淡水鱼粪便中香港海鸥形菌的检测方法

摘要

本发明提供了一种淡水鱼粪便中香港海鸥形菌的检测方法，该方法首先经麦康凯培养基培养后挑出无色、半透明、扁平状和直径在0.5mm～1.0mm之间的微小菌落进行纯培养，然后通过尿素酶试验、氧化酶和触酶试验初步筛选出疑似香港海鸥形菌的细菌，再用PCR方法做进一步鉴定，最后通过革兰染色法进行确认；其中PCR方法所用的引物为5’－ATCCCTAAGGCTAATACCCT－3′和5’－AATCTCTTCGAGGTTCGGTA－3’。

说明书

技术领域

本发明涉及生化领域，具体涉及微生物的检测方法。

背景技术

香港海鸥形菌(Laribacter hongkongensis，LH)是一种新发现的可能致人类严重腹泻的病原菌。香港海鸥形菌2001年首次在香港肝硬化病人的胸腔脓液和血液样本中分离到并被鉴定为新属种。随后，有人对香港市场出售的淡水鱼进行检测，其中有四分之一的淡水鱼肠道中都能分离出香港海鸥形菌，且进一步证明该菌是导致人类腹泻的病原菌。自全球首例感染个案发现以来，研究人员相继在患有胃肠炎的香港和瑞士病人的粪便标本中分离培养出“香港海鸥形菌”，该研究显示此种新的细菌可能广泛传播于世界各地。

香港海鸥形菌作为一种新发现的食源性病原菌，已确认的生理生化特性如下：革兰染色呈阴性，氧化酶、过氧化氢酶、尿素酶和精氨酸双脱氢酶试验呈阳性，鸟氨酸脱羧酶和赖氨酸脱羧酶试验呈阴性，不发酵乳糖、葡萄糖、蔗糖等。目前尚未对该菌建立一套规范、有效、快捷、高效的检验技术与检验流程。按传统鉴定方法需做数十种生化试验，检出程序过于复杂，试验成本高昂，单纯应用PCR诊断，又无法获得分离菌株。

国知局2007年10月31日公开了一项关于香港海鸥形菌检测方法的发明专利申请(申请号为200710068975.8)，该申请所记载的方法是：取粪便标本接种在含头孢哌酮的麦康凯培养基上，放入37℃箱内培养48小时取出；挑无色透明、扁平状、直径在0.5～1.0mm之间的微小菌落进行纯化培养；对培养菌按步骤实验：先进行革兰染色检验，选阴性的短杆菌或弧菌，然后进行氧化酶和触酶试验，选择二者均为阳性的菌落接种在三糖铁培养基试管内，置37℃箱内培养24小时取出，选择使鲜红色培养基的颜色保持不变或变得更深的细菌，用引物5’ttgaggtgcccgaaaggga3’和5’ctacccacttctggcgatt3’进行PCR扩增，当PCR结果为阳性时即可确认为香港海鸥形菌。该方法虽然简化了传统的鉴定方法，但存在以下问题：1、所选的三个生化实验之一是三糖铁试验，其主要目的是排除发酵糖类的细菌，由于培养时所用的麦康凯培养基如果添加了葡萄糖，就可以排除发酵乳糖和葡萄糖的细菌，因此三糖铁试验的作用仅剩排除发酵蔗糖的细菌；本发明人经试验分析发现经麦康凯培养基培养后筛选出来的淡水鱼肠道细菌中能发酵蔗糖的比例较低，因此这时三糖铁试验的筛选价值并不大；2、各生理生化试验的顺序设置不够高效：该方法以革兰染色镜检、氧化酶和触酶试验作为首筛试验，但是麦康凯培养基本身对革兰染色阳性菌有抑制作用，经麦康凯培养基筛选后可排除大部分革兰染色阳性菌，而经含头孢哌酮的麦康凯培养基筛选后的淡水鱼肠道细菌中氧化酶和触酶试验阳性率较高，因此经过革兰染色镜检、氧化酶和触酶试验后可排除的细菌数量并不多。

