通过酶催化的酯交换反应制备霉酚酸吗啉乙酯的方法

摘要

本发明涉及制备霉酚酸吗啉乙酯(MMF)的方法，其中，将霉酚酸(MPA)的低分子量脂肪醇酯与N－(2－羟基乙基)吗啉在Candida antarctica脂肪酶的存在下进行酯交换反应，并且其中的MPA酯化反应在Candida antarctica脂肪酶的存在下用相应的醇作为溶剂来进行。

说明书

霉酚酸吗啉乙酯(MMF；注册号128794-94-5)是霉酚酸(MPA；注册号24280-93-1)与N-(2-羟基乙基)吗啉(注册号622-40-2)形成的酯，它是一种免疫抑制剂，目前用于对肾移植的患者进行治疗。

                         霉酚酸吗啉乙酯(MMF)

在口服给药后，MMF被水解为MPA，后者是真正的免疫抑制剂，因为它是肌苷一磷酸脱氢酶的强效抑制剂(B.J.Bornes，A.E.Eakin，R.A.Izydore和I.H.Hall，Biochemical Pharmacology，62，(2001)，p.91-100)。

MMF最初记载于US专利4,753,935中(1987，对应于专利EP028713B1)：在该专利中，描述了通过用N-(2-羟基乙基)吗啉酯化MPA的常规方法来制备MMF的方法。这些方法是通过使用MPA的酰氯或利用缩合剂如二环己基碳二亚胺来使MPA与N-(2-羟基乙基)吗啉缩合。但是这些合成方法都有一定的缺点，即，由于除了羧基外分子上还同时存在酚羟基和内酯官能团，因此，除了所需的产物外，还会生成一系列MPA的多缩合副产物。

为了解决上述问题，进来开发了一些制备MMF的替代方法。在专利申请WO 00-34503(2000)和WO 03-042393(2003)描述的一些方法中，报道了用生物催化法来制备MMF，即通过酶催化来使MPA和N-(2-羟基乙基)吗啉发生反应。我们知道许多水解酶，如在市面上容易得到的脂肪酶、酯酶或蛋白酶，它们可用于有机溶剂并且在严格控制的实验条件下(水含量、pH、温度、表面活性剂和水清除剂的存在与否)，这些水解酶不但对非天然底物有水解作用，还可以对酯类的合成产生催化作用(Klibanov A.M.CHEMTECH，1986，16，354；Schopineau J.，McCafferty F.D.，Therisod M.，Klibanov A.M.Biotechnol.和Bioeng.1988，31，208；Therisod M.，KlibanovA.M.Journal of Chemical American Society，1987，109，3977)。

而这些酶催化的方法也并不能完全令人满意，因为在酯化反应中产生的或存在于反应介质中的水会对反应的进程产生重要的影响，而在反应介质中使用表面活性剂则会使后期对粗产物中MMF的纯化变得复杂。另外，所用有机溶剂的种类也会对反应动力学及酶的催化效能产生强烈的影响，有时会导致反应时间的延长，以便在应用于关键的工业制备中时，使反应的进程能够达到可接受的水平。

因此我们决定证实能否找到一种适宜的实验条件，从而通过使用酶，在不使用表面活性剂、不严格地控制pH值以及在反应介质中存在水的条件下，完成MMF的制备。由于在文献中描述了大量在有机化学的应用中使用脂肪酶进行的酶催化酯交换反应的例子，我们决定确定这个途径是否可以成功的运用于MMF的制备(E.Santaniello，P.Ferraboschi和P.Grisenti.Enzyme Microb.Technol.1993，vol 15，p.367-382)。为此，我们首先需要找到最合适的水解酶，它不但能使MPA与简单的醇发生酯化反应，而且能完成随后的与N-(2-羟基乙基)吗啉的酯交换反应。

通过对不同脂肪醇和MPA的酶催化酯化反应的各种反应条件进行研究，以及使用不同的脂肪酶(三酰甘油脂肪酶，EC 3.1.1.3)作为酶催化剂，我们惊奇的发现由Candida antarctica脂肪酶(CAL B，Novozym 435)催化的MPA与低分子量脂肪醇如乙醇或甲醇的酯化反应可以在30至40小时内以定量收率生成相应的乙酯或甲酯。

