双歧杆菌中的遗传重建

摘要

公开了包含经定制从而缺乏有效功能基因的基因组的双歧杆菌。还公开了制备此类细胞的方法。该方法用于制备双歧杆菌细胞，其缺少某些功能性抗生素抗性基因，如tetW，并且对抗生素如四环素敏感。

说明书

发明领域

本发明涉及乳酸细菌中的抗生素敏感性。更特别地，其涉及双歧杆菌种中四环素抗性基因的去除，以及去除或无效双歧杆菌种中基因的方法。

发明背景

近几年对于针对可用抗生素增强的细菌抗性的关注已经不断增强。尽管多数关注涉及获得的抗性，该抗性至少部分归因于医师对广谱抗生素的广泛使用，也有一些关注是有关因食物和农业目的使用获得性抗生素抗性基因的细菌所产生的抗生素抗性。例如，在从环境、动物和人类包括儿童分离的微生物中四环素抗性基因的存在和分布是普遍的。在一些情况下，抗生素抗性对于特定种类而言可能是固有的——例如，由于特定的细胞膜特性。抗生素抗性也可通过细菌基因突变而获得，并且其可通过基因转移从环境中的抗性细菌中获得。

在食物加工或农业生产中使用任何拥有或获得性抗生素抗性的细菌造成在消费之前或之后的某点，抗性促进基因向其它细菌转移的潜在的理论上的危险，所述其它细菌存在于食物中、消费食物之后人或动物的胃肠道(GIT)中、或环境中。此类细菌的例子可发现于双歧杆菌种，例如，动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)例如动物双歧杆菌乳酸亚种(也称为动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis subsp.nov.)，从前称为乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)，且有时本文也这样提及)。一个此类菌种，动物双歧杆菌乳酸亚种菌株NCC2818，CNCMI-3446是商业上可获得的，已用作食品添加剂超过20年，并通常被认为是安全的。最近发现，与人和动物来源的某些其它革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌一样，该细菌也有四环素抗性基因tetW存在。尽管四环素抗性转移在理论上是可能的，但目前即使是在实验室条件下仍不可能证实这一点。然而，从克隆实验已知来自此菌株的tetW在革兰氏阳性细菌中是有活性的，尽管在革兰氏阴性细菌中是无活性的。

然而，为排除该基因的任何意外转移的风险，需要用于从此菌株中去除该基因的方法。也需要具有对四环素降低的抗性的菌株变体。

发明简述

本发明的一个方面描述了双歧杆菌细胞，所述细胞包含经定制的从而缺乏有效功能基因的基因组。在某些实施方案中，双歧杆菌细胞是动物双歧杆菌细胞，且更特别地，是动物双歧杆菌乳酸亚种细胞。本文示例了动物双歧杆菌乳酸亚种菌株NCC9034。

在某些实施方案中，功能基因提供了抗生素抗性；例如，功能基因是tetW并提供对四环素的抗性。在多种实施方案中，经定制的缺乏有效tetW基因的双歧杆菌细胞比含有有效tetW基因的相当的细胞对四环素更敏感至少5-10倍。在其它实施方案中，如利用平板扩散试验所测定的，细胞对高于大约0.3微克每毫升的四环素浓度是敏感的。示例性实施方案的特征是动物双歧杆菌乳酸亚种菌株NCC9034，保藏为CNCMI-3664。定制的双歧杆菌细胞可基本上缺乏tetW基因的核酸序列。在一项实施方案中，定制的细胞在其基因组的剩余部分是基本上未改变的。

本发明的另一方面特征在于包含上述细胞的动物双歧杆菌。

本发明的另一方面特征在于产生缺乏有效的预定功能基因的双歧杆菌细胞的方法。该方法包括下述步骤：(1)从双歧杆菌中获得预定功能基因的上游和下游序列；(2)用在双歧杆菌中非复制的质粒转化双歧杆菌细胞群体，所述质粒包含该功能基因的上游和下游侧翼序列和编码选择性标记的基因；(3)在允许含有编码质粒中选择性标记的基因的细胞生长、但那些不具有编码选择性标记的基因的细胞不能生长的条件下培养双歧杆菌细胞，从而选择含有整合质粒的转化体；(4)在非选择性条件下培养转化体，所述条件允许细胞的生长但允许整合的质粒丢失；(5)通过在具有和不具有选择压力的平板上影印培养菌落并选择那些对选择压力敏感的菌落来选择已失去所整合质粒的细胞；和(6)确认对选择压力敏感的细胞不再具有所述功能基因的功能，从而产生出缺乏有效预定功能基因的双歧杆菌细胞。

在某些实施方案中，预定功能基因被缺失。功能基因可为提供对抗生素增强的抗性的基因；例如，提供对四环素抗性的tetW基因。

在本文所述的某些实施方案中，缺失的或致使其失效的唯一功能基因是预定的功能基因。

在多种实施方案中，选择压力是抗生素例如大观霉素的存在。

在某些实施方案中，质粒通过同源重组整合进基因组。整合质粒可通过第二次同源重组而失去。

在前述方法的多种实施方案中，在非选择性条件下培养转化体至少大约100代。

上述方法可在动物双歧杆菌种的双歧杆菌细胞上实施，更特别地在动物双歧杆菌乳酸亚种，且甚至更特别地动物双歧杆菌乳酸亚种菌株NCC2818细胞上实施。从对菌株NCC2818实施该方法所获得的细胞通过动物双歧杆菌乳酸亚种菌株NCC9034来例证。

上述方法还可在长双歧杆菌(B.longum)种的双歧杆菌细胞上实施。

本发明的另一方面特征在于动物双歧杆菌乳酸亚种细胞，如利用平板扩散试验所测定的，其对高于大约0.3微克每毫升的四环素浓度是敏感的。在示例性实施方案中，动物乳酸双歧杆菌细胞是菌株NCC9034。

本发明的其它特征和优势将通过参考下列的发明详述、附图和实施例而得到理解。

附图简述

图1.pMDY28的限制性内切酶切割位点图谱，其显示出大观霉素(spec)和氨苄青霉素(Amp)抗性标记的位置。tetW侧翼序列插入ApaI位点(碱基659)和位于6840的HindIII之间。质粒不含有用于在双歧杆菌中复制的有效ori。

图2.上图显示了从两个单独的突变体(命名为A和B的泳道)获得的基因组DNA的ClaI、EcoRI、KpnI和NotI限制性片段的DNA印迹分析。泳道C含有获得自用于产生突变体的野生型菌株(NCC2818)的比较片段。下图显示了在DNA印迹上观察到的片段的大小，所述片段是获得自突变体(A&B)的与获得自野生型菌株的那些。

图3.如利用E-TEST检测最小抑制浓度(MIC)所测定的，动物双歧杆菌乳酸亚种菌株NCC362(野生型)(左图，大约16μg/ml四环素)和NCC9034(右图，大约0.3μg/ml四环素)对抗生素四环素的抗性。

图4.NCC362(上图)和NCC9034(下图)菌株的tet基因座图谱，显示出后一菌株中tetW基因的缺失。用于产生敲除突变体的tetW侧翼序列显示于两图中的阴影条形中。

图5.pMDY24的限制性内切酶切割位点图谱，显示出氯霉素(Cm)和氨苄青霉素(Amp)抗性标记的位置。Bl0108侧翼序列插入EcoRI位点(碱基1)和位于5766的SalI之间。质粒不含有用于在双歧杆菌中复制的有效ori。

图6.NCC2705(上图)和NCC9035(下图)菌株的Bl0108基因座图谱，显示出后一菌株中Bl0108基因缺失。用于产生敲除突变体的Bl0108侧翼序列显示于两图中的阴影条形中。

