一种运用荧光PCR技术检测食品中过敏原杏仁成分的方法

摘要

本发明公开了一种运用荧光PCR技术检测食品中过敏原杏仁成分的方法，属于过敏原检测技术，特别是指外切酶探针荧光PCR技术(TaqMan)检测食品中过敏原杏仁成分的方法。其技术方案是针对过敏原杏仁成分Pru du 1.06B DNA序列设计引物及TaqMan探针，建立荧光PCR检测方法。本发明包括设计的杏仁成分特异性的引物和探针以及与之配套的荧光PCR反应条件。本方法花生、榛仁、栗子、核桃、松子、夏果等没有交叉反应，具有特异性，检测灵敏度可达到5mg/kg。本发明所载明的方法可以用于检测食品中的过敏原，避免使用该类食物导致的过敏反应，具有实际意义。

说明书

技术领域

本发明涉及属于过敏原检测技术，具体地说是运用荧光PCR反应来检测过敏原的技术，特别是食品中过敏原杏仁成分的方法。

背景技术

食物过敏是人们对食物产生的一种不良反应，属于机体对外源性物质的一种变态反应。近二十年来，食物过敏逐渐被重视，已被认为是严重的公共卫生问题，而且WHO预测食物过敏可能成为今后最常见的流行病之一。根据美国FDA资料统计，在美国，2％的成年人和5％的婴幼儿患有食物过敏症，每年大约30000人需要临床紧急治疗，150人死于食物引起的过敏反应。在所有过敏反应中，花生和树坚果过敏占10-47％。

FDA于2005年10月5日发布《食品过敏原标识和消费者保护法案-2004》(FALCPA)，规定主要食物过敏原包括树坚果等八种食物的成分。日本标签标注也要求将树坚果列为推荐标注成分。据国外有关学者应用ELISA方法结合PCR-ELISA法对商品进行调查，在35种市售商品中就有7种含有过敏原杏仁成分而未在标签中标识。

目前国内外对过敏原杏仁成分的检测研究主要集中在ELISA、PCR-ELISA、PCR、荧光PCR及生物传感器检测等方面。目前对于过敏原的检测方法FDA和AOAC共同研究推荐使用的试剂盒有三种，均为ELISA方法。但如果产品中蛋白质遭到破坏，ELISA方法就检测不到。而DNA比蛋白质稳定，PCR方法较ELISA方法更为准确，并且避免了对大量抗体的需求，欧盟、日本和AOAC都建议使用PCR方法进行确证，但没有明确特异性的引物序列。

由于杏仁于苹果、梨等同属蔷薇科植物，其主要过敏原蛋白基因序列具有高度的同源性，本研究针对杏仁成分Pru du 1.06BDNA序列设计引物及TaqMan探针，建立了运用荧光PCR技术检测食品中过敏原杏仁成分的方法。

发明内容

针对上述情况，本发明克服了现有技术中的缺点，提供了运用荧光PCR技术检测食品中过敏原杏仁成分的方法，具体的讲就是，外切酶探针荧光PCR技术(Taqman探针法)检测食品中过敏原杏仁成分的方法。

其技术内容包括：使用该方法所使用的引物、探针及构建的报告质粒。其中引物、探针的全部序列如下：

引物：

所用引物序列一：TTTGGTTGAAGGAGATGCTC

所用引物序列二：TAGTTGCTGGTGCTCTTTATG

探针：

所用探针序列：TCCATCAGCAGATGCCACCAAC

以及由上述序列衍生出来的、差别不大于8个碱基的寡核苷酸序列以及每个序列的反义互补序列，或它们的变体，或它们的部分序列。还包括与之配套的荧光PCR反应条件。

本发明是通过以下技术方案实现的：

(1)设计特异性寡核苷酸引物、探针，将探针法探针序列三用FAM荧光基团标记，用于外切酶探针荧光PCR技术检测；

(2)以探针法引物序列一和探针法引物序列二作为引物，以食品中过敏原杏仁成分的相关基因DNA为模板，进行目的基因的特异性扩增；

(3)扩增过程中使用荧光PCR仪进行实时荧光光强度测量，并将数据传输至电脑通过配套软件进行分析可以观察到对食品中过敏原杏仁成分进行特异性扩增产生的特定波长的FAM荧光信号，则证明待测样品中存在食品中过敏原杏仁成分；如没有观察到任何一种荧光信号则证明待测样品中不存在食品中过敏原杏仁成分。

本研究所建立的荧光PCR方法，与坚果类如花生、榛仁、栗子、核桃、松子、夏果，水果类如苹果、梨、杨梅、李子等没有交叉反应，具有很好的特异性，检测灵敏度可达到5mg/kg。