该方法使用同样的脂肪醇(即甲醇或乙醇)作为唯一的反应溶剂，不会受到反应环境中产生的水的明显影响，也不需要使用表面活性剂。

另外，在我们所用的实验条件下，当用异丙醇、2，2，2-三氟乙醇、2，2，2-三氯乙醇、正丙醇和正丁醇作为反应溶剂时，我们还可以利用CAL B按照与使用甲醇和乙醇类似的方式获得相应的MPA酯。

然后，这些MPA酯与N-(2-羟基乙基)吗啉在四氢呋喃(THF)中进行酯交换反应，仍然由CAL B催化，可以定量收率生成MMF，而不需要使用表面活性剂和无水环境(图1)。

而MPA与CAL B之间的特异性让我们更加吃惊，因为在相同的实验条件下，其他的脂肪酶如洋葱假单胞菌脂肪酶(PCL)或皱褶假丝酵母脂肪酶(CRL)，不能生成相应的甲酯或乙酯，也不能催化与N-(2-羟基乙基)吗啉的酯交换反应。

那些文献中已知的能够在各种非天然底物上催化酯化反应和酯交换反应的脂肪酶，在我们所用的实验条件下显然无法在它们的活性部位接受MPA。

在一个典型的方式中，MPA酯化反应用CAL B作为酶并用适当的醇作为溶剂，优选C₁-C₄烷基醇或其卤代衍生物。酶的用量优选为20-60mg每mmol MPA，首选53mg。MPA的浓度优选为0.05-0.2M，首选0.1M。反应在搅拌的条件下，在15至45℃下、优选30℃下进行30-40小时。过滤除去酶以结束反应，将滤液在真空下浓缩。

在一个典型的方式中，MPA酯与N-(2-羟基乙基)吗啉的酯交换反应用CAL B作为酶并使用非质子极性有机溶剂，优选log P小于0.5的溶剂，更优选THF或1，4-二烷。

酶的用量在50到150mg每mmol底物的范围内，优选107mg。底物的浓度为0.1到0.3M，优选0.25M。MPA酯与N-(2-羟基乙基)吗啉的摩尔比为0.2到0.4，优选0.3。反应在搅拌的条件下，在15到45℃、优选25到30℃的温度下进行24到36小时。然后通过过滤除去酶以结束反应并将滤液真空浓缩。或者，MPA酯化反应以及随后的与N-(2-羟基乙基)吗啉的酯交换反应可以重复利用相同的酶来进行，与“新鲜”的酶相比，酶的活性没有任何明显的丧失。

另外，前面所述实验条件下的CAL B还可以更多次的循环使用，包括用于酯化反应和酯交换反应，而没有任何可感觉到的催化活性的丧失。

实验部分

实施例1

霉酚酸乙酯(2)的制备

将1.01g(3.15mmol)MPA在搅拌下、在30℃下溶于37.5ml无水乙醇，然后加入170mg CAL B。将反应混合物在30℃下剧烈搅拌40小时然后结束反应：通过过滤除去酶并将滤液真空浓缩得到油状残余物。向油状残余物中加入二氯甲烷(20ml)并将得到的有机溶液依次用饱和碳酸氢钠溶液(15ml)和水洗涤。将有机相用硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩得到1.042g(2.99mmol；95％收率)霉酚酸乙酯(2)，其不经任何进一步的纯化直接用于下一合成步骤。

元素分析：计算值C₁₉H₂₄O₆：C＝65.50；H＝6.94；O＝27.55。实测值：C＝65.42；H＝6.90；O＝27.44。

质谱(分析碎片)：349(m+1)，348(分子离子)，303(m-45)

