新的生成肽的酶、生成该酶的微生物和利用它们合成二肽的方法

摘要

来源于选至稳杆菌属和鞘氨醇杆菌属的微生物的酶，能从羧组分和胺组分来合成肽。并且，提供了使用该酶从羧组分和胺组分来合成二肽的方法。本发明涉及不经过复杂合成方法就能简单、廉价和高产地生产肽的新酶。更具体地，本发明提供从羧组分和胺组分催化肽生成反应的新的酶、产生该酶的微生物，及用该酶或微生物生产二肽的廉价方法。从新近发现的属于稳杆菌属的微生物中发现了新的高效生成肽的酶，和发现了可廉价和简单地生产肽的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及不经过复杂的合成方法就能简单、廉价和高产地生产肽的新酶。更具体地，本发明涉及从羧组分和胺组分催化肽生成反应的新酶、生产该酶的微生物，及用该酶或微生物生产二肽的方法。

背景技术

肽在制药领域、食品领域和多种其他领域中得到应用。例如，由于L-丙氨酰-谷氨酰胺比L-谷氨酰胺具有更高的稳定性和水溶性，因此其作为输液和无血清培养基的组分得到使用。

已知的生产肽的化学合成方法，总是不易进行。这种方法的已知实施例包括使用N-苯氧基羰基丙氨酸(在下文，“Z-丙氨酸”)和经保护的L-谷氨酰胺(参见Bull.Chem.Soc.Jpn.，34，739(1961)，Bull.Chem.Soc.Jpn.，35，1966(1962))的方法，和使用Z-丙氨酸和经保护的L-谷氨酸-γ-甲酯(参见Bull.Chem.Soc.Jpn.，37，200(1964))的方法，和使用Z-丙氨酸和非保护的谷氨酸(参见日本公开专利申请号H1-96194)的方法，以及包含源自作为原料的2-取代-丙酰卤化物的中间体的N-(2-取代)-丙酰谷氨酰胺衍生物的合成方法(参见公开专利申请号H6-234715)。

然而，这些方法都需要引入和消除保护基或使用光学活化中间体，就工业应用而言它们并不尽人意。

另一方面，使用酶的肽生成法的代表性公知的实施例包括：使用N-保护和C-非保护的羧基组分、和N-非保护、C-保护的胺组分的缩和反应(在下文，“反应1”)，使用了N-保护、C-保护的羧基组分和N-非保护、C-保护的胺组分的取代反应(在下文，“反应2”)。反应1的实施例是由Z-天冬氨酸和苯基丙氨酸甲酯生成Z-天冬氨酰苯基丙氨酸甲酯的方法(参见日本公开专利申请号S53-92729)，而反应2的实施例是由乙酰苯基丙氨酸乙酯和亮氨酸酰胺生成乙酰苯丙氨酰亮氨酸酰胺的方法(参见Biochemical J.，163，531(1977))。据报道很少有关于使用N-非保护、C-保护的羧基组分的实施例方法的研究。国际公开专利WO90/01555描述了使用N-非保护、C-保护的胺组分的取代反应(在下文，“反应3”)的实施例。例如，可提及由精氨酸乙酯和亮氨酰胺生成精氨酰亮氨酸的方法。欧洲公开专利EP278787A1和EP359399B1描述了使用N-非保护、C-保护的羧基组分和N-非保护、C-非保护的胺组分的取代反应(在下文，“反应4”)的实施例。例如，可提及由酪氨酸乙酯和丙氨酸生成酪氨酰丙氨酸的方法。

发明内容

在上述的反应1至4的方法中，最廉价的生产方法自然属于反应4的一类，其包含最少的保护基。

然而，现有技术(欧洲公开专利EP278787A1)中反应4的实例有以下主要问题：

(1)极慢的肽生产率，

(2)肽产率低，

(3)能生成的仅限于那些具有较高疏水性的氨基酸的肽，

(4)所加入的酶量极大，和

(5)需要衍生于霉菌、酵母或植物的较昂贵的羧肽酶制剂。在反应4中，没有使用衍生于细菌或是酵母属的酵母之外的其他酵母的酶的已知方法，也没有生成丙氨酰谷氨酰胺和其他亲水性高的肽的已知方法。考虑到这种背景，需要发展工业上生产这些肽的廉价方法。

本发明的目的是提供新的不经过复杂合成方法就能简单、廉价和高产地生产肽的酶。更具体地，本发明的目的是提供新的从羧组分和胺组分催化肽生产反应的酶、生产该酶的微生物，和用该酶或微生物生产肽的廉价方法。

本发明的发明人通过针对上述目的通过锐意研究从源自新近发现的、属于稳杆菌属(Empedobacter)等的细菌中找到了新的有效生产肽的酶，并完成本发明。

本发明如以下所述。[1]来自稳杆菌属或鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)的酶，其具有由羧基组分和胺组分生成肽的能力。[2]能由羧基组分和胺组分生成肽的酶，在条件(i)至(iv)下生成二肽的反应中，其能以0.03mM/min或更高的产率来生成L-丙氨酰-谷氨酰胺；

(i)羧基组分是100mM的L-丙氨酸甲酯氢氧化物；

(ii)胺组分是200mM的L-谷氨酰胺；

(iii)pH是9.0；和，

(iv)加入的酶量，作为蛋白质少于0.61mg/ml。

[3]根据[1]或[2]的酶，其中作为底物的羧基组分包括氨基酸酯和氨基酸酰胺。

[4]根据[1]至[3]任一项的酶，其中作为底物的胺组分包括任意一种氨基酸、C-保护的氨基酸和胺。

[5]根据[1]至[4]任一项的酶，其中该酶在pH6.5至10.5的范围具有生成肽的能力。

[6]根据[1]至[5]任一项的酶，其中该酶能在温度0至60℃的范围具有生成肽的能力。

[7]根据[1]至[6]任一项的酶，其中丝氨酸酶抑制物、苯基甲磺酰氟化物不能抑制该酶，但p-硝基苯-p’-胍基苯甲酸盐能抑制该酶。

[8]根据[1]至[7]任一项的酶，其中该酶具有通过SDS-凝胶电泳确定的约75千道尔顿的分子量，和通过凝胶过滤层析法确定的约150千道尔顿的分子量。

[9]一种微生物，能产生根据[1]至[8]任一项的酶。

[10]根据[9]的微生物，其中，微生物是短稳杆菌(Empedobacterbrevis)菌株FERM BP-8113(保藏单位：独立行政法人产业综合技术研究所，国际专利微生物保藏中心，保藏单位地址：日本茨城县筑波市东1-1-1，中央第6，国际保藏提交日期：2002年7月8日)或鞘氨醇杆菌菌株(Sphingobacterium sp.)FERM BP-8124(保藏单位：独立行政法人产业综合技术研究所，国际专利微生物保藏中心，保藏单位地址：日本茨城县筑波市东1-1-1，中央第6，国际保藏提交日期：2002年7月22日)。