发明内容

本发明要解决的技术问题是建立一种淡水鱼粪便中香港海鸥形菌的快速检测方法。

本发明解决上述问题的技术方案是：

淡水鱼粪便中香港海鸥形菌的检测方法，该方法由以下步骤组成(简要流程见图1)：

(1)取淡水鱼的粪便，接种在含有头孢哌酮的麦康凯培养基上，放入温度为37℃培养箱内培养48小时后取出；

(2)挑取无色、半透明、扁平状和直径在0.5mm～1.0mm之间的微小菌落进行纯培养，得各菌落的纯培养物；

(3)将步骤(2)所得纯培养物按以下步骤进行实验：首先进行常规尿素酶试验，选择该试验呈阳性的纯培养物进行常规氧化酶和触酶试验，然后取氧化酶和触酶试验均为阳性的纯培养物采用引物对5‘-ATCCCTAAGGCTAATACCCT-3′和5’-AATCTCTTCGAGGTTCGGTA-3’在退火温度为53℃的条件下进行PCR扩增30～35个循环，最后取PCR扩增片段为550bp的纯培养物进行常规的革兰染色检验，并在显微镜下观察，当观察结果为阴性的短杆菌或弧菌时，该纯培养物即为香港海鸥形菌。

本发明方法以尿素酶试验作为首筛试验，可以排除麦康凯培养基上的大部分非香港海鸥形菌的菌落，为后续筛选试验节省了许多工作量；这是因为经含头孢哌酮的麦康凯培养基筛选后的淡水鱼肠道细菌中尿素酶试验阳性的细菌所占的比例约为10％～25％，经尿素酶试验后将阴性菌落均全部排除，仅余10％～25％的细菌进入下一个鉴定步骤。本发明方法所提供的PCR引物对香港海鸥形菌的特异性高达100％，可保证检测结果的准确性。

为了更好地理解本发明，下面将通过实验证明本发明的技术效果。

1、方法

取新鲜活草鱼6条，腹部解剖，采用无菌棉签采集鱼体中、后肠内粪便，采样棉签直接接种于在含16mg/L头孢哌酮的麦康凯培养基上，每个样品直接接种3个平板。

37℃培养48小时后，取出平板，挑取平板培养基上无色、透明、扁平状，直径在0.5mm～1.0mm之间的微小菌落，分纯培养后，同时平行进行常规革兰染色检验、精氨酸双水解酶、三糖铁、触酶、氧化酶、尿素酶等试验和特异PCR扩增。符合三糖铁试验阴性但其它试验均阳性的菌落，使用API20NE和API20E进行进一步生化鉴定。

所述特异PCR扩增的引物对是根据香港海鸥菌16S rRNA序列设计的特异性引物，上游引物为5‘-ATCCCTAAGGCTAATACCCT-3’，下游引物为5’-AATCTCTTCGAGGTTCGGTA-3’。PCR反应条件为：94℃预变性5min；然后按以下方法进行35个循环：94℃变性30s，53℃退火40s，72℃延伸40s；最后72℃延伸5min。

2、结果和分析：

37℃培养48小时后，挑取头孢哌酮麦康凯平板上菌落为无色透明，直径在0.5mm～1.0mm之间的疑似菌落共计71株。上述71株菌落平行进行常规革兰染色检验、精氨酸双水解酶、三糖铁、触酶、氧化酶、尿素酶等试验和特异PCR扩增，鉴定结果见表1和表2。

由表1可见，在香港海鸥菌必须符合的众多生化试验中，71株菌中符合三糖铁阴性的有63株，占总数的88.7％，这意味著进入下一筛选试验的菌株量非常大。而尿素酶试验的筛选效率最高，尿素酶试验阳性的细菌所占的比例仅为21.1％，经尿素酶试验后将阴性均全部排除，仅余21.1％的细菌进入下一个鉴定步骤。同时，尿素酶试验本身简便、易行、成本低廉、重复性好、灵敏度、特异度高，也较适合进行菌株的大规模初筛，因此选择尿素酶试验作为本发明方法的首筛试验，可以大大简化后续的筛选工作。

