红茶菌中木醋酸菌的分离纯化方法

摘要

本发明涉及从普通混杂的红茶菌液中纯化获得木醋酸菌菌株的方法。所要解决的问题是：提供一种分离纯化红茶菌中重要菌种—木醋酸菌的工艺方法。特点是：包括下述步骤，取家庭或市售的红茶菌菌液进行纯化分离；按照《伯杰氏细菌鉴定手册》对分离获得的多个纯的醋酸菌菌株进行菌种鉴定；用斜面菌种接种静止培养红茶菌的方法以筛选木醋酸菌菌株；本发明采用微生物学技术从传统的红茶菌饮料中分离纯化出红茶菌的主要木醋酸菌菌株，以利于用纯菌株培养出具有醇、酸、甜、香独特风格的红茶菌。这种工艺具有无杂菌污染、菌种易保藏、产品质量稳定、易于工业化生产和产品商业化的特点。

说明书

技术领域

本发明涉及从普通混杂的红茶菌液中纯化获得木醋酸菌菌株的方法。

背景技术

红茶菌又名“海宝”、“红茶菇”，是一种传统保健饮料，广泛流传于我国、日本、东南亚和南欧诸国。一般家庭中用经验方式培养红茶菌，从他人处获得红茶菌液，将此菌液接进配好的糖茶水中，根据温度的区别培养约7～15天，得到新的红茶菌。这种传统的培养方式存在以下缺点：①容易污染杂菌，②菌种不易保藏，③产品品质不稳定，④不易大规模培养，⑤不易商业化开发。

现在已经知道红茶菌最主要的菌群是由醋酸菌、酵母菌和乳酸菌三类微生物构成，各地的红茶菌产品中这些菌群的菌种多少存在区别，例如醋酸菌中有巴氏醋酸菌、木醋酸菌、液化醋酸菌、弱氧化醋酸菌等，酵母菌中有接合酵母、球拟酵母、不显酵母、汉逊德氏酵母、热带假丝酵母、路德类酵母和酿酒酵母之分。这些酵母菌和醋酸菌菌种并不都对红茶菌的风味作出贡献，有些还会产生异味，影响红茶菌的质量。由于地域性的差异导致红茶菌中菌群组成的差异，最终导致产品风味的差异，因此存在从不同地区引种的培养物风味出现较大差异的现象。

在红茶菌中酵母菌的作用是将蔗糖、葡萄糖降解产生乙醇，醋酸菌氧化乙醇产生乙酸。酵母菌和醋酸菌还可以合成酯类、内酯等产物，赋予红茶菌特征性风味。根据研究，对红茶菌产品的胶状外形和风味具有最主要贡献的微生物是醋酸菌和酵母菌。乳酸菌只是由于也耐一定的酸度，才能在糖茶液中生存，产生对人体有益的微量的乳酸和其他化合物。实际上可以认为红茶菌是醋酸菌和酵母菌的松散的共生体。在家庭培养的红茶菌的表面通常形成很厚的胶状的灰白色膜状物，红茶菌菌膜是由醋酸菌将葡萄糖聚合成纤维素而成，在膜中存在醋酸菌和少量的酵母菌，在膜的下方存在较多的酵母菌、乳酸菌和其他微生物，酸性膜的存在阻止了其他微生物的污染。在静止培养条件下醋酸菌合成大量的胶膜导致糖类的不必要的浪费。茶叶中的儿茶素和单宁对很多微生物具有抑制作用，而红茶菌中的醋酸菌和酵母菌可以忍耐较高浓度的儿茶素和单宁，并且可以降解部分儿茶素和单宁，将其作为营养利用，降低了红茶菌液的苦涩味，残存的儿茶素也可作为营养保健成份。正是由于上述的各种原因导致形成红茶菌的特征性的风味。

一般家庭培养的红茶菌中还存在耐酸的霉菌和其他细菌，这些微生物对红茶菌产品没有什么贡献，但却是产品质量不稳定、导致污染的根本原因。

发明内容

本发明旨在提供：一种分离纯化红茶菌中重要菌种—木醋酸菌的工艺方法。

具体的操作方法如下：

红茶菌中木醋酸菌的分离纯化方法，其特征在于：包括下述工艺步骤

(1)、从红茶菌菌液中分离纯化木醋酸菌

A、取家庭或市售的红茶菌菌液，在无菌条件下，用取样器从菌膜下吸取0.1mL的菌液，采用0.85％生理盐水进行10倍、100倍、1000倍的梯度稀释，得三份稀释菌液；