[11]生产二肽的方法，包括用根据[1]至[8]任一项的酶或含有该酶的物质，由羧基组分和胺组分生成二肽。

附图简述

图1是表示本发明的酶的最适pH图；

图2是表示本发明的酶的最适温度图；和

图3是表示由L-丙氨酸甲酯和L-丙氨酰胺生成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的时程图。

实施发明的最佳方式

依次详细解释实施本发明的最佳方式：

(1)能产生本发明中的酶的微生物，

(2)微生物的培养，

(3)酶的纯化，

(4)酶性质，和

(5)二肽合成方法。

(1)能产生本发明中的酶的微生物

本发明中的酶可以是能由羧基组分和胺组分生成肽的任意的酶，对生产该酶的微生物没有特别的限制。在本说明书中，羧基组分指为肽健(-CONH-)提供羰基位点(CO)的组分，而胺组分指在肽键提供氨基位点(NH)的组分。另外，在本说明书中，除非另有特别说明，单独用到的术语“肽”指有至少一个肽键的聚合体。另外，在本说明书中，术语“二肽”指有一个肽键的肽。

能产生本发明中的酶的微生物实施例包括属于稳杆菌等属的细菌，其中具体实施例包括短稳杆菌菌株ATCC 14234(菌株FERM P-18545)，和鞘氨醇杆菌菌株FERM BP-8124。短稳杆菌菌株ATCC 14234(菌株FERM P-18545，菌株FERM BP-8113)和鞘氨醇杆菌菌株FERMBP-8124是本发明的发明者筛选的，能由羧基组分和胺组分高收率地生产肽的微生物的研究结果。具有短稳杆菌菌株ATCC 14234(菌株FERMP-18545)或鞘氨醇杆菌菌株FERM BP-8124的类似细菌学特征的微生物，也是能产生本发明中酶的微生物。

短稳杆菌菌株ATCC 14234(菌株FERM P-18545)已于2001年10月1日在独立行政法人产业综合技术研究所，国际专利微生物保藏中心(日本茨城县筑波市东1-1-1，中央第6)得到保藏，保藏号为FERMP-18545。根据布达佩斯条约的规定，该微生物随即于2002年7月8日提交到独立行政法人产业综合技术研究所，国际专利微生物保藏中心，保藏号为FERM BP-8113(微生物说明：Empedobacter brevis菌株AJ 13933)。

鞘氨醇杆菌菌株AJ 110003于2002年7月22日在独立行政法人产业综合技术研究所，国际专利微生物保藏中心得到保藏，保藏号为FERM BP-8124。应当指出通过下列描述的鉴定实验，将菌株AJ 110003鉴定为上述的鞘氨醇杆菌菌株。菌株FERM BP-8124(保藏单位：独立行政法人产业综合技术研究所，国际专利微生物保藏中心，保藏单位地址：日本茨城县筑波市东1-1-1，中央第6，国际保藏日期：2002年7月22日)是不形成孢子的和不活动的革兰氏阴性杆菌(0.7至0.8×1.5至2.0微米(以下，“μm”))。其菌落呈圆形，边缘整齐，中央轻度隆起，表面光滑，淡黄色。该微生物在30℃生长，呈过氧化氢酶阳性、氧化酶阳性和OF测试阴性(葡萄糖)，根据这些性质将其确定为属于鞘氨醇杆菌属的细菌。而且，从如下性质：对硝酸还原作用阴性、不产吲哚、不利用葡萄糖产酸、精氨酸双水解酶阴性、尿素酶阳性、七叶苷水解阳性、明胶水解阴性、β-半乳糖苷酶阳性、葡萄糖同化阳性、L-阿拉伯糖同化阴性、D-甘露糖同化阳性、D-甘露醇同化阴性、N-乙酰-D-葡糖胺同化阳性、麦芽糖同化阳性、葡糖酸钾同化阴性、n-羊醋酸阴性、己二酸同化阴性、dL-苹果酸同化阴性、柠檬酸钠同化阴性、乙酸苯酯同化阴性和细胞色素氧化酶阳性，确定该微生物具有类似于多食鞘氨醇杆菌(Shingobacterium multivorum)或模式种(Sphingobacterium spiritivorum)的性质。而且，作为16S rRNA基因碱基序列同源性的分析结果，尽管与多食鞘氨醇杆菌显示出最高的同源性(98.8％)，但没有它完全匹配的菌株。因此将这种菌株确定为鞘氨醇杆菌菌株。

从上述的短稳杆菌或鞘氨醇杆菌的细菌中可分离和纯化获得本发明的酶。另外，基于所分离的酶，通过遗传工程技术也可获得本发明的酶以及产生该酶的微生物。即，基于所分离和纯化的酶，通过分离编码该酶的DNA，随即将DNA导入合适的宿主中来表达DNA。另外，基于编码从短稳杆菌中获得的本发明的酶的多核苷酸等等来生成探针，从其他微生物中也能获得能从羧基组分和胺组分生成肽的酶。在第二版《分子克隆》，冷泉港出版社(1989)和其他出版物中描述了多种基因重组技术。

(2)微生物的培养

为了获得含有本发明中用到的酶的微生物的细胞培养物，只要在适宜的培养基中培养和生长微生物就足够了。对用于此目地的培养基，只要其允许微生物生长，就没有特殊的限制。该培养基可以是含有必要的普通碳源、氮源、磷源、硫源、无机离子和有机营养源的普通培养基。

例如，只要该微生物能利用，就可以使用任何碳源。能使用的碳源的具体实施例，包括糖类诸如葡萄糖、果糖、麦芽糖和直链淀粉，醇类诸如山梨醇、乙醇和甘油，有机酸及其盐诸如延胡索酸、柠檬酸、乙酸和丙酸，碳氢化合物诸如石蜡及其混合物。

能使用的氮源实施例包括有机酸盐铵盐诸如硫酸铵和氯化铵，有机酸铵盐诸如延胡索酸铵盐和柠檬酸铵盐，硝酸盐诸如硝酸钠和硝酸钾，有机氮化合物及其混合物诸如蛋白胨、酵母提取物、肉汁和玉米浆。

另外，培养基中用到的普通氮源，例如无机盐、痕量金属盐和维生素，也能适宜地被混合和使用。

对于培养条件，并没有特别的限制，例如，在需要条件下，将pH和温度分别适当地控制在pH5至8的范围以及温度15至40℃的范围，在有氧条件下培养约12至48小时。

(3)酶的纯化

本发明中纯化酶的实施例说明了从Empedobacter brevis中分离和纯化肽合成酶的方法。首先，通过用例如超声波破碎的物理方法、或用溶壁酶的酶催法来破碎细胞，及通过离心分离等等除去非溶性部分，从例如Empedobacter brevis菌株FERM BP-8113(保藏单位：独立行政法人产业综合技术研究所，国际专利微生物保藏中心，保藏单位地址：日本茨城县筑波市东1-1-1，中央第6，国际保藏提交日期：2002年7月8日)的细胞中制备微生物细胞提取物。