表2结果显示，在尿素酶阳性的15株疑似菌株中，15株(100.0％)都为三糖铁试验阴性，不具筛选意义，有13株(86.7％)精氨酸双水解酶阳性，该试验的筛选价值也不是很高，且以上两项试验均需对鉴定菌株培养18～24小时后才能观察结果，故不适宜作为本发明方法的二次筛选试验；虽然在15株尿素酶阳性的疑似菌株中，触酶和氧化酶的阳性率分别为93.3％和100％，但由于这两项试验简单、快速、方便，仅在1分钟内就可完成试验和观察结果的的全部过程，故选作本发明方法的二次筛选试验；由于特异PCR基因诊断是针对染色体特异性片段设计引物进行目的片段扩增，较生化表型诊断更具特异性，本试验中71株疑似菌株经特异PCR扩增阳性菌株为13株，且全部为香港海鸥形菌，无假阳性，特异度达100％，由于PCR扩增需完成从模板制备、PCR反应到电泳观察结果等多个步骤，故不适合作为初筛试验，可作为最后筛选试验。由于细菌的形态鉴别是细菌鉴定不可缺少的，本发明将常规革兰染色镜检作为最后的确证鉴定，结果表明，通过前述标准筛选出的菌株，革兰染色镜检结果100％为阴性的短杆菌或弧菌。由本发明方法筛选出来的13株细菌经API 20NE和API 20E生化鉴定最终确认为香港海鸥菌，可见本发明方法具有检测快速和准确的优点。

表1 71株香港海鸥形菌疑似菌落的鉴定结果

表2 15株尿素酶阳性菌株的生化及PCR鉴定结果

附图说明

图1是本发明方法的流程图。

具体实施方式

例1

取新鲜活草鱼腹部解剖，剪开中、后肠后用无菌棉签取肠内粪便，接种在含头孢哌酮的麦康凯培养基上，37℃培养48小时后，取出培养皿，挑取培养基上无色、透明、扁平状，直径在0.5mm～1.0mm之间的微小菌落，进行纯化培养后，再按以下步骤开展实验：

第一步用常规尿素酶试验：

将待检细菌接种尿素培养基中，于37℃培养18～24h后，观察并记录结果。培养基变红色者为阳性，不变色者为阴性；

第二步取素酶试验呈阳性的细菌进行常规氧化酶和触酶试验：

a.氧化酶试验：取洁净滤纸一小块。将滤纸片浸泡于1％盐酸四甲基对苯二胺或1％盐酸二甲基对苯二胺试剂中制成试剂纸片，取待检菌少许涂于试剂纸上，细菌在与试剂接触10秒内呈深紫色，为阳性，不变色则为阴性。

b.触酶试验(过氧化氢酶试验)：用接种环挑取固体培养基上的菌落，置于洁净的试管内或玻片上，然后滴加3％过氧化氢溶液数滴，观察结果。于半分钟内有大量气泡产生者为阳性，不产生气泡者为阴性。

第三步取氧化酶和触酶试验都为阳性的细菌进行PCR扩增：

a.样品的预处理：取淡水鱼类产品腹部解剖，剪开中、后肠，取肠内粪便适量加入1ml无菌水，充分振荡混匀，500r/min离心3min，弃残渣，取上清备用；

b.100℃煮沸5～10min，12000r/min的速度离心3～5min，吸去上清液，得样品DNA模板。

c.将25μl PCR反应试剂置入0.2m1/PCR管中，反应条件为：94℃预变性5min，然后按以下方法进行35个循环：94℃变性30s，53℃退火40s，72℃延伸40s；最后72℃延伸5min，4℃保存。

所述的25μl PCR反应试剂的组分：

10×PCR缓冲液                                              2μl

4mmol/L dNTP                                               2μl

上游引物：5′-ATCCCTAAGGCTAATACCCT-3′，25pmol/L           1μl

下游引物：5′-AATCTCTTCGAGGTTCGGTA-3′，25pmol/L           1μl

Taq酶(5U/μl)                                               0.2μl

25mmol/L镁离子                                             1.5μl

DNA模板                                                    0.5μl

双蒸水                                                     余量

d.取5μl的PCR产物与6×PCR上样缓冲液混合，在加入溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶电泳中以DNA分子量标记作为对照进行检测，若550bp处出现明亮的反应条带，可判为香港海鸥菌阳性，否则为阴性。