图7.图A显示在第二次重组事件和在BL0108缺失方法的最后步骤中质粒解离后获得的氯霉素敏感克隆的PCR分析。来自两个菌落(第1&2泳道)的PCR片段的大小表明Bl0108(3885bp)的缺失，然而来自10个其它菌落的PCR片段的大小表明Bl0108基因座的野生型构型。图B显示了取自两个单独的突变体(第1&2泳道)的基因组DNA的HindIII限制性片段的DNA印迹分析。泳道3含有获得自用于产生突变体的野生型菌株(NCC2705)的比较片段。下图显示了在DNA印迹上观察到的片段的大小，所述片段是获得自突变体(1&2)的与获得自野生型菌株(3)的那些。

图8.用于从双歧杆菌细胞缺失功能基因的通用策略的图解。该策略是用于本文所述的方法中以及实施例中策略的一个例子。简要地，将目的突变区域(在此实施例中为突变的tetW基因座)克隆进大肠杆菌(E.coli)质粒中(A)并转化至双歧杆菌细胞中(B)。通过同源重组获得质粒向双歧杆菌基因组的整合，并通过在含有合适抗生素(在本实施例中为大观霉素)的生长培养基上平板接种细胞进行选择(C)。在无抗生素选择下复制细胞以便允许导致质粒解离的第二次同源复制事件(D)且染色体区域以如图A中所述质粒相同的构型突变。等位基因交换之后含有野生型基因座区域的质粒不能在双歧杆菌中复制，并且在无抗生素选择的培养基上培养的细胞复制过程中被消除(E)。用合适的分子生物学技术例如PCR或DNA印迹分析来检查最终的突变细胞。

说明性实施方案详述

细胞和培养物

在本发明的几方面的第一方面提供了双歧杆菌细胞，例如来自动物双歧杆菌或长双歧杆菌的那些，其包含定制的从而缺乏或基本缺乏有效的预定功能基因的基因组。任何特定的预定基因的定向破坏或缺失都还未在双歧杆菌中完成。

在一项实施方案中，双歧杆菌是来自食品或饲料加工或者饮食或药物补充物中所用菌株的细胞。合适的双歧杆菌菌株包括但不限于动物双歧杆菌和长双歧杆菌的菌株。另外合适的为分类或未分类的其它双歧杆菌，其被有意地添加至食品或饲料产品，或大量发现于食品或饲料产品中。其它有用的双歧杆菌种包括由于制造或生产食品或饲料、或通过其它商业过程、或通过人或动物对此类产品的消费而释放进环境的任何细胞。双歧杆菌种还可以有意作为人类或动物，包括人类婴儿和动物幼崽的补充物的多种形式获得，例如用来治疗胃肠状况例如腹泻、或促进健康的肠道微生物区系。在一项实施方案中，细胞是动物双歧杆菌乳酸亚种细胞。

尽管所要破坏或缺失的基因可为任何功能基因(例如，为细胞编码功能的任何基因)，在一项目前优选的实施方案中，功能基因提供抗生素抗性。在具体的实施方案中，基因是获得性抗生素抗性基因，即，认为基因不是双歧杆菌细胞中当前发现的内在基因，而认为其为非外在的，例如来自环境或另一生物。在另一实施方案中，功能基因编码酶或酶抑制剂，例如能够负面影响食品加工或生物的其它目的特性(例如，促进健康肠道微生物区系)的抑制剂。本领域技术人员将理解，多种此类抑制剂可由一种或多种基因编码。在一项实施方案中，抑制剂是蛋白酶抑制剂。

在特别的实施方案中，基因产物提供了对四环素的抗性。在一项实施方案中，功能基因是tetW。已知tetW基因分布相对广泛。在一项实施方案中，动物双歧杆菌乳酸亚种菌株NCC2818目前优选作为含有待缺失tetW基因的细胞来源。tetW基因座序列显示于SEQ ID NO：1中。

在某些实施方案中，野生型细胞与本发明的细胞即具有缺失基因的细胞相比对更高浓度的抗生素有抗性。微生物细胞对特定抗生素的敏感性可以多种方式进行测定。测定抗生素敏感性的一种方便的方法是利用平板扩散试验，例如E-试验(由AB BIODISK在商业上生产)。E-试验系统使用在塑料条上的抗生素浓度的预制梯度并可用于测定抗生素对特定生物的精确的最小抑制浓度(MIC)。

在目前优选的实施方案中，本发明的双歧杆菌细胞具有被破坏的tetW基因，但无其它功能基因缺失，且该细胞比含有有效tetW基因的对照野生型细胞对四环素更敏感至少5倍。在另一实施方案中，具有失效的tetW基因的双歧杆菌细胞比含有有效tetW基因的对照细胞更敏感至少10倍。

在一项实施方案中，如用平板扩散试验所测定的，具有失效的tetW基因的双歧杆菌细胞对高于大约0.3μg每毫升的四环素浓度是敏感的。

如本文所用的，与基因组有关的术语“定制的”表明该基因组已通过人手进行处理或修饰。在一些实施方案中，通过缺失特定基因的整个基因座来定制基因组。在其它定制的基因组中，调节序列中的缺失或突变可提供预定基因功能性的完全或至少基本丧失。除了那些经操作而丧失整个基因座、基因或甚至编码序列的基因组外，定制的基因组包括仅仅具有小的改变(包括插入或缺失)的那些，所述改变例如导致功能基因的功能丧失或基本丧失的点突变或移码突变。

尽管定制导致有效性的完全丧失是优选的，但这也许不总是容易完成的，并且有时某种活性的基本丧失将是有用的。如本文所用的“基本上丧失”表明多于一半的功能活性丧失，即具有定制基因组的细胞具有由预定功能基因所提供的功能属性的一半以下。例如，当与其所来源的亲本细胞相比较时，具有关于酶的定制基因组的细胞将具有该酶的低于50％的活性。备选地，具有定制基因组的细胞可产生少于50％的与预定功能基因相关的基因产物。本领域技术人员将理解，在处理某些功能活性中，具有少于50％的特定功能基因的基因产物的细胞可能不总是丧失细胞中可测定活性的50％。

优选在定制的基因组中，在其本身编码序列中至少有一个点突变或移码突变，以便阻止完整功能基因向与具有定制基因组的细胞邻近的、或其环境中的其它细胞转移。因此，如本文所用的，“定制”需要有基因组的操作，其中该操作针对预定功能基因有效性的丧失或基本丧失。

因此，在一项实施方案中，功能基因是完全缺失的、或至少部分缺失的。该实施方案确保了没有功能性抗生素抗性基因可不经意地转移至环境、其它肠道微生物区系、或环境中的其它生物中，并且还确保了甚至没有一个破坏的基因可被转移以仅通过下游事件而被恢复。因此，在优选的实施方案中，根据本发明此方面的双歧杆菌细胞基本上缺乏tetW基因的核酸序列。在一项实施方案中，编码序列至少基本上缺失。备选地，与预定功能基因相关的一个或更多编码序列也可被缺失。例如功能基因的在细胞中无其它功能的结合序列或调节序列可被缺失。在其它实施方案中，具有定制基因组的细胞具有更精细的改变，例如导致预定基因的功能性丧失或基本丧失的点突变或移码突变，例如，定制的基因组的功能基因的有效性降低。

另外在优选的实施方案中，双歧杆菌细胞在其基因组的剩余部分中是基本上未改变的。换句话说，除了丧失功能基因的有效性，并且优选该功能基因完全或至少基本上从细胞缺失外，双歧杆菌细胞与其来源的细胞(例如亲本细胞)是相同的，或接近相同的。在已经经过长时间适应从而提供目的特性的菌株或培养物的情况下，这是特别有用的，所述目的特性对于例如食品加工，例如乳制品例如酸乳等的发酵是有用的。例如，在下面更加详细描述的一项实施方案中，其中动物双歧杆菌乳酸亚种NCC2818是起始(亲本)细胞，tetW是预定的功能基因的情况下，所获得的细胞是动物双歧杆菌乳酸亚种NCC9034，其定制的基因组与亲本区别仅在于缺乏预定的tetW基因。如预期的，除了NCC9034细胞所展示出来的对四环素增加的敏感性，细胞在表型上也是类似的。前述实施方案对用于帮助治疗临床状况的菌株也是有用的，特别是那些已经选择或开发而具有目的功能例如快速的传代时间或在肠道中延长的停留时间的菌株。

