体稳定性较差，半衰期(T_1/2)都约为11分钟。