然后通过结合诸如阴离子交换层析法、阳离子交换层析法或凝胶过滤层析法的普通的蛋白质纯化法，从以上方式获得的细胞提取物中纯化肽合成酶。

在阴离子交换层析法中用到的载体的实施例是Q-琼脂糖凝胶HP(Amersham制造)。当含有该酶的细胞提取物通过装填了载体的层析柱时，在pH8.5条件下，从未被吸附的部分中回收酶。

阳离子交还层析法中用到的载体实施例是MonoS HR(Amersham制造)。将含有酶的细胞提取物通过装填了载体的层析柱，使酶吸附在载体(柱中)上，然后洗柱，用含有高盐浓度的缓冲液将酶洗脱。在那时，可将盐浓度依次提高或梯度提高。例如，就使用MonoS HR来说，以约0.2至0.5M浓度的NaCl洗脱吸附在载体上的酶。

以上述的方式纯化的酶，可通过凝胶过滤层析法等等得到进一步均质纯化。在凝胶过滤层析法中用到载体的实施例是Sephadex 200pg(Amersham制造)。

在先前纯化过程中，可根据下述的方法通过测定各部分(分留物)的肽合成活性确定含有该酶的部分。

(4)本发明的酶性质

鉴于本发明中的酶是具有由羧基组分和胺组分合成肽能力的酶，下文基于其性质来说明本发明中优选的酶实施例。

将二肽生成率作为指标，具有下述能力的酶，是本发明的酶的一种优选方式。即，本发明的酶的一种优选方式是，在以下(i)至(iv)的二肽生成反应中，具有从羧基组分和胺组分生成肽能力的酶，和具有显示优选0.03mM/min或更高的、更优选0.3mM/min或更高、和特别优选1.0mM/min或更高的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的生成率的酶。二肽生成反应的条件如下：

(i)羧基组分是L-丙氨酸甲酯氢氯化物(100mM)；

(ii)胺组分是L-谷氨酰胺(200mM)；

(iii)pH是9.0；和，

(iv)加入的酶量，作为蛋白质少于0.61mg/ml。

上述加入的酶量指添加到反应系统中的终酶量，以及添加0.01mg/ml或更多、及优选0.02mg/ml或更多的酶，都是指所希望的蛋白质的量。术语“蛋白质的量”指用蛋白测定CCB溶液(Nakarai制造)和小牛血清蛋白用作标准物质的考马斯亮蓝比色法显示的值。

上述合成速率远远超过常规使用的酶的合成肽的速率，并且本发明的酶具有以极高速率来催化肽生成的能力。

作为测定酶活方法的具体实施例，通过使酶在含有作为底物的氨基酸酯和胺的硼酸盐缓冲液中反应、随即确定最后得到的肽数量，从而测定酶活。作为更具体的实施例，将酶在含有100mM L-丙氨酸甲酯和200mM L-谷氨酰胺的100mM硼酸盐缓冲液(pH.9.0)中、25℃下反应几分钟。

将本发明中用到的酶活单位确定为：1单位(U)是在含有100mM L-丙氨酸甲酯和200mM L-谷氨酰胺的100mM硼酸盐缓冲液(pH.9.0)中，在25℃的反应条件下，1分钟生成1微摩尔肽的所需酶量。

另外，本发明的酶学特性的优选方式的实施例是：氨基酸酯和氨基酸酰氨都可以作为该酶的羧基组分底物。措词“氨基酸酯和氨基酸酰氨都可被用作为底物”意思是将至少一种类型的氨基酸酯和至少一种类型的氨基酸酰氨作为底物。另外，本发明的酶学特性的优选方式是：任意氨基酸、C-保护的氨基酸和胺都可以作为该酶的胺组分底物。术语“氨基酸、C-保护的氨基酸、胺都可被用底物”意思是将至少一种类型的氨基酸或更多、至少一种类型的C-保护的氨基酸或更多和至少一种类型或更多的胺作为底物。由于考虑到其作为底物的羧基组分或氨基组分的特异性范围宽，本发明的酶在能选择范围广的原料的意义上被优选，同时，是在能有利于成本和生产设备方面被工业生产优选。

羧基组分的具体实施例包括L-氨基酸酯、D-氨基酸酯、L-氨基酸酰胺和D-氨基酸酰氨。另外，氨基酸酯不仅包括对应于天然存在的氨基酸的氨基酸酯，也包括对应于非天然存在的氨基酸及其衍生物的氨基酸酯。进一步，氨基酸酯的实施例包括α-氨基酸酯、β-、γ-、和ω-氨基酸酯以及含有不同氨基结合位点的其它氨基酸酯等。代表性氨基酸酯实施例包括氨基酸的甲酯、乙酯、正丙酯、异丙酯、正丁酯、异丁酯和特丁酯，等等。

胺组分的具体实施例包括L-氨基酸、C-保护的L-氨基酸、D-氨基酸、C-保护的D-氨基酸和胺。另外，胺的实施例不仅包括天然存在的胺，而且包括非天然存在的胺及其衍生物。另外，氨基酸实施例不仅包括天然存在的氨基酸，而且包括非天然存在的氨基酸或其衍生物。这些包括α-氨基酸、β-、γ-、和ω-氨基酸以及含有不同氨基结合位点的其它氨基酸。

另外，在其他方面，本发明的酶的一个优选方式是pH范围超过了、能催化肽生产反应的6.5至10.5范围的酶。本发明的酶因为能在宽pH范围下催化该反应在工业生产中可根据各种限制因素灵活调节，因而是优选的。然而，更优选通过进一步调整所获得的酶的最适pH以使酶的催化性能最大化。

而且，本发明的酶的优选方式的另一个不同方面的实施例是：温度范围超过了酶能催化肽生成反应是在0至60℃范围中的酶。由于本发明的酶能在宽温度范围催化反应，在工业生产中可针对各种限制因素灵活调节，因而优选。然而，在肽的实际生产中，更优选通过进一步调整所获得的酶的最适温度而使用酶，以使酶的催化性能最大化。

(5)二肽合成方法

根据本发明的二肽生产方法，包括使用有肽合成活性的酶从羧基组分和胺组分来合成肽或使用含酶物质作用于羧基组分或胺组分。

涉及将本发明中用到的酶或含酶物质作用于羧基组分和胺组分的方法，只要将酶或含酶物质、羧基组分和胺组分混合就足够了。具体而言，方法可用于将酶或含酶物质加入含有羧基组分和胺组分的溶液中并使之反应，在使用产生该酶的微生物的情况下，可以利用培养产生该酶的微生物，产生和富集存在于微生物或微生物培养肉汤中的酶，然后将羧基组分和胺组分加入培养肉汤中的方法。然后通过已建立的方法收集和纯化所合成的二肽。

