海洋碱性蛋白酶894水解水产品加工下脚料制备抗氧化胶原肽的方法

摘要

本发明涉及海洋碱性蛋白酶894水解水产品加工下脚料制备抗氧化胶原肽的方法，包括水产品加工下脚料经脱杂白蛋脱脂等预处理后，再在碱性蛋白酶894存在下进行酶水解，得到高活性高产率的抗氧化胶原肽，该方法原料来源丰富，变废为宝，工艺简单，产率高、抗氧化胶原肽活性高，可作为天然抗氧化胶原肽应用于食品工业、化妆品及医学等领域中。

说明书

技术领域

本发明涉及提取蛋白质领域，特别是涉及一种海洋碱性蛋白酶894水解水产品加工下脚料制备抗氧化胶原肽(简称胶原肽)的方法。

背景技术

胶原肽(为胶原多肽的简称)是细胞外基质的一种结构蛋白质-胶原蛋白的水解产物。胶原蛋白及其水解产物胶原肽，在生物、医学、食品、化妆品、饲料等领域有着广泛的应用。长期以来，畜禽源动物组织是人们获取天然胶原蛋白及其胶原肽的一条重要途径，然而，由于近年来疯牛病、禽流感等畜禽病的流行，使得此类产品的来源受阻，需求缺口大增。人们渴望找到一种更安全，来源更广泛的胶原肽产品。

“水产科学”，2006，25(2)，101-104报道，以海洋鱼类为原料利用海产鱼类的骨、皮等下脚料提取胶原蛋白和活性胶原肽，即能提升水产品的附加值，使废物变宝再利用，又能很好的满足人们在各个行业对胶原蛋白的需求，成为近年来人们开发研究的热点之一。美国CTFA化妆品原料手册录用的天然物质和日本《功能性化妆原料》中选用的天然物质都有胶原蛋白及其水解产物胶原肽，除化妆品领域，胶原肽在降压，抗风湿、健骨等方面的活性也逐渐成为人们研发的热点。

由于胶原蛋白及其多肽与皮肤所特有的高亲和性、免疫性等功能，在化妆品应用上寻找能直接被皮肤吸收的具有美白、除皱的胶原活性多肽已成为众多研究人员关注的热点，随着研究的深入，以动物骨皮为原料提取具有降血压、治疗风湿等医用活性成分胶原肽的研究不断报道。

发明内容

本发明的目的在于以为海洋药物为开发契机，水产品特别是海洋鱼类加工下脚料为原料开发提供一种具有更高活性的化妆品原料-海洋碱性蛋白酶894水解水产品加工下脚料制备抗氧化胶原肽的方法。

本发明提供的海洋碱性蛋白酶894水解水产品加工下脚料制备抗氧化胶原肽的方法，包括下列步骤：

①水产品加工下脚料预处理

将水产品加工下脚料用水洗净、搅碎后，经碱浸泡脱杂蛋白、脱色、异丙醇脱脂，然后沉淀经反复冲洗至无异味，再脱水。

②酶水解

将步骤①经预处理的水产品加工下脚料，在海洋碱性蛋白酶894存在下于水中进行水解，水解温度30-60℃，优选37-45℃；更优选为40℃；pH值为7.5-12.5，优选为8.0-9.0，更优选为8.0；海洋碱性蛋白酶894与预处理的水产品加工下脚料重量(质量)比(简称酶料比)为1∶1000至1∶25，优选为1∶150至1∶50，更优选为1∶150，预处理的水产品加工下脚料与水质量比(简称料水比)为1∶150至1∶1，优选为1∶10至1∶4，更优选为1∶10；时间为10-60分钟，优选为10-30分钟更优选为30分钟；水解后产物迅速于沸水中灭酶冷却后于0-10℃，优选4℃离心得上清液抗氧化胶原肽，亦可进一步处理得冻干抗氧化胶原肽。

按照本发明提供的海洋碱性蛋白酶水解894水产品加工下脚料制备抗氧化胶原肽的方法中，所述水产品加工下脚料包括淡水产品加工下脚料及海洋水产品加工下脚料，例如海洋鱼类水产品加工下脚料，或其混合水产品加工下脚料。所述海洋碱性蛋白酶894为黄海水产研究所发明专利产品，专利号为：ZL00123404.8，由黄海水产研究所提供。

在步骤①中搅碎通常采用高速组织搅碎机例如DS-1高速组织搅碎机15000转/分剪切搅碎5-10分钟，搅碎时间随着高速组织搅碎机的转速而变。所述碱浸泡脱杂蛋白采用碱例如KOH或NaoH等浸泡水产品加工下脚料，碱的浓度一般0.1mol/L-.0.5mol/L，碱的用量为水产品加工下脚料质量10-50倍，优选20-30倍。脱色通常采用例如活性炭于0-10℃，优选4-5℃脱色4-8h。脱脂采用5-20重量％，优选10重量％的异丙醇于0-10℃，优选4-5℃脱脂20-48h。

在酶水解中，酶水解的工艺条件：温度、pH值、酶料比、料水比及时间直接影响到抗氧化胶原肽的产率，反应温度对胶原肽产率影响如图1所示，即用羟自由基的清除率η来表征。由图1可知，在温度40℃、45℃时羟自由基清除率的η值分别是达到峰值55.35％、56.83％，两者数值接近，而温度在45℃以下时随温度增加η值增大，这是因为随温度上升酶活接近最佳活性温度而不断增强，提高了作用速率，从而加速了目的胶原肽的得率；当温度在45℃以上时，温度开始对酶活起抑制作用，使底物降解为目的产物的速率下降，从而又引起η值的回落。

pH值对酶水解的影响如图2所示，由图2可知，在碱性pH范围7.5～12.5间，当pH值为8.5时，其羟自由基清除率最大为59.27％，之后随pH减小或增大羟自由基率均下降。说明在pH8.5左右时，是酶作用底物产生目的胶原肽的最佳pH范围。