B、在超净工作台上，取融化后降温至约50℃的葡萄糖酵母膏GYC固体培养基倒平板，在平板中注入约20mL的培养基，在培养基中加入抑制真菌的1～100 mg/L浓度的抗生素，待培养基凝固后，取上述三份稀释菌液0.05mL～0.2mL分别加入三个平板上，用无菌的三角刮铲将菌液均匀涂布于平板表面；

C、将上述制备好的三个平板置于25℃～35℃的培养箱中培养3～10天；

D、用接种环分别挑取三个平板上出现的10-30个形态稍有区别的典型醋酸菌菌落至另一新配置的葡萄糖酵母膏GYC固体培养基平板划线，将平板置于25℃～35℃的培养箱中培养3～10天；

E、重复上述D步骤至少2次，直至菌落完全纯化；得到10个以上纯的醋酸菌菌株；

(2)、按照《伯杰氏细菌鉴定手册》对分离获得的多个纯的醋酸菌菌株进行菌种鉴定，经鉴定获得木醋酸菌、巴氏醋酸菌、液化醋酸菌、弱氧化醋酸菌共4株醋酸菌菌株；

(3)、用斜面菌种接种静止培养红茶菌的方法以筛选木醋酸菌菌株

将鉴定为木醋酸菌、巴氏醋酸菌、液化醋酸菌、弱氧化醋酸菌的4株醋酸菌菌株与接合酵母菌、汉逊德氏酵母菌、路德酵母菌和酿酒酵母菌菌株分别进行两两组合接种试验，即一种醋酸菌加一种酵母菌的组合接种试验，具体操作步骤如下：

A、红茶菌糖茶液的配制，取原料茶叶3～10g，糖30～100g，水1000mL，用沸水冲泡茶叶和糖，保持微沸1～10min，静置使茶叶沉淀，取上清液，分装150mL/250mL三角瓶，108℃～121℃灭菌处理10～25min；

B、按两两组合用接种环从上述纯化的4株醋酸菌菌株和4株酵母菌菌株的纯培养中挑取一环混合分别接进红茶菌糖茶液中，20℃～35℃静止培养6～15天；

即巴氏醋酸菌分别与接合酵母菌、汉逊德氏酵母菌、路德酵母菌和酿酒酵母菌混合接种；

即液化醋酸菌分别与接合酵母菌、汉逊德氏酵母菌、路德酵母菌和酿酒酵母菌混合接种；

即弱氧化醋酸菌分别与接合酵母菌、汉逊德氏酵母菌、路德酵母菌和酿酒酵母菌混合接种；

即木醋酸菌分别与接合酵母菌、汉逊德氏酵母菌、路德酵母菌和酿酒酵母菌混合接种；

结果是，木醋酸菌分别与接合酵母菌、汉逊德氏酵母菌、路德酵母菌和酿酒酵母菌混合接种后均可以形成典型的带有胶膜的红茶菌液。

上述的红茶菌中木醋酸菌的分离纯化方法，从红茶菌菌液中分离纯化木醋酸菌的B步骤、D步骤中的葡萄糖酵母膏GYC固体培养基配方：糖50～100g，酵母膏5～10g，CaCO₃ 15～30g，琼脂12～20g，水1000mL。

上述的红茶菌中木醋酸菌的分离纯化方法，所述葡萄糖酵母膏GYC固体培养基和红茶菌糖茶液配方中的糖为红糖或白糖或冰糖或蔗糖或葡萄糖或饴糖或蜂蜜，或者任意几种糖类的混合物。

上述的红茶菌中木醋酸菌的分离纯化方法，从红茶菌菌液中分离纯化木醋酸菌的B步骤中的抗生素为放线菌酮D或灰黄霉素或多氧霉素或制霉菌素，其浓度在1～100mg/L。

上述的红茶菌中木醋酸菌的分离纯化方法，所述的茶叶为绿茶、红茶、乌龙茶、茶末、各类茶叶提取物、几种茶叶的混合物。

木醋酸菌(Acetobacter xylinum)，又称为胶醋酸菌，其生长特征在于：

在葡萄糖酵母膏(GYC)培养基上3-5天菌落大小1～3mm，圆形，边缘整齐，微突起，表面略潮湿，灰黄色、淡皮纸色；4-5天后菌落中央出现暗红色，菌落呈粘状、皮革状，接种环难挑起。