术语“含酶物质”指含有酶，及其特殊形式的实例，包括产生酶的微生物培养物、从培养物中分离的微生物细胞、和处理过的微生物细胞产物。微生物培养物指通过培养微生物而获得的物质，更具体地，指微生物细胞、用于培养微生物的培养基、和由培养的微生物等产生的物质的混合物。另外，可洗涤微生物细胞，再使用洗过的微生物细胞。进一步，处理过的微生物细胞产物包括破碎的、裂解的或冻干的微生物细胞，也包括通过处理微生物细胞等等而回收的粗酶和通过纯化粗酶而获得的纯酶。可将通过多种类型的纯化方法获得的不完全纯酶用作纯酶，或可使用通过共价连接、吸附或包埋法固定的固定化酶。另外，由于取决于所用的微生物，在培养中一些微生物会部分裂解，在此情况下也可将培养液上清作为含酶物质使用。

另外，不但野生菌株，遗传重组菌株也可作为含酶的微生物使用。微生物不限于完整细胞，也可使用丙酮处理过的微生物细胞、冻干的微生物细胞或其他处理过的微生物细胞。也可使用通过共价连接、吸附、包埋或其他方法固定的固定化微生物细胞以及处理过的固定化微生物细胞。

应当指出在使用培养物的情况下，所培养的微生物细胞或所处理的微生物细胞产物中的酶，在一些情况中不是参与肽的合成而是降解生成的肽，在这样情况下，视情况而定更优选加入类似于乙二胺四乙酸(EDTA)等金属蛋白酶抑制物。添加的量在0.1mM至300mM的范围内，优选1mM至100mM。

使用的酶量或含酶物质应当是显示目标效果的量(在下文，“有效量”)。尽管所属领域的技术人员通过简单的、基本的实验就能容易地确定该有效量，但就使用酶而言，例如，其使用的量是约0.01至100单位(U)，然而对于使用洗涤过的微生物细胞，其使用的量是约1至500g/L。

只要其能和作为胺组分的形式的其他底物的缩和反应来生成肽，可使用任意的羧基组分。羧基组分的实施例包括L-氨基酸酯、D-氨基酸酯、L-氨基酸酰胺和D-氨基酸酰胺。氨基酸酯不仅包括对应于天然存在的氨基酸的氨基酸酯，也包括对应于非天然存在的氨基酸及其其衍生物的氨基酸酯。进一步，氨基酸酯的实施例包括α-氨基酸酯、β-、γ-、和ω-氨基酸酯以及含有不同氨基结合位点的其它氨基酸酯等。代表性氨基酸酯实施例包括氨基酸的甲酯、乙酯、正丙酯、异丙酯、正丁酯、异丁酯和特丁酯等等。

所使用的胺组分只要其能和作为羧基组分的形式的其他底物通过缩和反应来生成肽即可。胺组分的实施例包括L-氨基酸、C-保护的L-氨基酸、D-氨基酸、C-保护的D-氨基酸和胺。胺的实施例不仅包括天然存在的胺，而且包括非天然存在的胺及其衍生物。另外，氨基酸实施例不仅包括天然存在的氨基酸，而且包括非天然存在的氨基酸或其衍生物。这些包括α-氨基酸、β-、γ-、和ω-氨基酸以及含有不同氨基结合位点的其它氨基酸。

尽管缩和反应中的作为起始物质的羧基组分和胺组分，分别是1mM至10M，优选0.05摩尔(在下文，“M”)至2M，还是有一些情况：其优选加入胺组分至等量于或大于所加入的羧基组分。另外，对于在高浓度下抑制反应的底物，可在反应中调整其至不会导致抑制反应的浓度并依次增加底物。

允许肽生成的反应温度是0至60℃，优选5至40℃。允许肽生成的反应pH是6.5至10.5，优选7.0至10.0。

实施例

以下通过本发明的实施例给出更详细的说明，但本发明不限于这些实施例。除了通过茚三酮染色薄膜层析法(定性)确定之外，为了检测产物，还可以通过以下的高效液体色谱以进行定量。柱：惰性ODS-2(GL Science，Inc.制造)，洗脱液：含5.0mM 1-辛烷磺酸钠(pH2.1)的磷酸盐水溶液∶甲醇＝100∶15至50，流速：1.0mL/min，检测：210纳米(在下文，“nm”)。

实施例1微生物的培养(Empedobacter brevis菌株FERM BP-8113)

将1升(在下文，“L”)中含有5克(在下文，“g”)葡萄糖、5g硫酸铵、1g磷酸二氢钾、3g磷酸氢二钾、0.5g硫酸镁、10g酵母提取物和10g蛋白胨的50mL培养基(pH6.2)转入500mL Sakaguchi烧瓶中，115℃灭菌15分钟。然后向上述培养基中接种一环于30℃培养16小时后的Empedobacter brevis菌株FERM BP-8113(保藏单位：独立行政法人产业综合技术研究所，国际专利微生物保藏中心，保藏单位地址：日本茨城县筑波市东1-1-1，中央第6，国际保藏提交日期：2002年7月8日)，随即30℃、120振荡/min振荡培养16小时。

(实施例2)使用微生物细胞来合成肽

通过离心(10,000转数每分钟(在下文，“rpm”)，15分钟)在实施例1中获得的培养肉汤而收集微生物细胞，随即以含10mM EDTA的100mM硼酸盐缓冲液(pH9.0)将其悬浮至100g/L的浓度。分别将1mL该悬浮液加到含10mM EDTA、200mM的下述羧基组分和400mM的下述氨基酸的1mL(100mM，pH9.0)硼酸盐缓冲液中，直至终体积为2mL，在18℃下进行反应2小时。表1表示所生成的肽的反应结果。

                                                     表1

羧基组分 胺组分         生成的肽(mM) 羧基组分  胺组分           生成的肽(mM)L-Ala-OMe L-Leu L-Ala-L-Leu 38.2 Gly-OMe  L-His L-Gly-L-His 22.1 L-Met L-Ala-L-Met 68.3 L-Ser-OMe  L-Ser L-Ser-L-Ser 29.0 L-Phe L-Ala-L-Phe 62.4 L-Val-OMe  L-Met L-Val-L-Met 10.5 L-Ser L-Ala-L-Ser 51.3 L-Met-OMe  L-Phe L-Met-L-Phe 28.5 L-His L-Aa-L-His 52.1 L-Thr-OMe  L-Leu L-Thr-L-Leu 23.0 L-Arg L-Aa-L-Arg 72.1 L-Ile-OMe  L-Met L-Ile-L-Met 8.3 L-Gln L-Ala-L-Gln 68.0