¹H-NMR(500MHz)CDCl₃：1.16(t，3H，CH₃-CH₂-)，1.76(s，3H，CH₃-C＝)，2.15(s，3H，CH₃-Ar)，2.26(m，2H，CH₂-C＝)，2.35(m，2H，CH₂CO)，3.35(d，2H，CH₂Ar)，3.75(s，3H，OCH₃)，4.04(q，2H，CH₃-CH₂O)，5.16(s，2H，ArCH₂O)，5.20(t，1H，CH＝)。

以下MPA酯按照类似的方式制得：甲酯、2，2，2-三氟乙酯、2，2，2-三氯乙酯、丙酯、异丙酯、正丁酯。

甲酯(1)

元素分析：计算值C₁₈H₂₂O₆：C＝64.66；H＝6.63；O＝28.71。实测值：C＝64.59；H＝6.54；O＝28.65

质谱(分析碎片)：335(m+1)，334(分子离子)，303(m-31)

正丙酯(3)

元素分析：计算值C₂₀H₂₆O₆：C＝66.28；H＝7.23；O＝26.49。实测值：C＝66.18；H＝7.15；O＝26.37

质谱(分析碎片)：363(m+1)，362(分子离子)，319(m-43)

异丙酯(4)

元素分析：计算值C₂₀H₂₆O₆：C＝66.28；H＝7.23；O＝26.49。实测值：C＝66.20；H＝7.17；O＝26.40。

质谱(分析碎片)：363(m+1)，362(分子离子)，319(m-43)

2，2，2-三氟乙酯(5)

元素分析：计算值C₁₉H₂₁F₃O₆：C＝56.72；H＝5.26；F＝14.17；O＝23.86。实测值：C＝56.63；H＝5.18；F＝14.11；O＝23.80。

质谱(分析碎片)：403(m+1)，402(分子离子)，303(m-99)

2，2，2-三氯乙酯(6)

元素分析：计算值C₁₉H₂₁Cl₃O₆：C＝50.52；H＝4.69；Cl＝23.54；O＝21.25。实测值：C＝50.43；H＝4.65；Cl＝23.45；O＝21.14。

质谱(分析碎片)：458(m+6)，456(m+4)，454(m+2)，452(分子离子)，303(m-149)

正丁酯(7)

元素分析：计算值C₂₁H₂₈O₆：C＝67.00；H＝7.50；O＝25.50。实测值：C＝66.92；H＝7.42；O＝25.40。

质谱(分析碎片)：377(m+1)，376(分子离子)，303(m-73)

实施例2

通过霉酚酸乙酯的酯交换反应制备MMF

将195mg(0.56mmol)霉酚酸乙酯在搅拌下、在25至30℃的温度下溶解于无水THF(2ml)中。然后加入60mg CAL B和0.23ml(249mg，1.9mmol)N-(2-羟基乙基)吗啉。将反应混合物在25至30℃下搅拌35小时。然后，结束反应：通过过滤除去酶并将滤液真空浓缩得到油状残余物。向该油状残余物中加入二氯甲烷(20ml)并将得到的有机溶液依次用饱和碳酸氢钠溶液(15ml)和水洗涤。然后将有机相用硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩得到206mg(0.45mmol；82％收率)MMF。为了进行分析，将该产物通过硅胶色谱纯化(1/100＝p/p)：用二氯甲烷/甲醇＝96/4v/v洗脱，回收得到143mg纯的MMF。

¹H-NMR(500MHz)CDCl₃：1.80(s，3H，CH₃-C＝)，2.18(s，3H，CH₃-Ar)，2.20-2.45(m，4H，CH₂-N和CH₂-C＝)，2.48(m，4H，2CH₂-N)，2.60(m，2H，CH₂CO)，3.40(d，2H，CH₂Ar)，3.78(m，4H，CH₂O)，3.80(s，3H，OCH₃)，4.20(t，2H，CH₂O)，5.15-5.30(m，3H，CH₂O和CH＝)。

以类似的方式，还从如下MPA酯开始通过酯交换反应制得了MMF：甲酯、2，2，2-三氟乙酯、2，2，2-三氯乙酯、正丙酯、异丙酯、正丁酯。