第四步进行常规革兰染色检验：

a.将待检菌液制作标本涂片，干燥后以火焰固定；

b.在制好的涂片上，加结晶紫染液1～2滴，染色1min后倾斜载玻片，用自来水轻轻冲洗，再将玻片上积水甩干；

c.加碘液(卢戈氏液)1～2滴，染色1min后水洗，甩干；加95％乙醇2～3滴，将涂片轻轻晃动，使其脱色，通常需30s左右，水洗，甩干。

d.加石炭酸复红稀释液1～2滴复染1min，水洗，干燥即成。

e.镜下观察，被染成红色的短杆菌或弧菌即可确认为香港海鸥形菌。

例2

取新鲜活鲢鱼腹部解剖，剪开中、后肠后用无菌棉签取肠内粪便，接种在含头孢哌酮的麦康凯培养基上，37℃培养48小时后，取出培养皿，挑取培养基上无色、透明、扁平状，直径在0.5mm～1.0mm之间的微小菌落，进行纯化培养后，再按以下步骤开展实验：

第一步用常规尿素酶试验：

将待检细菌接种尿素培养基中，于37℃培养18～24h后，观察并记录结果。培养基变红色者为阳性，不变色者为阴性；

第二步取素酶试验呈阳性的细菌进行常规氧化酶和触酶试验：

a.氧化酶试验：取洁净滤纸一小块。将滤纸片浸泡于1％盐酸四甲基对苯二胺或1％盐酸二甲基对苯二胺试剂中制成试剂纸片，取待检菌少许涂于试剂纸上，细菌在与试剂接触10秒内呈深紫色，为阳性，不变色则为阴性。

b.触酶试验(过氧化氢酶试验)：用接种环挑取固体培养基上的菌落，置于洁净的试管内或玻片上，然后滴加3％过氧化氢溶液数滴，观察结果。于半分钟内有大量气泡产生者为阳性，不产生气泡者为阴性。

第三步取氧化酶和触酶试验都为阳性的细菌进行PCR扩增：

a.样品的预处理：取淡水鱼类产品腹部解剖，剪开中、后肠，取肠内粪便适量加入1ml无菌水，充分振荡混匀，500r/min离心3min，弃残渣，取上清备用；

b.100℃煮沸5～10min，12000r/min的速度离心3～5min，吸去上清液，得样品DNA模板。

c.将25μl PCR反应试剂置入0.2mlPCR管中，反应条件为：94℃预变性5min，然后按以下方法进行35个循环：94℃变性30s，53℃退火40s，72℃延伸40s；最后72℃延伸5min，4℃保存。

所述的25μl PCR反应试剂的组分：

10×PCR缓冲液                                              2μl

4mmol/L dNTP                                               2μl

上游引物：5′-ATCCCTAAGGCTAATACCCT-3′，25pmol/L           1μl

下游引物：5′-AATCTCTTCGAGGTTCGGTA-3′，25pmol/L           1μl

Taq酶(5U/μl)                                               0.2μl

25mmol/L镁离子                                             1.5μl

DNA模板                                                    0.5μl

双蒸水                                                     余量

d.取5μl的PCR产物与6×PCR上样缓冲液混合，在加入溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶电泳中以DNA分子量标记作为对照进行检测，若550bp处出现明亮的反应条带，可判为香港海鸥菌阳性，否则为阴性。

第四步进行常规革兰染色检验：

a.将待检菌液制作标本涂片，干燥后以火焰固定；

b.在制好的涂片上，加结晶紫染液1～2滴，染色1min后倾斜载玻片，用自来水轻轻冲洗，再将玻片上积水甩干；

c.加碘液(卢戈氏液)1～2滴，染色1min后水洗，甩干；加95％乙醇2～3滴，将涂片轻轻晃动，使其脱色，通常需30s左右，水洗，甩干。

d.加石炭酸复红稀释液1～2滴复染1min，水洗，干燥即成。

e.镜下观察，被染成红色的短杆菌或弧菌即可确认为香港海鸥形菌。

例3

取新鲜活鲈鱼腹部解剖，剪开中、后肠后用无菌棉签取肠内粪便，接种在含头孢哌酮的麦康凯培养基上，37℃培养48小时后，取出培养皿，挑取培养基上无色、透明、扁平状，直径在0.5mm～1.0mm之间的微小菌落，进行纯化培养后，再按以下步骤开展实验：