氢氯化盐用于作所有的羧基组分

实施例3酶的纯化

在离心分离后既可在冰上也可于4℃进行该步骤。以实施例1中相同的方式培养Empedobacter brevis菌株FERM BP-8113(保藏单位：独立行政法人产业综合技术研究所，国际专利微生物保藏中心，保藏单位地址：日本茨城县筑波市东1-1-1，中央第6，国际保藏提交日期：2002年7月8日)，通过离心分离(10,000rpm，15分钟)收集微生物细胞。用50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)洗涤16g微生物细胞后，将其悬浮于40毫升(在下文，“ml”或“mL”)的相同缓冲液中，使其接受以195瓦的超声波破碎处理45分钟。然后离心(10,000rpm，30分钟)超声波破碎液来除去破碎的细胞碎片，得到超声波破碎上清液。将超声波破碎上清液经50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)过夜透析，随即通过超速离心(50,000rpm，30分钟)除去非可溶性部分而得到以上清液形式的可溶性部分。所得到的可溶性部分上样于以Tris-HCl缓冲液(pH8.0)预平衡的Q-琼脂糖凝胶HP柱(Amersham制造)，从非吸附部分中收集活性部分。将活性部分经50mM乙酸盐缓冲液(pH4.5)过夜透析，随即通过离心分离(10,000rpm，30分钟)除去非可溶性部分而得到以上清液形式的透析部分。然后将透析部分上样于以50mM乙酸盐缓冲液(pH4.5)预平衡的Mono S柱(Amersham制造)，以含0至1M NaCl线性浓度梯度的相同缓冲液来洗脱酶。将活性部分中含有最低水平的杂蛋白质的部分上样于以含1M NaCl的50mM乙酸盐缓冲液(pH4.5)预处理的Superdex200pg柱(Amersham制造)，并将含有1M NaCl的相同缓冲液(pH4.5)过柱以进行凝胶过滤，获得活性部分溶液。作为进行这些步骤的结果，根据电泳实验结果来确定本发明中用到的肽合成酶被均质纯化。在前述的纯化方法中的酶回收率是12.2％，纯度是707倍。

实施例4酶分子量的测量

SDS-凝胶电泳法

将由实施例3的方法获得的0.3微克(ug)纯化的酶组分上样于聚丙稀酰胺电泳。将0.3％(w/v)Tris、1.44％(w/v)甘氨酸和0.1％(w/v)十二烷基磺酸钠用来作电泳缓冲液，将具有10至20％胶浓度的浓度梯度的凝胶(Multigel 10至20，Daiichi Pure Chemicals制造)用来作聚丙稀酰胺凝胶，并且使用Pharmacia的分子量标志用来作分子量标志。电泳结束后，用考马斯亮蓝R-250染色凝胶，并在约75千道尔顿(在下文，“kDa”)分子量的位置检出单一的带。

凝胶过滤

将由实施例3的方法获得的纯化的酶组分上样于用含1M NaCl的50mM乙酸缓冲液(pH4.5)预平衡的Superdex 200pg柱(Amersham制造)，通过将含有1M NaCl的相同缓冲液过柱来进行凝胶过滤，从而测定分子量。使用Pharmacia的分子量标志用作已知分子量的标准蛋白质来制备标准曲线。结果，该酶的分子量约为150kDa。

基于SDS-凝胶电泳和凝胶过滤的结果，显示该酶是具有分子量约75kDa的二体。

实施例5酶最适pH

在由L-丙氨酸甲酯氢氯化物和L-谷氨酰胺生成的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的反应中，检验pH的影响。将乙酸盐缓冲液(pH3.9至5.4)、MES缓冲液(pH5.4至6.4)、磷酸盐缓冲液(pH6.0至7.9)、硼酸盐缓冲液(pH7.8至9.3)、CAPS缓冲液(pH9.3至10.7)和K₂HPO₄-NaOH缓冲液(pH10.8至11.6)作为缓冲液。将1微升(μl)从实施例3(约180U/ml)获得的Mono S酶部分加到100μl缓冲液中(100mM)，其中每份缓冲液含100mM L-丙氨酰胺甲酯、200mM L-谷氨酰胺和10mMEDTA，并使其在18℃下反应5分钟以确定反应中pH的影响。图1表示基于将使用硼酸盐缓冲液(pH9.3)的情况定值为100％的结果。结果，最适酶pH是8至9.5。

实施例6酶最适温度

在由L-丙氨酸甲酯氢氯化物和L-谷氨酰胺生成的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的反应中，检验温度的影响。将1μl从实施例5获得的等分量的相同酶部分加到100μl 100mM硼酸盐缓冲液(pH9.0)，该缓冲液含100mM L-丙氨酰胺甲酯、200mM L-谷氨酰胺和10mM EDTA，并使其在各个温度下反应5分钟以确定反应中温度的影响。图2表示基于将34℃下的活性定值为100％的结果。结果，最适酶温度是30至40℃。

(实施例7)酶抑制物

以L-丙氨酸甲酯氢氯化物和L-谷氨酰胺作为底物，检验在L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的生产中的抑制物的影响。将2μl从实施例5获得的等分量的相同酶部分加到50μl的100mM硼酸盐缓冲液(pH9.0)中，该缓冲液含表2所示的10mM各种酶抑制物，并使其在25℃下反应5分钟。应当指出，使用前将o-二氮杂菲、苯基甲磺酰氟化物和p-硝基苯-p’-胍基苯甲酸盐溶解于甲醇使浓度为50mM 。各个条件下的酶活表示为：把在缺乏酶抑制物时，合成的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺定值为100的相对活性。结果如表2所示，在所检测的丝氨酸酶抑制物中，苯基甲磺酰氟化物不抑制该酶，但p-硝基苯-p’-胍基苯甲酸盐抑制该酶。

                      表2

           酶抑制物 生产L-Ala-L- Gln的相对活性 (％)无 100金属酶抑制物 EDTA 96 o-二氮杂菲 96SH酶抑制物N-乙基马来酰亚胺110单碘醋酸盐101丝氨酸酶抑制物苯基甲磺酰氟化物1154-(2-氨乙酸)苯磺酰氟化物75p-硝基苯-p’-胍基苯甲酸盐0.1

实施例8由L-丙氨酸甲酯和L-谷氨酰胺来合成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺

将在实施例5用到的3μl等分量的相同酶部分加到100μl的100mM硼酸盐缓冲液(pH9.0)，该缓冲液含100mM L-丙氨酰胺甲酯氢氯化物、200mM L-谷氨酰胺和10mM EDTA，并使其在18℃下反应。结果如图3所示，在加入酶的批次可合成83mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L-Ala-L-Gln)，并且副产品L-Ala-L-Ala-L-Gln的浓度是1.3mM。另一方面，在不加酶的批次很难观察到任何L-Ala-L-Gln的生成，并且在反应120分钟后，酶浓度仅仅约0.07mM。

