腹泻病人和淡水动物香港海鸥形菌的检测及病原学研究

摘要

研究目的：
　　 1为了解广州地区由香港海鸥形菌所致腹泻的发病情况,搜集广州市两家医院的腹泻病人粪便标本进行 LH检测。为了解香港海鸥形菌生态学特性,定点采集河塘内的蛙及螺类样本进行 LH检测,探究野生环境中淡水动物LH的贮菌情况。
　　 2为进一步探究LH多重耐药的机制,通过比较LH整合酶基因在生物被膜和液相状态下表达水平的差异,对LH整合子进行深入研究。
　　 3为深入了解香港海鸥形菌的致病机制,通过动物实验初探其致病性。
　　 研究方法：
　　 1广州市某医院及社区门诊腹泻病人及周边水域野生蛙类及螺类中香港海鸥形菌检出情况的调查研究。
　　 1.1标本收集和资料获取:
　　 2009年5月至2009年10月收集医院感染疾病科门诊,消化科门诊和急诊科胃肠炎14岁以上腹泻患者的粪便标本。病人的一般情况、临床表现及流行病学资料通过自制的《感染性腹泻调查表》获得。野生生物标本在收取标本的医院服务区域的水塘抓获。
　　 1.2实验室检测:
　　 收集到的腹泻病人标本及野生生物标本经相应处理后接种LH选择性培养基及EC肉汤37℃恒温培养24h,经生化鉴定(包括革兰氏染色、双酶实验、尿素和三糖铁培养基以及API20NE生化鉴定条)和基因鉴定筛选出LH阳性菌株。对于扩增片段在100bp以上的产物直接送往上海英竣公司进行测序,根据测序结果最终鉴定出LH阳性株。
　　 1.3统计方法:在epidata3.0建立数据库,数据进行双录入。
　　 2香港海鸥形菌Ⅰ类整合酶基因在生物被膜及液相状态下的表达水平检测
　　 2.1 LH生物被膜及液相状态菌培养
　　 以过夜振荡培养的整合酶阳性 LH菌株的菌液一部分作为液相状态菌保存于-20℃,另一部分接种于含培养基的六孔板,生物被膜载体为普通盖玻片,37℃静止培养12d,每天换液换板。12d后用生理盐水冲洗载体盖玻片,染色观察,并用细胞刮刮取载体上的生物被膜。收集生物被膜状态菌打散并洗涤,保存于-20℃备用。
　　 2.2制备整合酶阳性菌株 cDNA
　　 根据 Omega公司总RNA小量提取试剂盒说明操作分别提取13株LH的生物被膜菌和液相培养菌的总RNA,全程冰上进行；测定浓度后按 Promega公司M-MLV逆转录系统合成cDNA说明书操作,将本操作中获得的所有总RNA逆转录成为cDNA。
　　 2.3比较生物被膜和液相状态下整合酶基因表达水平
　　 以提取到的生物膜和液相状态的cDNA为模板,进行 RT-PCR扩增,反应总体积为20μL,其中10μL SYBR Green Mix,引物各1μL(2mM),cDNA模板6μL。反应条件94℃变性30s；95℃15s,58℃45s,72℃30s,80℃5s,循环40次,延伸20s。5个循环之后,加入内参引物各1μL后继续。1.5％琼脂糖凝胶电泳分析后观察并进行灰度扫描,通过统计学处理比较差异。
　　 3通过动物实验研究初探香港海鸥形菌致病性研究
　　 3.1香港海鸥形菌 OD-CFU曲线绘制
　　 制备对数期菌悬液,经富集之后连续递次稀释,在选定的适宜波长下测定各梯度的OD值,取平均值,同时进行活菌计数。以OD值和活菌量为变量,绘制相关关系曲线。结果显示,波长在580-600nm时,培养液OD值能较准确反映LH的活菌量,所以在适宜波长下测定LH菌液的OD值并获得OD-CFU曲线方程。
　　 3.2 LH毒力实验
　　 以本实验室分离得到的LH原始株为实验菌株,将50只普通级昆明种小鼠随机分为2个大组(实验菌和对照菌,对照用非致病性大肠杆菌 TG1)。每大组再随机分为5个小组(5只/小组),以腹腔注射的方法给每组动物接种不同梯度的菌液,连续攻菌7d,每日观察临床表现,根据死亡和生存记录,用karber法计算得出LH的半数致死量。