酶料比对酶水解的影响如图3所示，由图3可知，不加酶时其羟自由基清除率的η值仅为11.72％，而酶料比为1∶1000时η值就达到47.24％，而此后，随着酶料比的增大其η值的增幅明显减缓，在酶料比增大到1∶25时，η值反而越过酶料比为1∶50时的最大抗氧化值57.74％下降为54.23％。其原因为随着酶浓度的增加其底物逐渐达到饱和，当出现酶浓度过饱和时，过饱和的酶就会作用于目的胶原肽，使其降解而降低目的胶原肽的含量。

料水比对酶水解的影响如图4所示，由图4可知，料水比在1∶10时所得产物的羟自由基清除能力最大，而料水比增大和减少时其羟自由基清除能力均有所下降，但总体上料水比对η值无明显影响。

水解时间对酶水解的影响如图5所示，由图5可知，反映时间在30、50min时羟自由基清除率的η值分别达到56.76％、57.48％处于峰值，两水平再反应时间相差20min时，η值却相差不到一个百分点。反应时间在50min以后随时间的延长η值逐渐下降。根据酶动力学反应原理，随时间的增加水解程度不断增大，目的胶原肽逐渐被进一步降解，从而使η值回落。

由上述综合可见酶水解温度45℃、酶料比1∶50、pH8.0、料水1∶4、反应时间30分所得抗氧化胶原肽的羟自由基清除率为60.42％。与同浓度VC相比，为其抗氧化活性的2倍多。

本发明制备的抗氧化胶原肽抗氧化活性与同浓度的VC(东北制药总厂供)做羟自由基清除率对比，结果如表1。

表1抗氧化胶原肽与VC的羟自由基清除率(η)的对比

浓度(mg/ml)  胶原肽(η₁)  VC(η₂)活性比(η₁/η₂)1051  92.54  72.08  24.67  38.81  28.11  0 2.38 2.56 +∝

由此可见冻干抗氧化胶原肽和VC浓度均为10mg/ml和5mglml时，所提取得未经纯化的抗氧化胶原肽的抗氧化活性都在VC的2倍以上，当浓度降至1mg/ml时VC的抗氧化值消失，而本发明制备的抗氧化胶原肽的抗氧化活性仍在24.67％。可见所提取的抗氧化胶原肽有着较高的抗氧化活性。

本发明提供的由海洋碱性蛋白酶894水解水产品加工下脚料制备抗氧化胶原肽的方法特点为原料来源丰富，变废为宝、工艺简单可靠，产物抗氧化胶原肽活性、产率高，与目前市场上VC抗氧化活性相比在2倍以上，是一种天然的抗氧化剂，用于食品，这也为开发其天然生理活性，应用于化妆品、医学等方面。

海洋碱性蛋白酶894水解水产品加工下脚料的产物抗氧化胶原肽可清除羟自由基，仰制番红花红0褪色。亚铁离子催化过氧化氢产生羟自由基(Fenton反应)，该反应产生的羟自由基可使番红花红0褪色，利用两者线型关系进行对照空白试验，通过测定羟自由基清除率η未表征水解产物抗氧化胶原肽的得率。抗氧化活性测定为取0.25mol/L，pH7.4的磷酸缓冲液1ml，40μg/ml的番红花红1ml，供试样品0.5ml，1％过氧化氢1ml(新鲜配制)，0.945mmol/L EDTA-Fe(II)1ml(新鲜配制)，混合后在37℃水浴中反应30min后在520nm处测定吸收度。空白组以0.5ml蒸馏水代替供试样品抗氧化胶原肽上清液样品。对照组以1.5ml蒸馏水代替EDTA-Fe(II)和供样品抗氧化试胶原肽上清液样品。并按下式计算清除率：

式中A_样品、A_空白、A_对照分别为样品、空白和对照的吸光值。

附图说明

图1为温度对羟自由基清除率η关系图

图2为pH对羟自由基清除率η关系图

图3为酶料比对羟自由基清除率η关系图

图4为料水比对羟自由基清除率η关系图

图5为时间对羟自由基清除率η关系图

具体实施方式

本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例：

将1000克水产品加工下脚料用水洗净剪碎后，在DS-1高速组织搅碎机15000转/分钟，剪切搅碎5分钟，然后用0.1mol/L的NaOH20公斤浸泡脱杂蛋白，并于4℃进行活性炭脱色24小时，取沉淀反复冲洗中性，再用20公斤10％的异丙醇4℃脱脂24小时，将沉淀反复冲洗脱净异丙醇至无异味，最后脱水。

取上述预处理后的水产品加工下脚料100克在海洋碱性蛋白酶894(黄海水产研究所)中进行水解，水解温度40℃，pH值8.0，海洋碱性蛋白酶894与预处理的水产品加工下脚料重量比1∶150，欲处理的水产品加工下脚料与水重量比为1∶10，水解时间30分钟，水解产物迅速于沸水中灭酶，冷却后于4℃离心得胶原肽上清夜，测得其羟自由基清除率η为60.42％

实施例2-4

实施例2-4的制备步骤与实施例1相同，不同是水解条件由表2所示。

  实施例  温度  (℃)  pH  酶料比  料水比  时间(分)  2  3  4  37  41  45  8.0  8.5  9.0  1∶150  1∶300  1∶600  1/4  1/7  1/10  30  40  50