在其几个方面的另一方面，本发明提供了双歧杆菌的培养物，其包含具有缺失的、或至少失效的功能基因的细胞。此类培养物的用途无需详细讨论，因为本领域技术人员将理解它们。在一项实施方案中，培养物包含来源于已知培养物的细胞，该已知培养物经发现或测定在其基因组中具有不期望的功能基因。在一项实施方案中，基因是外源获得性基因，例如编码抗生素抗性的基因。在一项实施方案中，基因是四环素抗性基因。在一项特定的实施方案中，基因是tetW基因，且在特别的实施方案中相关的tetW基因序列是SEQ ID NO：1中提供的序列。

制备细胞和培养物的方法

在另一方面，本发明提供了生产缺乏有效预定功能基因的双歧杆菌细胞的方法。该方法包含下述步骤：

从双歧杆菌中获得预定功能基因的上游和下游序列；

用质粒转化双歧杆菌细胞群体，所述质粒在双歧杆菌中是非复制的且包含所述功能基因的上游和下游侧翼序列、以及编码选择性标记的基因；

在仅允许含有编码质粒中选择性标记的基因的细胞生长的条件下培养双歧杆菌细胞，从而选择已将质粒整合进染色体的功能基因的基因座上的转化体；

在非选择性条件下培养转化体，所述条件允许细胞的生长但允许整合质粒的丢失；

通过在具有和不具有选择压力的平板上影印培养菌落并选择那些对选择压力敏感的菌落来选择已失去所整合质粒的细胞；

确认对选择压力敏感的细胞不再具有所述功能基因的功能，从而产生缺乏有效预定功能基因的双歧杆菌细胞。

如上面对细胞和培养物的描述，优选双歧杆菌细胞来自食品或饲料加工中所用的细胞，例如动物双歧杆菌或长双歧杆菌。考虑将其它双歧杆菌用于本文，例如那些用于人类或动物临床治疗的、或其中预防所用的双歧杆菌。在一项实施方案中，用作起始细胞的细胞是动物双歧杆菌乳酸亚种。在本文例证的某些实施方案中，动物双歧杆菌乳酸亚种细胞是菌株NCC2818(商业上可以“BB12”获得自Chr.Hansen)。

缺失的基因可为任何功能基因(例如，为细胞编码功能的任何基因)，在一项目前优选的实施方案中，功能基因提供抗生素抗性。在具体的实施方案中，基因是获得的抗生素抗性基因，即，认为基因不是双歧杆菌细胞当前发现内在的，而认为其为外在的，例如来自环境或另一生物。

在一项实施方案中，致使失效或缺失的基因编码对四环素的抗性。在一项实施方案中，功能基因是tetW。在一项实施方案中，tetW基因具有如SEQ ID NO：1所提供的序列，其代表了动物双歧杆菌乳酸亚种NCC2818中整个tetW基因座。在一项实施方案中，起始细胞是动物双歧杆菌乳酸亚种细胞菌株NCC2818。这些细胞的样品按照布达佩斯条约的规定已保藏于巴斯德研究所的专利保藏机构中。当动物双歧杆菌乳酸亚种NCC2818是起始细胞时，tetW是预定的功能基因，所获得的细胞是动物双歧杆菌乳酸亚种NCC9034，其样品也按照布达佩斯条约的规定已保藏于巴斯德研究所的专利保藏机构中。

在某些实施方案中，野生型细胞与从所提供的方法获得的细胞相比对更高浓度的抗生素有抗性。平板扩散试验和相关敏感性测试例如E-test(ABBIODISK)是检测细胞对抗生素敏感性的优选途径。然而，所测定的抗生素对特定生物的最小抑制浓度(MIC)是比较相对敏感性的便利途径。

在目前优选的实施方案中，本发明的双歧杆菌细胞具有被破坏的或缺失的tetW基因，但没有其它功能基因在其功能方面受到损失或破坏。在一项实施方案中，由该方法产生的细胞比含有有效tetW基因的对照野生型细胞对四环素更敏感至少5倍。更特别地，所获得的双歧杆菌细胞比含有有效tetW基因的对照细胞对四环素更敏感至少10倍。在其它实施方案中，细胞比保留tetW基因的对照细胞更敏感20、30、40或甚至50倍或更多倍。在特定的实施方案中，如利用平板扩散试验或E-TEST所测定的，所获得的双歧杆菌细胞对高于大约0.3μg每毫升的四环素浓度敏感。

如上所述，对于细胞和培养物，在一项实施方案中，功能基因被完全缺失，或至少基本上缺失，使得没有功能性抗生素抗性基因可不经意地转移至环境、其它肠道微生物、或环境中的其它生物中。类似地，甚至没有一个被破坏的基因可转移，因为基本上所有的序列已从生物丢失。因此，在此类实施方案中，根据该方法制备所获得的双歧杆菌细胞基本上缺乏tetW基因的核酸序列。在多项实施方案中，编码序列至少基本上缺失，且甚至与预定功能基因相关的非编码序列也被缺失。

在目前优选的实施方案中，除了缺失或致使失效的基因外，所获得的双歧杆菌细胞基因组基本上未改变。优选地，除了致使失效或缺失的功能基因外，所获得的双歧杆菌细胞的基因组与其来源的细胞(例如，亲本细胞)的是相同的或近乎相同的。因此，由本方法所产生的细胞将与其来源的亲本、野生型或原始型菌株具有基本上或甚至完全相同的功能或属性(例如营养需求、酶谱、生长特性、风味产生、和酸产生)。因此，如此产生的细胞可用于产生有用的双歧杆菌培养物，其包含具有缺失的、或至少失效的功能基因的细胞。当细胞来自已知培养物时这是特别正确的，其中发现已知培养物在其基因组中具有不希望的功能基因，例如获得的抗生素抗性基因，例如四环素抗性基因，特别地tetW基因。

在本方法的一项实施方案中，质粒编码另外的选择性标记。在某些实施方案中，选择性标记提供了抗生素抗性。在此类实施方案中，筛选整合质粒的转化体的选择性条件包括以对应于抗性标记的抗生素形式的选择压力。在一项实施方案中，抗生素是大观霉素，在另一实施方案中其为氯霉素。

在某些实施方案中，质粒通过同源重组整合进基因组，优选地位于上游和/或下游侧翼序列；发生交换事件，从而允许环形质粒变为整合进双歧杆菌基因组。在另一实施方案中，整合的质粒通过第二次同源重组事件而丢失，优选地伴随着丢失全部或基本上全部的预定功能基因——例如，tetW基因座或其它靶向基因。

如上所述，在优选的实施方案中，缺失或致使失效的唯一功能基因为预定的功能基因。

在一项实施方案中，在非选择条件下培养转化体足够的代数，从而允许不需要的序列丢失，包括预定的功能基因。在一项实施方案中，培养至少100代将促进此类丢失。

提供下列实施例进一步解释本发明的这些或其它方面，并不应理解为将本发明限制至所举例的内容。

实施例

非复制性质粒的构建

用下列引物对扩增tetW起始密码子上游和其终止密码子下游两侧的大约3kb的DNA片段：

mdy100：5’-CGCACCGGGCCCCCTCACGCAAACTCTACG-3’(SEQID NO.：2)；

mdy98：5’-TGTGGTGTATCACATGTGATTGTCCTCCCTTTA-3’(SEQ ID NO.：3)和

mdy99：5’-AGGACAATCACATGTGATACACCACAGCGAGG-3’(SEQ ID NO.：4)

mdy89：5’-CCGTCCAAGCTTTCTATCGCGAGATAATCAGC-3’)(SEQ ID NO.：5)。

将获得的扩增产物用作模板，利用引物mdy100和mdy89来进行融合PCR，其获得含有通过tetW的起始和终止密码子连接起来的tetW上游和下游区域的DNA片段。