细胞革兰氏阴性，杆状，略弯曲，两端稍圆，大小0.8～1.0×1～3μm，不形成芽胞，周生鞭毛，运动。

细胞接触酶阳性，氧化酶阴性，不形成褐色素，氧化乙醇、乙酸盐、乳酸盐，从甘油形成酮类，从葡萄糖产酸；吲哚反应、硝酸盐还原阴性，不水解淀粉，可以2％～5％乙醇生长，O/F试验：氧化，pH3～5生长，可利用乙醇、乙酸盐、卫茅醇作为碳源生长。

本发明的菌种已按专利法实施细则第二十五条第三款的规定在国家知识产权局专利局指定的保藏单位——中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期：2006年4月6日，保藏号：CGMCC1671，并附具存活性报告书。

采用现代生物工程技术发掘改进传统产品和工艺，是我国食品工业发展的重要方向。本发明采用微生物学技术从传统的红茶菌饮料中分离纯化出红茶菌的主要木醋酸菌菌株，以利于用纯菌株培养出具有醇、酸、甜、香独特风格的红茶菌。这种工艺具有无杂菌污染、菌种易保藏、产品质量稳定、降低消耗、易于工业化生产和产品商业化的特点。

具体实施方式

下面对本发明作进一步地说明。

实施例1：

木醋酸菌(Acetobacter xylinum)，又称为胶醋酸菌，其生长特征在于：

在葡萄糖酵母膏(GYC)培养基上3-5天菌落大小1～3mm，圆形，边缘整齐，微突起，表面略潮湿，灰黄色、淡皮纸色；4-5天后菌落中央出现暗红色，菌落呈粘状、皮革状，接种环难挑起。

细胞革兰氏阴性，杆状，略弯曲，两端稍圆，大小0.8～1.0×1～3μm，不形成芽胞，周生鞭毛，运动。

细胞接触酶阳性，氧化酶阴性，不形成褐色素，氧化乙醇、乙酸盐、乳酸盐，从甘油形成酮类，从葡萄糖产酸；吲哚反应、硝酸盐还原阴性，不水解淀粉，可以2％～5％乙醇生长，O/F试验：氧化，pH3～5生长，可利用乙醇、乙酸盐、卫茅醇作为碳源生长。

分离纯化木醋酸菌的方法如下：

(1)A、取家庭或市售的红茶菌菌液，在超净工作台上，在无菌条件下，用无菌的取样器从菌膜下吸取0.1mL的菌液，采用生理盐水(0.85％NaCl)进行10倍、100倍、1000倍的梯度稀释，得三份稀释菌液；

B、在超净工作台上，取融化后冷却至约50℃的葡萄糖酵母膏(GYC)固体培养基倒平板，在培养基中加入抑制真菌的1～100mg/L浓度的抗生素，待培养基凝固后，取上述三份稀释菌液0.05mL～0.2mL分别加入三个平板上，用无菌的三角刮铲将菌液均匀涂布于平板表面；

C、将上述制备好的三个平板置于25℃～35℃的培养箱中培养3～10天；

D、用接种环挑取三个平板上长出的10-30个形态稍有区别的典型醋酸菌菌落至另一新配置的葡萄糖酵母膏GYC固体培养基平板划线，将平板置于25℃～35℃的培养箱中培养3～10天；

重复上述D步骤至少2次，直至菌落完全纯化；得10株以上纯的醋酸菌菌株；

E、所述的典型的醋酸菌菌落的特征在于：在葡萄糖酵母膏GYC固体培养基上3-5天菌落大小1～3mm，圆形，边缘整齐，微突起，表面略潮湿，灰黄色、淡皮纸色；4-5天后菌落中央出现暗红色，菌落呈粘状、皮革状，接种环难挑起。