本发明中荧光PCR反应体系中各组分构成比例如下：

成分                    浓度         加样量

PCR体系预混合物         2倍          25μL

探针法所用引物序列一    10μmol/L    2μL

探针法所用引物序列二    10μmol/L    2μL

探针法所用探针序列一    10μmol/L    1.5μL

DNA样品                              5μL

双蒸水                               14.5μL

总体积                               50μL

荧光PCR扩增程序如下

(1)50℃    2分钟

(2)95℃    10分钟

(3)95℃    15秒

(4)60℃    1分钟

(5)回到第3步，重复45次

扩增过程中使用荧光PCR仪进行实时荧光光强度测量，并将数据传输至电脑通过配套软件进行分析可以观察到对食品中过敏原杏仁成分进行特异性扩增产生的特定波长的FAM荧光信号，则证明待测样品中存在食品中过敏原杏仁成分；如没有观察到任何一种荧光信号则证明待测样品中不存在食品中过敏原杏仁成分。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：可以检测由于产品中蛋白质遭到破坏，ELISA方法不能检出的食品中过敏原杏仁成分。本发明用PCR的方法扩增靶基因，避免了ELISA反应的复杂处理过程，节约时间；PCR鉴定方法受到的其他蛋白的干扰较小，较ELISA方法更为准确。

附图说明

图1杏仁添加至巧克力样品DNA，荧光信号强度。

图2购买国际杏仁过敏原参考物质DNA，荧光信号强度。

图3非杏仁的其他坚果及蔷薇科其他植物DNA，荧光信号强度。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细描述。

实施例1

样本：不含杏仁成分的巧克力做添加基质。取1g研磨成糊状的杏仁加入99g巧克力中40℃水浴融化，搅拌30min，充分混合均匀。取3g上述添加杏仁的巧克力加入27g巧克力中，以此不断稀释，最终制成含杏仁1000mg/kg、100mg/kg、20mg/kg、10mg/kg、5mg/kg的巧克力。

1.样品处理

(1)分别取300mg样品，放入1.5mL离心管中，加入600μL CTAB缓冲液(CTAB 55mmol/L、EDTA20mmol/L、Tris 100mmol/L，10％盐酸调pH值至8.0)，15μL(20mg/ml)蛋白酶K，65℃温育30min；加入500μL酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合液强烈振荡，离心12000rpm 15min；吸取上清液加入等体积异丙醇，强烈振荡后离心12000rpm，10min，弃上清；用200μLTE溶解(TE量视DNA沉淀多少而定)；加等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合液强烈振荡，离心12000rpm 15min；吸取上清液加入等体积异丙醇，强烈振荡后离心12000rpm，10min，弃上清；用200μLTE溶解。溶解的溶液作为样品重复上述步骤纯化DNA。用DNA分析仪检测其纯度及浓度。

2.PCR扩增

成分                    浓度         加样量

PCR体系预混合物         2倍          25μL

探针法所用引物序列一    10μmol/L    2μL

探针法所用引物序列二    10μmol/L    2μL

探针法所用探针序列一    10μmol/L    1.5μL

DNA样品                              5μL

双蒸水                               14.5μL

总体积                               50μL

荧光PCR扩增程序如下

(1)50℃    2分钟

(2)95℃    10分钟

(3)95℃    15秒

(4)60℃    1分钟

(5)回到第3步，重复45次

PCR共进行7管PCR实验，其中DNA样品所加入的分别为含榛果成分为1000mg/kg、100mg/kg、20mg/kg、10mg/kg、5mg/kg样品、空白对照及阳性对照。