通过HindIII和Apa1在其末端消化DNA片段并将其克隆进pJL74(Ledeaux和Grossman，J.Bacteriol.1995Jan；177(1)：166-75.)中位于HindIII和Apa1之间。所获得的质粒命名为pMDY28(SEQ ID NO.：6)。图1提供了详细的限制性内切酶位点图谱。插入pJL74从而形成pMDY28的DNA片段的序列得到验证并显示与来自动物双歧杆菌乳酸亚种NCC2818染色体的序列相同。这表明在PCR介导的DNA扩增过程中和在随后的DNA操作中均未引入突变。

动物双歧杆菌的转化和等位基因交换

利用Argnani等人1996(Microbiology；142：109-14.)所述的方法将质粒pMDY28转化入动物双歧杆菌细胞中。将细胞置于每升含有100mg大观霉素的MRS平板上。厌氧选择所获得的spec^R转化体。由于质粒pMDY28不能在动物双歧杆菌中复制，spec^R菌落最可能来自经单次交换事件通过同源重组而整合进动物双歧杆菌基因组的质粒。从前还未报道过非复制性质粒向双歧杆菌细胞的成功转化。

在无抗生素选择的MRS培养液中培养spec^R转化体大约100代从而允许质粒丢失，并将单独的菌落平板接种于MRS琼脂培养基上。为了确保质粒已从动物双歧杆菌基因组中移除，通过在添加和不添加大观霉素的MRS琼脂上影印培养测试单独菌落的大观霉素抗性的丢失。

在所测试的750个菌落中，163个菌落是大观霉素敏感的(21％)，表明质粒已通过第二次交换事件的发生从动物双歧杆菌染色体中切除。

第二次此事件可导致两种基因组构型：

i)回复至带有与野生型细胞相同的tetW基因座的野生型构型，或者

ii)缺失tetW。

为了区别这两种可能性，利用下列引物对通过直接菌落PCR测试了上述163个大观霉素敏感菌落中135个菌落的tetW缺失：

mdy94：5’-GAGCATGTATTCGGTGTCG-3’(SEQ ID NO.：7)和

mdy95：5’-GATTTGCCCTATCGACTG-3’(SEQ ID NO.：8)。

在135个所测的菌落中，两个产生了1034bp的DNA条带，表明tetW缺失，而其它获得了与野生型细胞所获得的相似的更高分子量(2949)的PCR片段(见图2，小图B)。

tetW缺失突变体的DNA印迹分析

利用从经PCR分析所鉴定的两个候选突变体提取的基因组DNA，通过PCR和DNA印迹分析证实了tetW的缺失(见图2，小图A&B)。用限制性酶(ClaI、EcoRI或NotI)消化染色体DNA样品。DNA印迹与来自pMDY28的DNA杂交。DNA印迹杂交确认tetW已从两个候选突变体的基因组中缺失(泳道A&B)。仅保留了一个菌株，随后将其命名为NCC9034。

动物双歧杆菌乳酸亚种菌株NCC9034相对于NCC2818的抗生素敏感性测试

将动物双歧杆菌乳酸亚种野生型菌株NCC2818的四环素敏感性与显示出缺失了基本上全部tetW基因的衍生菌株NCC9034相比较。使用商业化的E-TEST(AB BIODISK)测定每个菌株的四环素MIC。

结果显示于图3中。尽管菌株NCC2818具有16μg/ml的MIC，NCC9034对四环素更加敏感，具有仅大约0.3μg/ml的MIC。因此，NCC9034比其亲本野生型菌株NCC2818对四环素更敏感大约50倍。该敏感表型与tetW基因功能性的丧失完全一致。如上面DNA印迹分析中所看到的，这得到了基因分析的支持。

编码蛋白酶抑制因子蛋白质的长双歧杆菌基因(Bl0108)的缺失

非复制型质粒的构建

利用下列引物对扩增Bl0108两侧大约3kb的DNA片段：

mdy82：5’-CGACCCAAGCTTGGATCGGCTCGTGCATCATTGC-3’(SEQ ID NO.：9)；

mdy83：5’-GCAAACCGTACCTCAATACC-3’(SEQ ID NO.：10)和

mdy84：5’-CGACCCAAGCTTGCAGTCCGTCAATTAGGGTG-3’(SEQID NO.：11)

mdy85：5’-CGTTGCTGACGTTGCGGTTC-3’)(SEQ ID NO.：12)。

利用EcorI和HindIII消化用mdy82和mdy83所获得的PCR产物。通过HindIII和Sau消化用mdy84和mdy85所获得的PCR产物。

通过它们共同的HindIII限制性位点连接扩增的DNA片段，并通过三路连接将其克隆进入pJH101(Ferrari，F.R.等人，J.Bacteriol.(1983)154：1513-1515)在EcoRI和SalI之间。将所获得的质粒命名为pMDY24(SEQ ID NO.：13)。pMDY24详细的限制性内切酶位点图在图5中提供。

长双歧杆菌的转化和等位基因交换

根据Argnani等人1996(Microbiology；142：109-14)所述的方法将质粒pMDY24转化进长双歧杆菌NCC2705细胞中，只是在生长培养基中省去蔗糖。将细胞涂布在含有每升3.5mg氯霉素的MRS平板上。厌氧选择所获得的cm^R转化体。因为质粒pMDY24在长双歧杆菌中不能复制，cm^R菌落最可能来自于经单次交换事件通过同源重组整合进长双歧杆菌基因组的质粒。

在将单独的菌落平板接种于MRS琼脂培养基之前，在无抗生素选择下培养cm^R转化体大约100代从而允许质粒丢失。为确保质粒已从长双歧杆菌基因组中移除，通过在添加和不添加氯霉素的MRS琼脂上影印培养来测试个体菌落的氯霉素抗性的丢失。

在所测试的200个菌落中，22个菌落是氯霉素敏感的(11％)，表明质粒已通过第二次交换事件的发生从长双歧杆菌染色体中切除。

第二次交换事件可导致两种基因组构型：

i)回复至带有与野生型细胞相同的Bl0108基因座的野生型构型，或者

ii)缺失Bl0108。

为了区别这两种可能性，从22个氯霉素敏感菌落的12个中提取染色体DNA。利用下列引物对通过PCR测试了染色体DNA中Bl0108的缺失：

mdy27：5’-TCGGAAGATCTCATGGTCAACGAGTTCGC-3’(SEQ IDNO.：14)和

mdy39：5’-TAGTACTAAGCTTCTTGAGCTCTTCCTTCTGC-3’(SEQID NO.：15)。

在所测的12个菌落中，两个显示出3885bp的PCR片段，表明Bl0108的缺失(图7，小图A，泳道1-2)。测试的其它10个菌落导致与野生型细胞所获得的片段相似的5311bp的较大PCR片段(见图7，小图A，泳道3-12)。

Bl0108缺失突变体的DNA印迹分析

利用从如上所述的经PCR分析所鉴定的两个候选突变体提取的基因组DNA，通过PCR和DNA印迹分析证实了Bl0108的缺失，并显示于图7。用限制酶(EcoRI和HindIII)消化染色体DNA样品。用来自pMDY24的DNA与DNA印迹杂交。DNA印迹分析确认Bl0108基因已从两个候选突变体的基因组中缺失(图7，泳道A和B)。仅保留了一个菌株，随后将其命名为NCC9035。

序列表

<110>F·阿里戈尼

M·戴雷

<120>双歧杆菌中的遗传重建

<130>48520-1009-P1(NO 8025/US/PSP)