上述B步骤、D步骤中的葡萄糖酵母膏GYC固体培养基配方：白糖75g，酵母膏7g，CaCO₃23g，琼脂16g，水1000mL。

葡萄糖酵母膏GYC固体培养基和红茶菌糖茶液配方中的糖，可为红糖或白糖或冰糖或蔗糖或葡萄糖或饴糖或蜂蜜，或者任意几种糖类的混合物。

上述B步骤中的抗生素可以是放线菌酮D、也可以是灰黄霉素、或多氧霉素、或制霉菌素，其浓度在1～100mg/L。

(2)、按照《伯杰氏细菌鉴定手册》对分离获得的多个纯的醋酸菌菌株进行菌种鉴定，经鉴定获得木醋酸菌、巴氏醋酸菌、液化醋酸菌、弱氧化醋酸菌共4株醋酸菌菌株；

按照微生物学研究的原则，在分离到某一纯菌株后，要根据微生物分类和鉴定的通用方法，对种名未知的菌株进行鉴定，获取有关其分类的信息，为进一步的研究和应用提供分类学的依据。在细菌分类研究中《伯杰氏系统细菌学手册》(英文)(Bergey’sMannual of Systematic Bacteriology，Williams and Wilkins Company，Baltimore，1984.)是世界微生物学界公认的细菌鉴定的权威性、大型指导手册。

由于细菌体积小、结构简单、形态无多大差别，因此在细菌鉴定工作中，一般以形态学特征为辅、以生理生化特征为主进行鉴定。在本项研究中，发明人首先根据分离获得的菌株的基本细胞学和生理学特征将其归类为醋酸菌科(Acetobacteraceae)，然后根据《伯杰氏系统细菌学手册》第1卷第4节：革兰氏好氧杆菌和球菌：醋酸菌科(第268页-第273页)中所描述的方法，设计了一系列的生理生化试验，对所获得的菌株鉴定至醋酸菌属，最终将分离获得的10株纯菌株鉴定为木醋酸菌、巴氏醋酸菌、液化醋酸菌、弱氧化醋酸4个种。

(3)、用斜面菌种接种静止培养红茶菌的方法以筛选木醋酸菌菌株

将鉴定为木醋酸菌、巴氏醋酸菌、液化醋酸菌、弱氧化醋酸菌的4株醋酸菌菌株与接合酵母菌、汉逊德氏酵母菌、路德酵母菌和酿酒酵母菌菌株分别进行两两组合接种试验，即一种醋酸菌加一种酵母菌的组合接种试验，具体操作步骤如下：

A、红茶菌糖茶液的配制，取原料绿茶3～10g，蔗糖30～100g，水1000mL，用沸水冲泡茶叶和糖，保持微沸1～10min，静置使茶叶沉淀，取上清液，分装150mL/250mL三角瓶，108℃～121℃灭菌处理10～25min；

B、按两两组合用接种环从上述纯化的4株醋酸菌菌株和4株酵母菌菌株的纯培养中挑取一环混合分别接进红茶菌糖茶液中，20℃～35℃静止培养6～15天；

即巴氏醋酸菌分别与接合酵母菌、汉逊德氏酵母菌、路德酵母菌和酿酒酵母菌混合接种；

即液化醋酸菌分别与接合酵母菌、汉逊德氏酵母菌、路德酵母菌和酿酒酵母菌混合接种；

即弱氧化醋酸菌分别与接合酵母菌、汉逊德氏酵母菌、路德酵母菌和酿酒酵母菌混合接种；

即木醋酸菌分别与接合酵母菌、汉逊德氏酵母菌、路德酵母菌和酿酒酵母菌混合接种；

结果是，木醋酸菌分别与接合酵母菌、汉逊德氏酵母菌、路德酵母菌和酿酒酵母菌混合接种后均可以形成典型的带有胶膜的红茶菌液，即可确定木醋酸菌具有较强的重新形成红茶菌的功能。

利用纯化取得的木醋酸菌菌株与酵母菌菌株配合，采用液体菌种培养静止红茶菌和振荡通气培养红茶菌的方法即可生产出典型的具有醇、香、酸、甜特征的红茶菌液。

实施例2：

在分离纯化木醋酸菌的方法中，上述B步骤、D步骤中的葡萄糖酵母膏GYC固体培养基配方：葡萄糖50g，酵母膏5g，CaCO₃15g，琼脂12g，水1000mL。

配制红茶菌糖茶液的茶为红茶

上述步骤中的糖也可以是任意几种糖类的混合物，比例任意调配。

其它同实施例1。

实施例3：

在分离纯化木醋酸菌的方法中，上述B步骤、D步骤中的葡萄糖酵母膏GYC固体培养基配方：蜂蜜100g，酵母膏10g，CaCO₃30g，琼脂20g，水1000mL。

配制红茶菌糖茶液的茶为乌龙茶，也可以是茶末、各类茶叶提取物、几种茶叶的混合物。

其它同实施例1。