3.被检测样品荧光PCR图谱观察

荧光PCR过程中可以观察到各浓度样品分别在23.2、35.2、37.0、38.0、39.0、39.1循环产生了明显的FAM荧光，结果如图1。

图1中的各条曲线所代表的FAM荧光强度信号分别是：

1.阳性对照；

2.含杏仁成分1000mg/kg巧克力DNA样品；

3.含杏仁成分100mg/kg巧克力DNA样品；

4.含杏仁成分20mg/kg巧克力DNA样品；

5.含杏仁成分10mg/kg巧克力DNA样品；

6.含杏仁成分5mg/kg巧克力DNA样品；

7.空白对照；

实验表明该方法检测灵敏度达到5mg/kg。

实施例2

样本：国际杏仁过敏原参考物质40mg/kg、20mg/kg、10mg/kg、5mg/kg

1.样品处理

(1)分别取300mg样品，放入1.5mL离心管中，加入600μL CTAB缓冲液(CTAB 55mmol/L、EDTA 20mmol/L、Tris 100mmol/L，10％盐酸调pH值至8.0)，15μL(20mg/ml)蛋白酶K，，65℃温育30min；加入500μL酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合液强烈振荡，离心12000rpm15min；吸取上清液加入等体积异丙醇，强烈振荡后离心12000rpm，10min，弃上清；用200μLTE溶解(TE量视DNA沉淀多少而定)；加等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合液强烈振荡，离心12000rpm 15min；吸取上清液加入等体积异丙醇，强烈振荡后离心12000rpm，10min，弃上清；用200μL TE溶解。溶解的溶液作为样品重复上述步骤纯化DNA。用DNA分析仪检测其纯度及浓度。

2.PCR扩增

成分                    浓度         加样量

PCR体系预混合物         2倍          25μL

探针法所用引物序列一    10μmol/L    2μL

探针法所用引物序列二    10μmol/L    2μL

探针法所用探针序列一    10μmol/L    1.5μL

DNA样品                              5μL

双蒸水                               14.5μL

总体积                               50μL

荧光PCR扩增程序如下

(1)50℃    2分钟

(2)95℃    10分钟

(3)95℃    15秒

(4)60℃    1分钟

(5)回到第3步，重复45次

PCR共进行5管PCR实验，其中DNA样品所加入的分别40mg/kg、20mg/kg、10mg/kg、5mg/kg参考物质的DNA及空白对照。

3.被检测样品荧光PCR图谱观察

荧光PCR过程中可以观察到各浓度样品分别在32.2、34.6、35.1、36.8循环产生了明显的FAM荧光，结果如图2。

图2中的各条曲线所代表的FAM荧光强度信号分别是：

1.含40mg/kg杏仁成分的参考物质DNA样品；

2.含20mg/kg杏仁成分的参考物质DNA样品；

3.含10mg/kg杏仁成分的参考物质DNA样品；

4.含5mg/kg杏仁成分的参考物质DNA样品；

5.空白对照。

实验表明该方法检测灵敏度达到5mg/kg得到国际参考物质的确证。

实施例3

样本：杏仁；坚果类如花生、榛仁、栗子、核桃、松子、夏果；水果类如苹果、梨、杨梅、李子。

1.样品处理

(1)分别取300mg样品，放入1.5mL离心管中，加入600μL CTAB缓冲液(CTAB 55mmol/L、EDTA 20mmol/L、Tris 100mmol/L，10％盐酸调pH值至8.0)，15μL(20mg/ml)蛋白酶K，，65℃温育30min；加入500μL酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合液强烈振荡，离心12000rpm15min；吸取上清液加入等体积异丙醇，强烈振荡后离心12000rpm，10min，弃上清；用200μL TE溶解(TE量视DNA沉淀多少而定)；加等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合液强烈振荡，离心12000rpm 15min；吸取上清液加入等体积异丙醇，强烈振荡后离心12000rpm，10min，弃上清；用200μL TE溶解。溶解的溶液作为样品重复上述步骤纯化DNA。用DNA分析仪检测其纯度及浓度。

2.PCR扩增

成分                    浓度         加样量

PCR体系预混合物         2倍          25μL

探针法所用引物序列一    10μmol/L    2μL

探针法所用引物序列二    10μmol/L    2μL    

探针法所用探针序列一    10μmol/L    1.5μL

DNA样品                              5μL

双蒸水                               14.5μL

总体积                               50μL

荧光PCR扩增程序如下

(1)50℃    2分钟

(2)95℃    10分钟

(3)95℃    15秒

(4)60℃    1分钟

(5)回到第3步，重复45次

PCR共进行11管PCR实验，其中DNA样品所加入的分别为待测样品的原浓度DNA样品。

3.被检测样品荧光PCR图谱观察

荧光PCR过程中可以观察到杏仁DNA在30.2循环产生了明显的FAM荧光，结果如图3。图3中的曲线所代表的FAM荧光强度信号分别是待测样品的原浓度DNA样品。

实验表明该方法特异性强。

序列列表

SEQUENCE LISTING

<110>天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心

<120>一种运用荧光PCR技术检测食品中过敏原杏仁成分的方法

<140>200910068848.7

<141>2009-05-15

<160>3

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>prim_bind

<222>(1)..(20)

<400>1

tttggttgaaggagatgctc                                            20

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>prim_bind

<222>(1)..(21)

<400>2

tagttgctggtgctctttatg                                           21

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>prim_bind

<222>(1)..(22)

<400>3

tccatcagcagatgccaccaac                                          22