<160>15

<170>PatentIn版本3.3

<210>1

<211>26917

<212>DNA

<213>动物双歧杆菌

<400>1

agtgatggag acctatgccg accaccgtat ggccaccttc gccgcgatgc tcggattggc   60

gattgatggc attgaagtaa cgaatgtgga gaccacgcgc aagacgattc cggatttcgt  120

gggtatgtgg aatggcatgt tgcgcggcaa gtgacagtag gcgcccggaa aaatgtgagg  180

ggctgcaaga cgaacggtct tgcagcccct cacatttttt gtggagaatc agatcttgtt  240

gccgtaggtg tcttccccgg cggtgacgat ctcgttggcg cgctgtgcga tggcgagctc  300

ctcattggtg gggtagacga cgacggtgac agtggaatcc ggcgtggaga taatgcgcgg  360

ttccttcgaa cgggtgtcgt tcttgtcgtt gtcgagcttg acaccgaacg gtgccagctt  420

ctcacacacc atgcggcgaa cgatttcgtc gttctcgccg acaccggcgg tgaaggtgag  480

cacatcgagg ccgccgagct gtgcggtgta ggcgccgatg tagctgacga tgcggtgcac  540

gtagatgtcg agggcgagct tggcgttctc gtcgccttcc gcaacgaggc ggtgcacttc  600

gcgcatgtcg ccgaagccgg tcatgcccat catgccggac ttcttgttga acaggtcgtc  660

gagctcatcg acattcatat cggcattgcg catcaggtgg aacacggcgg ctggatcgat  720

gtcgcccgtt cgggagccca tgacgaggcc ttcgagcggg gtgaggccca tggaggtctc    780

gatggggcgg ccgccgagtt ccgcggaggc ggaggcgccg ttgccgatgt gcagcacgat    840

ctgcttgagg cccttggcgg cctcggcgtc aatgccgagg aactctggaa tctgggagga    900

gacgaaccag tgcgaggtgc cgtgtgcgcc gtaacgcttg atcttgtact tgtcggcgac    960

ttccttgttc aacgcatagg tgctcgatgc cttcggcagc tgctggaaga aggaggagtc    1020

gaagacataa acctgcggaa tctcagggag cagctcgcgc atgactcgcg cccccttggc    1080

ctccgggccg ttgtgcagcg gagcgagcac agccagctcc tcgaccttgg cagtggtgtc    1140

gggggtcacc aaggcagggt tcgggaaggt gtcgccgccc tggacaactc ggtgcccgac    1200

ggcgatgatg ccggtctctt caaggctcgg gccgtattcc tcgaagaacc cgagcacgcg    1260

cttgaggccc tgctcatggt tttcgacctt ctcgtcgagc tcgtgctttt cgccgttgta    1320

ttcgtacttg tagtggccgt caatcggttc gccgatcttc tcgacgatac ccgatgcgat    1380

tccttcgccg gactcgagat ctaccagctg gtacttgatc gagctagaac ccgaattgat    1440

aacaaggacg gttttcgcca ttgtggcatc ctccattggt gattgctctg ccgctatgcg    1500

gctttccaac acacaagatt actcaatgtt tgctacaaaa cggtgaatgg gtgccctctc    1560

gttctatatt tcgaaaaagc acccatccac gtcatgaatt cgcgagatgg tgtggactat    1620

tcgttacttt gcgcttcgat ggcggtcaag gcgatggtat tgatgatgtc ctgcaccaag    1680

gcgcctcggc tcaggtcgtt gacaggccgg ttgagcccct gaagcaccgg tccgatcgcc    1740

acggcgccgg aggtgcgctg cactgccttg tagcagatgt tccccgcatc gaggtccggg    1800

aacacgaaca cggtgacatt gccggcaatc gggttgccga aggccttgac cctggcaacc    1860

gtcttcgacc aagcggcatc gaactggatg ggaccgacga tgggtaggtc cggtcgtttg    1920

ttctgggcga tcgaagtggc ctcgactacc agatcgacat ccggtccctt accggaaccc    1980

aaggtggagt aggagagcaa accgattttg ggatcgatgg agaatgcctt ggcggtctcg    2040

gccgactgga tggcgatgtc ggccagctgc tgcggatcgg gatcgaggtt gatggcacaa    2100

tcggcaaata ccgacacatg gtccttgaga cacatgagga aggcacccga tacggaggag    2160

acaccgggtt tcgtcttgat gagctggagc gcggggcgca cggtgttggc ggtggagctg    2220

atggcacctg agaccagacc atcggccatg ccgagcacga tgagcatggt gccgaagtag    2280

ttcgtgtccc tgagtgtctt cagagccaca tcgggggtca tgcccttctt ggcgcgcaat    2340

tcgcacagtt tgggcaccat ggtgtcgagc agatgcttgt cgtcgatgga gacgaacttc    2400

gcctgatcaa gcgccttgag gccgagtttt tcaccccggg caagaatctc gttgcggtcg    2460

ccgatgatga ccagatcgac cacattcgac tgcagcaggt agttcgcggc ggtgatgatg    2520

cggtcgtcct ctccttccgg tagcacaatc gtcttcttgt ctttcttcgc acgtgcgagc    2580

agatcgtact ggaacgcgaa tggtgtggtc ggcggtacga aaggtgtgtc aagcacgttg    2640

aggagtgatt ccttgtcgac atgctcgtcg aaggcatcga gcgcggcctt gacattcgtg    2700

1cagcggaac cgagttccac gaggggaagc ggccacgtcg gcaggtcgta gctcacgaat    2760

tcgtcggtga gtgtgggcag cgccgaattc gtgcagtcgg tgatgaacac gccgatcact    2820

tgggtgcctg cgttggcgac cacctcgcgg catgcgtcta tcgtctcacg aatctcgtcc    2880

ggcgtgcgtc ccatcgagct cactgagagc agcaccggag actgcaggtc ggcggagacg    2940

tccgcattga aggtgaaccg ttcgggatcg cccacattgg tgcggtctga tccgacgatc    3000

actcggatct gcggattgat ctcggcattc gtgtcgatga atttggagac gatctgctgg    3060

cgggcattgt ctttgtcaag acgtgcgtca tgcagtgtga cgccgacggc ctgttcgcgc    3120

gtctgcagca cgctcaccac cgagaggagt gcatcggtga gattttcgtc tgcctgcacc    3180

gccggtcgga atatgctggt cttcgcggtg tgggcgagca tatccaccac acccaatgcc    3240

accacgttcc ggccgtctcc aggttcggga ctgatgatgc tcacgttttt gaggctcacg    3300

atgactcctt tgaaatcgat gatctgcctg acgtgcgact gcgttgtgca cgcagaccat    3360

tgtaactggg aagggggcgt ggcagaccgg ttattttgca attgccacga gaatgtgacg    3420

caggtcacat tctgtatggg tatgggatat tcggcgttgt gtgatggata gcaaatggat    3480

agcaaaaggc ccgggtgctg acacccgggc ctttcatcgg ctaagcgatg agactatgct    3540

cactcgttgt cgccggcggt cgcggcggtg gcggagagca tggaggtctc gtcgaccttg    3600

acatccgggt acacccaatc ggtgaactca ggaatgtcat agccattgtc gacggcgaac    3660

tggaacgcgg tcttgcggaa ctcgttgagc tcgttgatct tgtcggcata cttgtcggcg    3720

tcgatgagct cgagggcctt ggcctgaagg gcgtagcgat ccatgtcgtt gacacgcacc    3780

atgtcgaacg gcgtcgtcgt ggagccctgc tccttgtatc cgacaacggt gaagttgtcg    3840

tggttcgggc ggtcgtagat gaggccacga acgtcctggg cataggagtg gtaggcgaag    3900

aggaccggct tgtccgcggt gaacaggtcg gcgaagtcct cgtcagacat ggcctcgtcg    3960