　　 3.3三日龄乳兔感染香港海鸥形菌实验
　　 8只3日龄乳兔随机分成4组,3组分别口服接种香港海鸥形菌不同剂量的新鲜菌悬液,对照组口服接种无菌生理盐水。灌胃前禁食(乳兔和母兔分开)4h,每次灌胃1ml/只,一天2次,连续10d。每日盲种,并进行临床观察。灌胃结束后处死实验动物,解剖,取组织做细菌培养和病理切片。
　　 研究结果：
　　 1广州市某医院腹泻病人及淡水动物消化道内LH的检出情况:
　　 2009年5月至2009年10月共收集238例腹泻病人粪便标本,其中男性127例,女性111例,未分离到阳性菌株。共捕野生淡水动物144份:螺类120份,占83.3％；其中福寿螺73只(占总标本数的50.69％),本地螺47只(32.64％)。蛙类24只,占16.7％；其中金线蛙10只(6.94％),蟾蜍14只(9.72％)。共有13份样本分离出LH:福寿螺中有2份样本分离到LH,阳性率为2.74％；本地螺没有阳性；金线蛙中有3只分离出LH,阳性率为30％；蟾蜍中分离到8只,阳性率为57.14％。
　　 2香港海鸥形菌Ⅰ类整合酶基因在生物被膜及液相状态下的表达水平分别将26个样本进行RT-PCR,并且同时扩增内参引物。产物经凝胶电泳分析,液相培养菌和生物被膜菌均有第Ⅰ类整合酶mRNA表达。所有样本Ⅰ类整合酶条带和内参条带均清楚可见。通过灰度扫描,生物被膜菌的Ⅰ类整合酶的基因表达量平均高于液相培养菌约3倍。生物被膜培养组Ⅰ类整合酶基因表达量为2.545±0.674,液态培养组Ⅰ类整合酶表达量为0.9736±0.7549,最后进行配对t检验分析相对灰度扫描结果,两组比较,差异有统计学意义(P<0.05),证明生物被膜状态菌的Ⅰ类整合酶基因表达不同于普通液相培养菌下的Ⅰ类整合酶基因表达。
　　 3通过动物实验研究初探香港海鸥形菌致病性研究
　　 根据预实验结果,选定波长600nm下测定LH菌液的OD值,并获得LH的OD-CFU曲线方程为y=5×108x-3×107；通过毒力实验计算得出LH的半数致死量LD50=1.504×109。三日龄乳兔感染香港海鸥形菌实验显示,盲种硬便及肛门拭子均未分离到 LH;解剖发现心肺无异常,胃膨大,小肠布满黄色粘液,大肠有结块及黄色便,腹腔未见异常；血培养结果为阴性；肠组织细菌培养均有分离到LH;病理切片显示口服活菌量为3×1015 cfu/ml组的小肠有炎症发生,大肠可见免疫细胞；其中7号小肠炎症不重,血管充血扩张,应出现中性粒细胞,但并未观察到,大肠轻度充血。口服活菌量为3×1014 cfu/ml组的小肠粘膜下水肿,可见病变；大肠细胞内水肿。口服活菌量为3×1013 cfu/ml组的小肠切片显示轻度炎症,怀疑有退变,充血不明显；大肠空泡变性,细胞水肿。
　　 研究结论：
　　 LH作为一个新发现的潜在病原菌,可能是导致胃肠炎尤其是较严重胃肠炎的病原菌之一,对人群感染情况的监测是评估该菌对人群健康风险的潜在危险的方法之一；此次在广州两家医疗单位收取238例腹泻人群的调查中未能分离出 LH,所以多中心以及更大的样本量对其感染风险的评估是必要的。本次实验中野生蛙类的平均检出率和食用蛙的差别没有统计学意义,福寿螺(阳性率2.74％)的检出情况为首次报道。可见,香港海鸥形菌的保菌宿主并不局限于淡水鱼类,对其他类淡水产品及野生生物的研究可以使我们更加全面地了解其在自然界中的分布,从而做到有效防治。
　　 由于LH具有多重耐药性,所以对其耐药机制方面整合酶的研究非常必要；本研究得出 LH中整合酶基因在细菌生物膜状态下 mRNA表达是液相状态的3倍。本研究结果从一个角度解释了整合子阳性菌株多重耐药性的问题,而进一步的分子特性有待探究。
　　 本研究也通过动物实验对LH的致病性进行了初步探索,完善了LH的基础实验数据,并对本次动物实验中存在的问题进行了分析,为之后的研究奠定了基础。