实施例9在L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的生成中L-谷氨酰胺浓度的影响

将在实施例5用到的1μl等分量的相同酶部分加到100μl的100mM硼酸盐缓冲液(pH9.0)，该缓冲液含100mM L-丙氨酰胺甲酯氢氯化物、如图3所示浓度的L-谷氨酰胺和10mM EDTA，并使其在18℃下反应2小时。结果如表3所示。

表3

  L-丙氨酸甲酯氢氯化物(mM)    L-谷氨酰胺    (mM)  L-Ala-Gln(mM)  100    100  68.2    110  72.1    120  73.3    130    75.1    150    75.5    200    82.0

实施例10酶底物特异性(1)

在以L-氨基酸酯作为羧基组分的情况下检测酯特异性。将在实施例5用到的2μl等分量的相同酶部分加到100μl的100mM硼酸盐缓冲液(pH9.0)，该缓冲液含表4所示的100mM的羧基组分、200mM L-谷氨酰胺和10mM EDTA，并使其在25℃下反应2小时。表4所示反应中的L-Ala-L-Gln生成量(表4中HCl代表氢氯化物)。

                        表4

  羧基组分   生成的L-Ala-L-Gln(mM)  L-丙氨酸甲酯·HCl  L-丙氨酸乙酯·HCl  L-丙氨酸异丙酯·HCl  L-丙氨酸-t-丁酯·HCl   84.3   91.5   78.9   7.5

实施例11酶底物特异性(2)

在以L-丙氨酸甲酯作为羧基组分和以多种L-氨基酸作为胺组分的情况下检测肽的合成。将在实施例5用到的2μl等分量的相同酶部分加到100μl的100mM硼酸盐缓冲液(pH9.0)，该缓冲液含100mM的L-丙氨酸甲酯氢氯化物、表5所示的150mM的L-氨基酸和10mM EDTA，并使其在25℃下反应3小时。该反应中的各种肽生成量如表5所示。(“+”标记指那些被确认生成却由于缺乏标准而不能得到量化的肽，同时“tr”指痕量)。

                          表5

  胺组分     生成的肽(mM) 胺组分    生成的肽(mM)  Gly  L-Ala  L-Val  L-Leu  L-Ile  L-Met  L-Phe  L-Trp  L-Ser  L-Thr   L-Ala-Gly   L-Ala-L-Ala   L-Ala-L-Val   L-Ala-L-Leu   L-Ala-L-Ile   L-Ala-L-Met   L-Ala-L-Phe   L-Ala-L-Trp   L-Ala-L-Ser   L-Ala-L-Thr  13.7  25.4  20.8  45.3  33.9  83.3  74.4  53.9  62.5  53.9  L-Asn  L-Gln  L-Tyr  L-CySH  L-Lys  L-Arg  L-His  L-Asp  L-Glu  L-Pro L-Ala-L-Asn L-Ala-L-Gln L-Ala-L-Try L-Ala-L-CySH L-Ala-L-Lys L-Ala-L-Arg L-Ala-L-His L-Ala-L-Asp L-Ala-L-Glu L-Ala-L-Pro  65.5  79.3  17.6  +  71.8  88.0  66.9  2.1  42.9  tr

实施例12酶底物特异性(3)

在以多种类型的L-氨基酸甲酯作为羧基组分和以L-谷氨酰胺作为胺组分的情况下检测肽的合成。将在实施例5用到的2μl等分量的相同酶部分加到100μl的100mM硼酸盐缓冲液(pH9.0)，该缓冲液含如表6所示的100mM的L-氨基酸甲酯氢氯化物(AA-OMe HCl)、150mM的L-谷氨酰胺和10mM EDTA，并使其在25℃下反应3小时。表6所示该反应中的各种肽生成量。(“+”标记指那些被确认生成却由于缺乏标准而不能得到量化的肽，同时“tr”指痕量)。

此外，在使用L-Trp-OMe和L-Tyr-OMe的情况下，将Tween-80加到反应系统中直至0.1％的终浓度。

                         表6

羧基组分  生成的肽(mM)羧基组分  生成的肽(mM)  Gly-OMe  L-Ala-OMe  L-Val-OMe  L-Leu-OMe  L-Ile-OMe  L-Met-OMe  L-Phe-OMe  L-Trp-OMe  L-Ser-OMe  L-Thr-OMe  L-Asn-OMe  L-Gln-OMe  Gly-L-Gln  L-Ala-L-Gln  L-Val-L-Gln  L-Leu-L-Gln  L-Ile-L-Gln  L-Met-L-Gln  L-Phe-L-Gln  L-Trp-L-Gln  L-Ser-L-Gln  L-Thr-L-Gln  L-Asn-L-Gln  L-Gln-L-Gln  54.7  74.6  15.4  +  8.4  12.0  0.9  +  24.0  81.9  +  0.3 L-Tyr-OMe CySH-OMe L-Lys-OMe L-Arg-OMe L-His-OMe L-Asp-α-OMe L-Asp-β-OMe L-Glu-α-OMe L-Glu-γ-OMe L-Pro-OMe  L-Try-L-Gln  L-CySH-L-Gln  L-Lys-L-Gln  L-Arg-L-Gln  L-His-L-Gln  α-L-Asp-L-Gln  β-L-Asp-L-Gln  α-L-Glu-L-Gln  γ-L-Glu-L-Gln  L-Pro-L-Gln  3.4  +  +  7.1  +  tr  tr  +  +  2.2

(氢氯化盐用于所有的羧基组分)

实施例13酶底物特异性(4)

在以多种L-氨基酸甲酯作为羧基组分和多种L-谷氨酰胺作为胺组分的情况下检测肽的合成。将在实施例5用到的2μl等分量的相同酶部分加到100μl的100mM硼酸盐缓冲液(pH9.0)，该缓冲液含如表7所示的100mM的L-氨基酸甲酯氢氯化物(AA-OMe HCl)、如表7所示的150mM的L-氨基酸和10mM EDTA，并使其在25℃下反应3小时。表7所示该反应中的各种肽生成量。“tr”指痕量。此外，在使用L-Trp-OMe的情况下，将Tween-80加到反应系统中直至0.1％的终浓度。“+”标记指那些被确认生成却由于缺乏标准而不能得到量化的肽。