ttctccttcg aggactgcag cttgatgagg tccacgacgt tgacgacctt gaacttgatg    4020

cccatcttgt tgagggcatc ggaagcggcc atgatctcct gggtcgggac gtcgccggcg    4080

gcggcgagga caacctggac ctcgtcgttg ctcttggcgt tggaagccca cttccactcg    4140

gcggcaccag cctcgagctc ggcgcgtgcc tcgtcgaggg tgatccacgt cgcggccggc    4200

tgcttgccgg cgaagattgc gttgatcttg ttggtggact tgaagcactt ctcggcgatg    4260

gccagcagca tgttggcatc ggtcgcgaag tagatgttcg tcacgtggtc gttgttgaac    4320

gtcttgttca gcaggacgga ggtcacaccc ggatcctggt gcgagaagcc gttgtgatcc    4380

tgacgccaca cgtgcgagga gaccaggagg ttcaccgagg agatcggctt acgccacggg    4440

atctcgcgga cggtggcctc gagccacttc gcatgctggt tcagcatgga gtcgatcacg    4500

tgcacgaagg actcgtagga gctccagatg ccgtgacggc cggtgagcag gtaggcctcg    4560

aggaagcctt cgcactgatg ctcggagagc tgctcgacaa cctggccggt gacggccatg    4620

ttctcgtcga cgagagccga gaggtatccg ttgtcccact gcttcttggt gacctcgtag    4680

gtcgcgttca gacggttgga cgcggtctcg tcaggtccga agacgcggaa cgaatccggg    4740

ttgttcttga tgatgtcgcg gcagtacgcg ccgagggaac gcggagcctc gacctggccc    4800

caaccgtggc cgtattcctt gacgccggtg atctcgtact gatcgagctc agggagcttc    4860

agatcctcgc ggatgcggcc gccgttggca ttcgggttgg cgccgatgcg cagttcgccc    4920

ttaggcatga atgcggtgac gtcctccttg atggagccgt cggcgttgaa gagctcctcc    4980

ggcttgtagg attccatcca gcccttgagg acttcgaagt gggcctcggt gtcgcgggcg    5040

gaagccagcg ggacctggtg tgcacgccag gagccttcgg tcttcttgcc gtcgatgaac    5100

ttcgggcagg tccagccctt cggggtgcgg aagatgagca tcgggtagaa cggacgggtc    5160

atgtcgtcgg tctgagccgc agccttgata tcgcagatct cgtcgaagat ggtctcgaag    5220

agctcggcga agcgacggtg gatcgacagg tgatcctcgt tgtcgaagcc ggcgacgaac    5280

tcgtacgggt ggtaacccat gccgcggaag aagtcgtgca gctcctcgtc ggagatgcgg    5340

gcgaggatcg tcgggttggc gatcttgtag ccgttgaggt gcaggatcgg caggacgatg    5400

ccgtcggtgc gcgggttgac gagcttgttg gactgccagc cggtggccag agggccggtc    5460

tcggcttcgc cgtcaccgat gatgcacggg acgaagaggc tcgggttgtc catgatcgcg    5520

ccgtaggcgt gcgacagggc gtagcccagc tcgccgcctt cgtggatgga gcccggcgtc    5580

tccggagcga agtgggaagg aatgccaccc gggtaggaga actggcggaa gaacttctgc    5640

aggccagctt cgtccttggt gatgttcggg tagtactcgg tgtaggtgcc gtcgatgtag    5700

gactgagcgg tacctgcagg gccgccgtgg ccaggaccca tgatgaacac ggtgttctgc    5760

tggtgatcgg cgatcaggcg gttgatgtgg gcgagaagga agttcaggcc cggggtggtg    5820

ccccagtggc cgaccagacg gtgcttcacg tcatcgcggg tgaagggctc cttcatcagc    5880

gggttgctac gcaggtagat ctggccgata gacatgtagt tggcgacgcg ccagtacttg    5940

tccatgcctt cgatggcctc ttcggaaacc ggacgatcca gcttctgcca tggggtacca    6000

ataacaggat tagtcatgtg tgctcctgta ctcctgcaca taaatgtgcg atttgtttat    6060

tccgttgggc acgggcttcg gcgctgtcct gcaggccggt ctccgtgccc gatcgctgat    6120

tatgttacgc gaatacgctg acctttttgc agtttttgaa acagtgtgag cgaatctgtg    6180

cgcataattt gcgaatttgg gagattgctc gggcgatttg tgaaaatgga aaatcagtga    6240

ataaaggcga gaaacgttga aataccaacg aatgcaagcg ttttcgccgt cgttgtcgcg    6300

tgcggtttgt gaggatattg cgcggcgtgt tgaaaacaag cgaacaatct ggaaaatcct    6360

tgtgattgca gtgcttgagc gcttaagacg acaccgatgc gacccgtggc atgtgcgaat    6420

ttcaatgtct acttgcctgc gcacaataga tgtgttgtaa tgcccgagta atgaacctat    6480

atataagggg agcgtaatgg cagcaggtcc tgtccttgtc gttgatttcg gagcgcagta    6540

cgcgcagctc atcgcgcgcc gcgtgcgcga ggcgaacgtg tattccgaat tggtgcctca    6600

ttcgatgccg gtcgaggaga tgctggccaa gaagccgtcc gcgatcatac tgtcaggcgg    6660

cccggcgtcg gtgtacgaac ccggtgctcc caccattgac aagagcatct tcacggccgg    6720

agtgccggtg cttggcatct gctatggctt ccaggtgatg gcccatgagc tcggcggcga    6780

cgtcgacaag gcggcgctcg gcgagtacgg caagacggag gcggtggtgg acgatgccac    6840

gggcattctc gacagttcgc catccctgca gaccacttgg atgagccatg gtgtcgccgt    6900

gaacaaggca cccgccggat tcgaagtcac cgcgcatacc gaaggggcgc cggtggctgc    6960

gatggaggat ccctcacgca aactctacgg cgtgcagtgg catcctgagg tcaagcacac    7020

gccgttggga caggatctga tcgagaattt cctgcatgat tgcgccggca tcgaagccga    7080

ttggaacgca aggaacatca tcgacgagca ggtcgctgcg attcgtgaga aggtcggtga    7140

cgcacgggtc atctgtggtc tgtctggtgg agtcgattcg gccgtggctg cagcgctcgt    7200

gcaccgcgcg atcggtgacc agctcacctg cgtgttcgtg gatcacggtc tgctacgcaa    7260

gggcgaggcc gagcaggtca aacatgattt cgtcgcggcg accggcatca agctcatcgc    7320

cgtcgatgcc tccaaggatt tcctcgatgc actcaagggc gtctccgatc ctgagacgaa    7380

gcgcaagatc atcggcgaaa aattcatccg cactttcgag aaggcgcagc gccaggtgat    7440

agaggaggcc ggtgcccagg gcaaggaggt caagttcctc gtgcagggca cgctttaccc    7500

ggacgtcgtc gaatccggtg gcggcgacgg cgcctcgaac atcaagtcgc atcataacgt    7560

cggtggtttg cctgacgaca tcaagttcga actgattgag ccgctccgtt cgctgttcaa    7620

agacgaggtg cgcgccatcg gcaccgaact cggcttgccg gacgagattg tctggcgtca    7680

accgttcccc gggccgggtc tgggcatccg catcatcggt gagatcacga aggaacgtct    7740

cgacttgctg cgtgatgccg atgcgattgc ccgcgaggag ctctcgaagg ccggtctcga    7800

ccgcgacatc tggcagtgcc cggtcgtgct gctcgccgac gtgcactccg tcggcgtgca    7860

gggcgacgaa cgcacctacg gttcgccgat cgtgctgcgg ccggtcagct ctgaggacgc    7920

gatgactgcc gactggtcgc gtgtgccgta cgacgtgctc gccaccatct cgactcgcat    7980