第一步用常规尿素酶试验：

将待检细菌接种尿素培养基中，于37℃培养18～24h后，观察并记录结果。培养基变红色者为阳性，不变色者为阴性；

第二步取素酶试验呈阳性的细菌进行常规氧化酶和触酶试验：

a.氧化酶试验：取洁净滤纸一小块。将滤纸片浸泡于1％盐酸四甲基对苯二胺或1％盐酸二甲基对苯二胺试剂中制成试剂纸片，取待检菌少许涂于试剂纸上，细菌在与试剂接触10秒内呈深紫色，为阳性，不变色则为阴性。

b.触酶试验(过氧化氢酶试验)：用接种环挑取固体培养基上的菌落，置于洁净的试管内或玻片上，然后滴加3％过氧化氢溶液数滴，观察结果。于半分钟内有大量气泡产生者为阳性，不产生气泡者为阴性。

第三步取氧化酶和触酶试验都为阳性的细菌进行PCR扩增：

a.样品的预处理：取淡水鱼类产品腹部解剖，剪开中、后肠，取肠内粪便适量加入1ml无菌水，充分振荡混匀，500r/min离心3min，弃残渣，取上清备用；

b.100℃煮沸5～10min，12000r/min的速度离心3～5min，吸去上清液，得样品DNA模板。

c.将25μl PCR反应试剂置入0.2mlPCR管中，反应条件为：94℃预变性5min，然后按以下方法进行35个循环：94℃变性30s，53℃退火40s，72℃延伸40s；最后72℃延伸5min，4℃保存。

所述的25μl PCR反应试剂的组分：

10×PCR缓冲液                                              2μl

4mmol/L dNTP                                               2μl

上游引物：5′-ATCCCTAAGGCTAATACCCT-3′，25pmol/L           1μl

下游引物：5′-AATCTCTTCGAGGTTCGGTA-3′，25pmol/L           1μl

Taq酶(5U/μl)                                               0.2μl

25mmol/L镁离子                                             1.5μl

DNA模板                                                    0.5μl

双蒸水                                                     余量

d.取5μl的PCR产物与6×PCR上样缓冲液混合，在加入溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶电泳中以DNA分子量标记作为对照进行检测，若550bp处出现明亮的反应条带，可判为香港海鸥菌阳性，否则为阴性。

第四步进行常规革兰染色检验：

a.将待检菌液制作标本涂片，干燥后以火焰固定；

b.在制好的涂片上，加结晶紫染液1～2滴，染色1min后倾斜载玻片，用自来水轻轻冲洗，再将玻片上积水甩干；

c.加碘液(卢戈氏液)1～2滴，染色1min后水洗，甩干；加95％乙醇2～3滴，将涂片轻轻晃动，使其脱色，通常需30s左右，水洗，甩干。

d.加石炭酸复红稀释液1～2滴复染1min，水洗，干燥即成。

e.镜下观察，被染成红色的短杆菌或弧菌即可确认为香港海鸥形菌。

例4

取新鲜活青鱼腹部解剖，剪开中、后肠后用无菌棉签取肠内粪便，接种在含头孢哌酮的麦康凯培养基上，37℃培养48小时后，取出培养皿，挑取培养基上无色、透明、扁平状，直径在0.5mm～1.0mm之间的微小菌落，进行纯化培养后，再按以下步骤开展实验：

第一步用常规尿素酶试验：

将待检细菌接种尿素培养基中，于37℃培养18～24h后，观察并记录结果。培养基变红色者为阳性，不变色者为阴性；

第二步取素酶试验呈阳性的细菌进行常规氧化酶和触酶试验：

a.氧化酶试验：取洁净滤纸一小块。将滤纸片浸泡于1％盐酸四甲基对苯二胺或1％盐酸二甲基对苯二胺试剂中制成试剂纸片，取待检菌少许涂于试剂纸上，细菌在与试剂接触10秒内呈深紫色，为阳性，不变色则为阴性。

b.触酶试验(过氧化氢酶试验)：用接种环挑取固体培养基上的菌落，置于洁净的试管内或玻片上，然后滴加3％过氧化氢溶液数滴，观察结果。于半分钟内有大量气泡产生者为阳性，不产生气泡者为阴性。

第三步取氧化酶和触酶试验都为阳性的细菌进行PCR扩增：

a.样品的预处理：取淡水鱼类产品腹部解剖，剪开中、后肠，取肠内粪便适量加入1ml无菌水，充分振荡混匀，500r/min离心3min，弃残渣，取上清备用；

b.100℃煮沸5～10min，12000r/min的速度离心3～5min，吸去上清液，得样品DNA模板。

c.将25μl PCR反应试剂置入0.2mlPCR管中，反应条件为：94℃预变性5min，然后按以下方法进行35个循环：94℃变性30s，53℃退火40s，72℃延伸40s；最后72℃延伸5min，4℃保存。