                            表7

羧基组分胺组分生成的肽(mM)羧基组分胺组分生成的肽(mM)  Gly-OMe  L-CySH  Gly-L-CySH  45.6   L-Met-OMe  L-Ser  L-Met-L-Ser  12.8  L-Arg  Gly-L-Arg  25.5  L-Met  L-Met-L-Met  25.0  L-Phe  Gly-L-Phe  44.0  L-Phe  L-Met-L-Phe  34.0  L-His  Gly-L-His  31.6   L-Ile-OMe  L-Ser  L-Ile-L-Ser  17.2  L-Lys  Gly-L-Lys  9.8  L-Met  L-Ile-L-Met  10.0  L-Ser  Gly-L-Ser  44.2  L-Phe  L-Ile-L-Phe  5.2  L-Thr-OMe  Gly  L-Thr-Gly  9.4   L-Arg-OMe  L-Ser  L-Arg-L-Ser  3.6  L-Ala  L-Thr-L-Ala  9.4  L-Met  L-Arg-L-Met  0.7  L-Val  L-Thr-L-Val  0.7  L-Phe  L-Arg-L-Phe  1.9  L-Leu  L-Thr-L-Leu  28.4   L-Leu-OMe  L-Met  L-Leu-L-Met  12.2  L-Met  L-Thr-L-Met  38.6   L-Trp-OMe  L-Met  L-Trp-L-Met  4.1  L-Ser  L-Thr-L-Ser  58.2   L-Lys-OMe  L-Met  L-Lys-L-Met  6.8  L-Ser-OMe  L-Ser  L-Ser-L-Ser  38.0   L-His-OMe  L-Met  L-His-L-Met  6.5  L-Met  L-Ser-L-MeL  12.5   L-Asn-OMe  L-Glu  L-Asn-L-Glu  10.2  L-Phe  L-Ser-L-Phe  20.3  L-Val-OMe  L-Ser  L-Val-L-  Ser  30.8  L-Met  L-Val-L-  Met  10.3  L-Phe  L-Val-L-  Phe  6.1

(氢氯化盐用于所有的羧基组分)

实施例14酶底物特异性(5)

在以L或D型的多种氨基酸甲酯作为羧基组分，和L或D型的各种L-氨基酸甲酯作为胺组分的情况下检测肽生产。将在实施例5用到的2μl等分量的相同酶部分加到100μl的100mM硼酸盐缓冲液(pH9.0)，该缓冲液含如表8所示的100mM的多种氨基酸甲酯氢氯化物(AA-OMe HCl)、如表8所示的150mM的多种氨基酸和10mM EDTA，并使其在25℃下反应3小时。该反应中的各种肽生成量如表8所示。“tr”指痕量。

                         表8

  羧基组分    胺组分         生成的肽(mM)  D-Ala-OMe    L-Gln D-Ala-L-Gln    69.3  D-Ala-OMe    L-Ser D-Ala-L-Ser    20.3  D-Thr-OMe D-Thr-L-Ser    1.0  D-Ser-OMe D-Ser-L-Ser    3.3  D-Val-OMe D-Val-L-Ser    0.6  D-Met-OMe D-Met-L-Ser    5.1  L-Ala-OMe    D-Gln L-Ala-D-Gln    0.3  L-Ala-OMe    D-Ser L-Ala-D-Ser    5.4  L-Thr-OMe L-Thr-D-Ser    6.9  L-Ser-OMe L-Ser-D-Ser    16.2  L-Val-OMe L-Val-D-Ser    1.4  L-Met-OMe L-Met-D-Ser    1.9  D-Ala-OMe    D-Gln D-Ala-D-Gln    tr  D-Ala-OMe    D-Ser D-Ala-D-Ser    0.2  D-Thr-OMe D-Thr-D-Ser    1.1  D-Ser-OMe D-Ser-D-Ser    2.5  D-Val-OMe D-Val-D-Ser    0.5  D-Met-OMe D-Met-D-Ser    2.7

(氢氯化盐用于所有的羧基组分)

实施例15酶底物特异性(6)

在以多种L-氨基酸酰氨作为羧基组分，和多种L-氨基酸作为胺组分的情况下检测肽的合成。将在实施例5用到的2μl等分量的相同酶部分加到100μl的100mM硼酸盐缓冲液(pH9.0)，该缓冲液含如表9所示的100mM的L-氨基酸酰氨(AA-NH₂HCl)、如表9所示的150mM的L-氨基酸和10mM EDTA，并使其在25℃下反应3小时。该反应中的各种肽生成量如表9所示。

                        表9

  羧基组分    胺组分        生成的肽(mM)  L-Phe-NH₂    L-Gln L-Phe-L-Gln    0.2  L-Phe-NH₂    L-Ser L-Phe-L-Ser    0.6  L-Ala-NH₂    L-Gln L-Ala-L-Gln    7.6  L-Ala-NH₂    L-Met L-Ala-L-Met    3.4  L-Ala-NH₂    L-His L-Ala-L-His    3.9  L-Thr-NH₂    L-Gln L-Thr-L-Gln    0.3

实施例16酶底物特异性(7)

在以多种L-丙氨酸甲酯作为羧基组分和C-保护的L-氨基酸作为胺组分的情况下检测肽的合成。将在实施例5用到的2μl等分量的相同酶部分加到100μl的100mM硼酸盐缓冲液(pH9.0)，该缓冲液含如表10所示的100mM的L-氨基酸甲酯(AA-OMe HCl)、如表10所示的150mM的L-氨基酸酰氨和10mM EDTA，并使其在25℃下反应3小时。表10所示该反应中的各种肽生成量。

                           表10

  羧基组分  胺组分 生成的肽    (mM)  L-Ala-OMe  Gly-NH₂ L-Ala-Gly-NH₂    7.4  L-Ala-NH₂ L-Ala-L-Ala-NH₂    8.3  L-Phe-NH₂ L-Ala-L-Phe-NH₂    12.2

实施例17酶底物特异性(8)

在以多种氨基酸甲酯作为羧基组分和甲胺作为胺组分的情况下检测肽的合成。将在实施例5用到的2μl等分量的相同酶部分加到100μl的100mM硼酸盐缓冲液(pH9.0)，该缓冲液含如表11所示的100mM的氨基酸甲酯(AA-OMe HCl)、如表11所示的150mM的甲胺和10mMEDTA，并使其在25℃下反应3小时。该反应中的各种肽生成量如表11所示。

                        表11

  羧基组分    胺组分         生成的肽(mM)  Gly-OMe    甲胺  Gly-甲胺  1.1  L-Thr-OMe  L-Thr-甲胺  0.2  L-Ala-OMe  L-Ala-甲胺  0.3

实施例18酶底物特异性(9)

在以β-氨基酸酯作为羧基组分或β-氨基酸作为胺组分的情况下检测肽的合成。将在实施例5用到的2μl等分量的相同酶部分加到100μl的100mM硼酸盐缓冲液(pH9.0)，该缓冲液含如表12所示的100mM的羧基组分、如表12所示的150mM的胺组分和10mM EDTA，并使其在25℃下反应3小时。该反应中的各种肽生成量如表12所示。“tr”指痕量。

                           表12

  羧基组分  胺组分            生成的肽(mM)  Gly-OMe  β-Ala  Gly-β-Ala    2.2  Gly-OMe  β-Phe  Gly-β-Phe    0.4  L-Ala-OMe  β-Ala  Ala-β-Ala    7.7  L-Ala-OMe  β-Phe  Ala-β-Phe    1.4  L-Thr-OMe  β-Ala  Thr-β-Ala    3.2  L-Thr-OMe  β-Phe  Thr-β-Phe    1.4  β-Ala-OMe  L-α-Ala  β-Ala-L-α-Ala    tr  β-Ala-OMe  β-Ala  β-Ala-β-Ala    0.2  β-Ala-OMe  L-Gln  β-Ala-L-Gln    0.6  β-Ala-OMe  L-Ser  β-Ala-L-Ser    3.2