cacgaacgaa tgccgtcaga tcaaccgcgt tgtgctcgac tgcacgtcga agccaccggc    8040

gacaatcgag tgggaataac tgacaaaacc cgcaaagcct tgaaaacact ggggtcttaa    8100

agcggaaacg gggcatttga tagcaaattg atagcagata ccaaaaccgg atttactttg    8160

ttcactcccg tataacgggt ggcttgcggg taaatcctcc atatcctaag aaaaaggtct    8220

tgctgacttt caccagtcgg caagaccttt tttgttattt gtcttttctc tgtttcttca    8280

atccttttat cagagcatcg cttaattcct tcgaggggac tttggcccac cgctgggtgg    8340

tgtcgtactt cgggtagttg tagcgccagc ggtcatagtc ctccttggtg atctccccgg    8400

cctccaactt cgccgcctgt tcccgccacg caatcaagat tttgttcagc tcactggctt    8460

gacggcctcc ctgaaaaata tctgcttgca ggcaggcacg tccatccgcc tctaccactt    8520

tcagactgta aacatcctcc aaggcgaaca gcgtatgggc caaacctatg tagttgtcta    8580

tgtccgggac gctcaacgcc tggggcgata catctaaggc aataccgcac agaaaaaaag    8640

tgccatatat cgccaagtgt gatataacaa acttatggat aaacagatga cgatttccgc    8700

attcagcgac gaactggcac aggtgcggac gaagaaaaaa gcatttctcg accagattga    8760

acggatcgtc ccgtggaagg aatggcttgc catgattcag ccgtgctatt acaaaggaga    8820

gcgcggcaac aaaccctatc cgctggagat catgctccga ctgtatctgc tgcaaaacct    8880

ctatgacctg agtgacgagg ccacggtggc agaagccatc gacagccgcg cattttcgga    8940

gttctgcggc gtcgattcca gcaaccaggt tccgaacggg gatactcttg gccggttccg    9000

gaacttgctg atcaagaacg gactgcagga gaagctgttc gctcaggtgg tagcagcgct    9060

catggaacgt ggcctcattc tgaaaaaggg caccattgta gattccacca tcatttccgc    9120

cccctcttct accaagaata aggaaaagaa acgggatccg gatgcccacc aagtcaagaa    9180

gggcaacacc tggcactttg ggtacaaagc gcatatcggc gtggacaagg acagcggact    9240

ggttcacaca gtggaagcta caccggcaaa tgtccacgac gttgcggaag tgccgaaatt    9300

attgacggga gaggaagaaa cagtctatgg agacagcggt tatctcggcg caggtaagcg    9360

cgaagatgcc gtagtccgaa acaaagctgg ccggaaaatc aagtacaaga tcaatcgtcg    9420

tccatcgcag atgaagaaac tgagcaaaag cgggcagtac gcagcaaaga aagcggaacg    9480

ggcgaaatcc tcagtgcgag caaaagtaga gcatgtattc ggtgtcgtta agaagcagct    9540

gcgcttccga aaaacgcgat accgagggct tgaaaagcaa caagccaaat tcaatatcat    9600

gtttgcgttg gcaaatctga ttctggctga cagaccctgt ctggcagctt gagtcagtgc    9660

gcctttgcgg acaaaaaatt cggaggttat ccacagtttt tattcggcac ctgctgtata    9720

atgcggattg tggcatttgt gcggtgttgc cttaaataaa actataatca aatagtggga    9780

acaaaggatt atgatagtcc cttttgtagg ggcttagttt tttgtaccca atttaagaat    9840

acttttgcct tatcaatttt gacatatccc caaaaacagc actcacaaac aggtgtatgc    9900

tgtatatgtg tatgtccgca aattatcatc cccagtggta aaagtatttt actgctgggg    9960

atttttatgc ccttcggggc agtaaaggga ggacaatcac atgaaaataa tcaatattgg    10020

aattcttgcc catgtagacg ctggaaagac gaccttgacg gagagcctgc tatatgccag    10080

cggagccatt tcagaaccgg ggagcgtcga aaaagggaca acgaggacgg acaccatgct    10140

tttggagcgg cagcgtggga ttaccattca agcggcagtc acttccttcc agtggcacag    10200

atgtaaagtc aacattgtgg atacgcccgg ccacatggat tttttggcgg aggtgtaccg    10260

ctctttggct gttttagatg gggccatctt ggtgatctcc gctaaagatg gcgtgcaggc    10320

ccagacccgt attctgttcc atgccctgcg gaaaatgaac attcccaccg ttatctttat    10380

caacaagatc gaccaggctg gcgttgattt gcagagcgtg gttcagtctg ttcgggataa    10440

gctctccgcc gatattatca tcaagcagac ggtgtcgctg tccccggaaa tagtcctgga    10500

ggaaaatacc gacatagaag catgggatgc ggtcatcgaa aataacgata aattattgga    10560

aaagtatatc gcaggagaac caatcagccg ggaaaaactt gtgcgggagg aacagcggcg    10620

ggttcaagac gcctccctgt tcccggtcta ttatggcagc gccaaaaagg gccttggcat    10680

tcaaccgttg atggatgcgg tgacagggct gttccaaccg attggggaac aggggagcgc    10740

cgccctatgc ggcagcgttt tcaaggtgga gtatacagat tgcggccagc ggcgtgtcta    10800

tctacggcta tacagcggaa cgctgcgcct gcgggatacg gtggccctgg ccgggagaga    10860

aaagctgaaa atcacagaga tgcgtattcc atccaaaggg gaaattgttc ggacagacac    10920

cgcttatccg ggtgaaattg ttatccttcc cagcgacagc gtgaggttaa acgatgtatt    10980

aggggaccca acccggctcc ctcgtaaaag gtggcgtgag gaccccctcc ccatgctgcg    11040

gacgtcgatt gcgccgaaaa cggcagcgca aagagaacgg ctgctggacg ctcttacgca    11100

acttgcggat actgacccgc ttttgcgctg cgaggtggat tccatcaccc atgagatcat    11160

tctttctttt ttgggccggg tgcagttgga ggttgtttcc gctttgctgt cggaaaaata    11220

caagcttgaa acagtggtaa aggaacccac cgtcatttat atggagcggc cgctcaaagc    11280

agccagccac accatccata tcgaggtgcc gcccaacccg ttttgggcat ccatcggact    11340

gtctgttaca ccactcccgc ttggctccgg tgtacaatac aagagccggg tttcgctggg    11400

atacttgaac cagagttttc aaaacgctgt cagggatggt atccgttacg ggctggagca    11460

gggcttgttc ggctggaacg taacggactg taagatttgc tttgaatacg ggctttatta    11520

cagtccggtc agcacgccgg cggacttccg ctcattggcc ccgattgtat tggaacaggc    11580

attgaaggaa tcagggacgc aactgctgga accttatctc tccttcaccc tctatgcgcc    11640

ccgggaatat ctttccaggg cttatcatga tgcaccgaaa tactgtgcca ccatcgaaac    11700

ggtccaggta aaaaaggatg aagttgtctt tactggcgag attcccgccc gctgtataca    11760

ggcataccgt actgatctgg ccttttacac caacgggcag agcgtatgcc ttacagaact    11820

gaaagggtat caggccgctg tcggcaagcc agtcatccag ccccgccgtc caaacagccg    11880

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tattgcattt ccctgtcttt cgtggtaaaa tgtagttgta aaccaccaga gaaaccaatc    12000