所述的25μl PCR反应试剂的组分：

10×PCR缓冲液                                             2μl

4mmol/L dNTP                                              2μl

上游引物：5′-ATCCCTAAGGCTAATACCCT-3′，25pmol/L          1μl

下游引物：5′-AATCTCTTCGAGGTTCGGTA-3′，25pmol/L          1μl

Taq酶(5U/μl)                                              0.2μl

25mmol/L镁离子                                            1.5μl

DNA模板                                                   0.5μl

双蒸水                                                    余量

d.取5μl的PCR产物与6×PCR上样缓冲液混合，在加入溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶电泳中以DNA分子量标记作为对照进行检测，若550bp处出现明亮的反应条带，可判为香港海鸥菌阳性，否则为阴性。

第四步进行常规革兰染色检验：

a.将待检菌液制作标本涂片，干燥后以火焰固定；

b.在制好的涂片上，加结晶紫染液1～2滴，染色1min后倾斜载玻片，用自来水轻轻冲洗，再将玻片上积水甩干；

c.加碘液(卢戈氏液)1～2滴，染色1min后水洗，甩干；加95％乙醇2～3滴，将涂片轻轻晃动，使其脱色，通常需30s左右，水洗，甩干。

d.加石炭酸复红稀释液1～2滴复染1min，水洗，干燥即成。

e.镜下观察，被染成红色的短杆菌或弧菌即可确认为香港海鸥形菌。

例5

取新鲜虎纹蛙腹部解剖，剪开中、后肠后用无菌棉签取肠内粪便，接种在含头孢哌酮的麦康凯培养基上，37℃培养48小时后，取出培养皿，挑取培养基上无色、透明、扁平状，直径在0.5mm～1.0mm之间的微小菌落，进行纯化培养后，再按以下步骤开展实验：

第一步用常规尿素酶试验：

将待检细菌接种尿素培养基中，于37℃培养18～24h后，观察并记录结果。培养基变红色者为阳性，不变色者为阴性；

第二步取素酶试验呈阳性的细菌进行常规氧化酶和触酶试验：

a.氧化酶试验：取洁净滤纸一小块。将滤纸片浸泡于1％盐酸四甲基对苯二胺或1％盐酸二甲基对苯二胺试剂中制成试剂纸片，取待检菌少许涂于试剂纸上，细菌在与试剂接触10秒内呈深紫色，为阳性，不变色则为阴性。

b.触酶试验(过氧化氢酶试验)：用接种环挑取固体培养基上的菌落，置于洁净的试管内或玻片上，然后滴加3％过氧化氢溶液数滴，观察结果。于半分钟内有大量气泡产生者为阳性，不产生气泡者为阴性。

第三步取氧化酶和触酶试验都为阳性的细菌进行PCR扩增：

a.样品的预处理：取淡水鱼类产品腹部解剖，剪开中、后肠，取肠内粪便适量加入1ml无菌水，充分振荡混匀，500r/min离心3min，弃残渣，取上清备用；

b.100℃煮沸5～10min，12000r/min的速度离心3～5min，吸去上清液，得样品DNA模板。

c.将25μl PCR反应试剂置入0.2mlPCR管中，反应条件为：94℃预变性5min，然后按以下方法进行35个循环：94℃变性30s，53℃退火40s，72℃延伸40s；最后72℃延伸5min，4℃保存。

所述的25μl PCR反应试剂的组分：

10×PCR缓冲液                                               2μl

4mmol/L dNTP                                                2μl

上游引物：5′-ATCCCTAAGGCTAATACCCT-3′，25pmol/L            1μl

下游引物：5′-AATCTCTTCGAGGTTCGGTA-3′，25pmol/L             1μl

Taq酶(5U/μl)                                                 0.2μl

25mmol/L镁离子                                               1.5μl

DNA模板                                                      0.5μl

双蒸水                                                       余量

d.取5μl的PCR产物与6×PCR上样缓冲液混合，在加入溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶电泳中以DNA分子量标记作为对照进行检测，若550bp处出现明亮的反应条带，可判为香港海鸥菌阳性，否则为阴性。