taattttacc gttgatagcc atttccttga tagccaaatg atagcaaaag ttcggcaagc    12060

ccataggata aggataatag gtatcaggaa aaatcaaatg atatcaaatc tcccaaacaa    12120

aagcgtttag aattaagttt cattttgcga atgggagtga ccccgccgat catgcgacca    12180

tcgctcccat agcgtctttc tttgcaggtg gcgcccgccg aagcctatct tcggcgggcg    12240

ccacctgtcg tcgttctgct atccagtatc cagtttcttc tcatggaagg tgccccggac    12300

gacgattacg acgtggacat cgatttggat gcgggcttca aggtgggacg ccatgacgtc    12360

gaatccatcc gaagacccga accgggacgc ctcccaaggg gaggggggaa tgcgatccgt    12420

atccgctaga agcgcgcccg cagtcgatag ggcaaatcat gaacatgtga ccggcaccgg    12480

aaagtgacat aatccgattg tcggcaatgg gctcgatatg gtatcagccg agcagccagt    12540

cgacgatatt gcgtatctca atgccgtcag aggtcgtgcc gagacggaat ctgtcgagtg    12600

tgagcacgat tttcgggaat gcatccgata acgattgcaa aggcgcgagt  tccctcgcgc   12660

gggtggattc ttcgagcatc gtcccggtga cctgaatgta gattctcctg tcgaatcgtt    12720

gagcgacgaa atcgatttca cctccacgca gactgccgac atgcacgttg tacccgcgtc    12780

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ctgacggatc tgtttgaggg tgcatcccgt aagaaagtgc agccggtaag tggatataga    13020

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gatgcggtta cgggatacag tggtatgcgc cgtgtgcttg tcatcggatg tccgggtgca    13140

ggcaaaagca cgttcgcgcg caggttgcgg gatgcggccg gactgccgct gcattatctg    13200

gacatgctgt ggcacaatcc ggaccggacg actgtcacac gggccgaatt cgatgagcgg    13260

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tctcatcgta tgcgagcgcg agggcaccat cgtctcctca tgtgtatgcg tcatcatccc    13800

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gggtgatata accgaatata aggtgatata tagtgatata tcgaaatgaa acgatataca   14820

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gttttgagtc catggatggt cgatgcgctc aagcgcatgt gctggtgcgc gtcgaacata   14940

tgaggccggt gaatgatatg ccgtatgccg cttcttacgc ctcagcgggt gtcggtgatg   15000

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tcttgaggct gccactgata tgcccacatg tggcagtcac ggggattatc tgcgcaaggg    15900

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catagtagag ctcgaggaac gactgcagat tctcgaattc atactgcgct cgcaggccgt    17160

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gtgacaatcg aggcgattgc gcagaggaaa ccgccgatca cccaggacat ccagaacatg    17460

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tatactgtta tatatcgagc ttggacacat tgtattctcg cgttcgaaag gaggggagat    18720

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ctcaccgacg atcagatgtc agctgcagac ccacggtaca tactcgtcaa acagcgcacg    19860

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<220>

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<211>32

<212>DNA

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<220>

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<21t>32

<212>DNA

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<220>

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attgcatttc cctgtctttc gtggtaaaat gtagttgtaa accaccagag aaaccaatct    3780

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cgctcccata gcgtctttct ttgcaggtgg cgcccgccga agcctatctt cggcgggcgc    4020

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taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc    8280

cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct    8340

tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca    8400

gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac    8460

atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt    8520

ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg    8580

cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc    8640

tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc    8700

gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc    8760

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tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt    8880

aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct    8940

aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc    9000

ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt    9060

ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg    9120

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tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga    9420

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atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca    9660

aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg    9720

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aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc    9840

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gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt    10020

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ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata    10140

ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac    10200

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gtgccac                                                              10267

<210>7

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物mdy94

<400>7

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<210>8

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物mdy95

<400>8

gatttgccct atcgactg                      18

<210>9

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物mdy82

<400>9

cgacccaagc ttggatcggc tcgtgcatca ttgc    34

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物mdy83

<400>10

gcaaaccgta cctcaatacc                  20

<210>11

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物mdy84

<400>11

cgacccaagc ttgcagtccg tcaattaggg tg    32

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物mdy85

<400>12

cgttgctgac gttgcggttc                   20

<210>13

<211>10504

<212>DNA

<213>质粒pMDY24

<400>13

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gatgtgcctg tacgtgctta tggcttccgt ggtggctgtg tacgctccgg aactgttcgc    1320

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tgttgctgct actgcagtgg agctcatcaa tgtatctcat gcccgacgag gttcttgaca    2340

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atggttacga tgaaggaaat cgcgaacaag gcgggggttt ccgtctctac ggtatcgctg    2700

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ttctgcttca acgatgcccg cgcctggtat gtgtacgaat gcgccgcacg ccgaggactc    3420

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aaatcgattg acgtcgcata ataattacta cataacaact tctacaaagg cacggccgcc    3840

cgagcagaag cgttacataa ccaataacca accaagtagt aatcaaagga tgattatggc    3900

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catgttcttc tgctcctggg gcatctggtg gtccttcttc cagcgctggc tcatctcagg    4020

cgttggattg accaatgctg aagtcggcac catctactcc atcaactcgc tggccaccct    4080

ggtcatcatg tttgtgtacg gcgtgattca ggatcagctc ggcatcaagc gcaagctcgt    4140

catcgtagtc tcggtaatcg ccgcctgcgt tggcccattc gtccaattcg tttacgcccc    4200

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cactgaagaa atcggcaacg ccacctacgg caccctgaac ggtttccagg tcttccttga    4740

gtccgcaatg atgggcgtgg tcccgatcat catgaagaag atcggcgtgc gcaacgctct    4800

gctgctcggc gctaccgtga tgttcctgcg catcggcttg tgcggcgtgt tccacgaccc    4860

ggtcaccatc tccatcgtca agctgttcca ctccatcgaa gtgccgctgt tctgcctgcc    4920

ggcattccgc tacttcactc tgcacttcga caccaagctc tctgccacgc tgtacatggt    4980

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ccacgacaag atggctcaga ttctgccgaa caacgacatg ggatcccgcg tgaccttctg    5100

ggtcatctct gccatcgtgc tgtgcgcact gatttacggc ttcttcgtca tcaagcatga    5160

tgatcaggaa gtcggcggcg acccgttcta caccgacaag cagcttcgcc agatggaagc    5220

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ccatccacga ccacgctgct gaactggcaa aagccgaagc cggcgtggct gagatggccg    5340

ccaatcgcaa caaccgctgg tacccgaagt atcacatcgc ctccaacggt ggctggatca    5400

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acaaggtcga ccgatgccct tgagagcctt caacccagtc agctccttcc ggtgggcgcg    5820

gggcatgact atcgtcgccg cacttatgac tgtcttcttt atcatgcaac tcgtaggaca    5880

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cgggttggca tggattgtag gcgccgccct ataccttgtc tgcctccccg cgttgcgtcg    6360

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gaaattgata ttagtgtttt ataccgaaac ataaaacaag aaggatataa attttaccct    7620

gcatttattt tcttagtgac aagggtgata aactcaaata cagcttttag aactggttac    7680

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tatgatttat acctttctga tgtagagaaa tataatggtt cggggaaatt gtttcccaaa    7860

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ttcattaata aaggtaattc aatatattta ccgctatctt tacaggtaca tcattctgtt    8040

tgtgatggtt atcatgcagg attgtttatg aactctattc aggaattgtc agataggcct    8100

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cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag acggtcacag    8280

cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg    8340

gcgggtgtcg gggcgcagcc atgacccagt cacgtagcga tagcggagtg tatactggct    8400

taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac catatgcggt gtgaaatacc    8460

gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgctct tccgcttcct cgctcactga    8520

ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat    8580

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tcaa                                                               10504

<210>14

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物mdy27

<400>14

tcggaagatc tcatggtcaa cgagttcgc    29

<210>15

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物mdy39

<400>15

tagtactaag cttcttgagc tcttccttct gc