第四步进行常规革兰染色检验：

a.将待检菌液制作标本涂片，干燥后以火焰固定；

b.在制好的涂片上，加结晶紫染液1～2滴，染色1min后倾斜载玻片，用自来水轻轻冲洗，再将玻片上积水甩干；

c.加碘液(卢戈氏液)1～2滴，染色1min后水洗，甩干；加95％乙醇2～3滴，将涂片轻轻晃动，使其脱色，通常需30s左右，水洗，甩干。

d.加石炭酸复红稀释液1～2滴复染1min，水洗，干燥即成。

e.镜下观察，被染成红色的短杆菌或弧菌即可确认为香港海鸥形菌。

例6

取新鲜罗非鱼腹部解剖，剪开中、后肠后用无菌棉签取肠内粪便，接种在含头孢哌酮的麦康凯培养基上，37℃培养48小时后，取出培养皿，挑取培养基上无色、透明、扁平状，直径在0.5mm～1.0mm之间的微小菌落，进行纯化培养后，再按以下步骤开展实验：

第一步用常规尿素酶试验：

将待检细菌接种尿素培养基中，于37℃培养18～24h后，观察并记录结果。培养基变红色者为阳性，不变色者为阴性；

第二步取素酶试验呈阳性的细菌进行常规氧化酶和触酶试验：

a.氧化酶试验：取洁净滤纸一小块。将滤纸片浸泡于1％盐酸四甲基对苯二胺或1％盐酸二甲基对苯二胺试剂中制成试剂纸片，取待检菌少许涂于试剂纸上，细菌在与试剂接触10秒内呈深紫色，为阳性，不变色则为阴性。

b.触酶试验(过氧化氢酶试验)：用接种环挑取固体培养基上的菌落，置于洁净的试管内或玻片上，然后滴加3％过氧化氢溶液数滴，观察结果。于半分钟内有大量气泡产生者为阳性，不产生气泡者为阴性。

第三步取氧化酶和触酶试验都为阳性的细菌进行PCR扩增：

a.样品的预处理：取淡水鱼类产品腹部解剖，剪开中、后肠，取肠内粪便适量加入1ml无菌水，充分振荡混匀，500r/min离心3min，弃残渣，取上清备用；

b.100℃煮沸5～10min，12000r/min的速度离心3～5min，吸去上清液，得样品DNA模板。

c.将25μl PCR反应试剂置入0.2mlPCR管中，反应条件为：94℃预变性5min，然后按以下方法进行35个循环：94℃变性30s，53℃退火40s，72℃延伸40s；最后72℃延伸5min，4℃保存。

所述的25μl PCR反应试剂的组分：

10×PCR缓冲液                                              2μl

4mmol/L dNTP                                               2μl

上游引物：5′-ATCCCTAAGGCTAATACCCT-3′，25pmol/L           1μl

下游引物：5′-AATCTCTTCGAGGTTCGGTA-3′，25pmol/L           1μl

Taq酶(5U/μl)                                               0.2μl

25mmol/L镁离子                                             1.5μl

DNA模板                                                    0.5μl

双蒸水                                                     余量

d.取5μl的PCR产物与6×PCR上样缓冲液混合，在加入溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶电泳中以DNA分子量标记作为对照进行检测，若550bp处出现明亮的反应条带，可判为香港海鸥菌阳性，否则为阴性。

第四步进行常规革兰染色检验：

a.将待检菌液制作标本涂片，干燥后以火焰固定；

b.在制好的涂片上，加结晶紫染液1～2滴，染色1min后倾斜载玻片，用自来水轻轻冲洗，再将玻片上积水甩干；

c.加碘液(卢戈氏液)1～2滴，染色1min后水洗，甩干；加95％乙醇2～3滴，将涂片轻轻晃动，使其脱色，通常需30s左右，水洗，甩干。

d.加石炭酸复红稀释液1～2滴复染1min，水洗，干燥即成。

e.镜下观察，被染成红色的短杆菌或弧菌即可确认为香港海鸥形菌。

SEQUENCE LISTING

<110>南方医科大学

<120>淡水鱼粪便中香港海鸥形菌的检测方法

<130>CN200710068975.8

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

<210>2

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<212>DNA

<213>人工序列

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