氢氯化盐用于所有的羧基组分

实施例19酶底物特异性(10)

在以L-氨基酸酯作为羧基组分和肽作为胺组分的情况下检测寡肽的合成。将在实施例5用到的2μl等分量的相同酶部分加到100μl的100mM硼酸盐缓冲液(pH9.0)，该缓冲液含如表13所示的100mM的羧基组分、如表13所示的150mM的胺组分和10mM EDTA，并使其在25℃下反应3小时。表13所示该反应中的各种肽生成量。结果，清楚地表明通过以肽作为胺组分，该酶不仅能生成二肽，而且能生成长链肽。

如前述的实施例9至19所示，确证了从Empedobacter brevis菌株FERM BP-8113(保藏单位：独立行政法人产业综合技术研究所，国际专利微生物保藏中心，保藏单位地址：日本茨城县筑波市东1-1-1，中央第6，国际保藏提交日期：2002年7月8日)中获得的该酶具有极广泛的底物特异性。

                                                   表13

  羧基组分 胺组分                       生成的肽(mM)  L-Ala-OMe L-Ala L-Ala-L-Al 28.7 L-Ala-L-Ala L-Ala-L-Ala-L-Ala 57.5 L-Ala-L-Ala-L-Ala L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala 44.5 L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala 34.8 L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala 1.4* L-Ala-L-Gln L-Ala-L-Ala-L-Gln 15.2 Gly-L-Ala L-Ala-Gly-L-Ala 25.9 Gly-Gly L-Ala-Gly-Gly 41.7 L-His-L-Ala L-Ala-L-His-L-Ala 55.9 L-Leu-L-Ala L-Ala-L-Leu-L-Ala 48.3 L-Phe-L-Ala L-Ala-L-Phe-L-Ala 49.7 L-Phe-Gly L-Ala-L-Phe-Gly 43.7  Gly-OMe L-Ala-L-Tyr Gly-L-Ala-L-Tyr 1.7 Gly-L-Gln Gly-Gly-L-Gln 7.2 Gly-L-Tyr-L-Ala Gly-Gly-L-Tyr-L-Ala 44.2  L-Thr-OMe Gly-Gly L-Thr-Gly-Gly 83.0

*：由于L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala的溶解性低，因此在该反应系统中羧基使用10mM的浓度和胺组分使用15mM的浓度。其他条件与实施例中说明的相同。

实施例20与已知酶的催化肽生成能力的比较

将该酶的肽生成能力与已知酶进行比较。EP 278787A1中描述的羧肽酶Y和EP 359399B1中描述的硫醇肽链内切酶(无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和木瓜凝乳蛋白酶)用来作已知酶，并且其以Sigma制造的纯化酶形式得到使用。实施例3中均质纯化的酶用来作本发明的酶源。将这些酶作为蛋白质按表14所示的量加到反应系统中。通过将酶加到含100mM的L-丙氨酸甲酯和200mM的L-谷氨酰胺的100μl硼酸盐缓冲液(pH9.0)中并在25℃反应来实施反应。此外，将溶于含1mM EDTA的10mM乙酸缓冲液(pH5.0)中的酶用作羧肽酶，同时将溶于含2mM EDTA、0.1M KCl和5mM二硫苏糖醇的10mM乙酸缓冲液(pH5.0)中的酶用作硫醇肽链内切酶。表14所示通过这些酶的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生成率的比例。

结果，甚至在缺乏酶时也观察到极端痕量的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的生成，然而与没有加入酶的一批比较，在加入羧肽酶或硫醇肽链内切酶的一批中观察到生产率的轻度提高。相反，在加入该酶的一批中观察到压倒优势的更快比率的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的生成，并且其生成率比羧肽酶Y或硫醇肽链内切酶快约5,000至100,000倍。如以上所述，证实该酶不像现有技术中任何酶而有极快的肽合成速率。此外，与本发明的酶为分子量约75,000二聚体形成对比的是，由于据报道羧肽酶Y的分子量约是61,000，同时据报道硫醇肽链内切酶的分子量约是23,000至36,000，对于本发明的酶，每分子量的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺产率大于实施例中所示的每单位分子量的产率。

                           表14

  酶  加入的酶量  (蛋白质  mg/ml)    L-Ala-L-Gln    产率(mM/min)  每酶单位重量的  L-Ala-L-Gln产  率的比例  无酶  0    0.0006  羧肽酶  0.61    0.0257  0.0191  无花果蛋白酶  2.60    0.0096  0.0017  木瓜蛋白酶  2.30    0.0106  0.0021  菠萝蛋白酶  2.80    0.0062  0.0010  木瓜凝乳蛋白酶  3.60    0.0100  0.0013  本发明的酶  0.02    4.4000  100.0

实施例21使用鞘氨醇杆菌Sphingobacterium sp.微生物细胞生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺

将1L中含5g葡萄糖、5g硫酸铵、1g磷酸二氢钾、3g磷酸氢二钾、0.5g硫酸镁、10g酵母提取物和10g蛋白胨的50ml培养基(pH7.0)转入500mL Sakaguchi烧瓶中，115℃灭菌15分钟后用于培养Sphingobacterium sp.菌株FERM BP-8124(保藏单位：独立行政法人产业综合技术研究所，国际专利微生物保藏中心，保藏单位地址：日本茨城县筑波市东1-1-1，中央第6，国际保藏提交日期：2002年7月22日)。然后向上述培养基中接种一环Sphingobacterium sp.菌株FERM BP-8124(保藏单位：独立行政法人产业综合技术研究所，国际专利微生物保藏中心，国际保藏提交日期：2002年7月22日)在琼脂培养基(琼脂：20g/L，pH7.0)斜面上30℃培养24小时后的培养物。每1升琼脂培养基中含5g葡萄糖、10g酵母提取物、10g蛋白胨和5g NaCl。随即以120转/分钟于30℃下振荡培养20小时。然后将1ml等分量的该培养基肉汤加到前述培养基(50ml/500mlSakaguchi烧瓶)中并于30℃培养18小时。在完成培养之后，从培养肉汤中离心分离微生物细胞并按100g/L湿微生物细胞悬浮在含10mMEDTA的0.1M硼酸盐缓冲液中。然后将0.1ml等分量的含10mM EDTA、200mM L-丙氨酰甲酯氢氯化物和400mM L-谷氨酰胺的100mM硼酸盐缓冲液(pH9.0)加到0.1ml该微生物细胞悬浮液中，待到终体积0.2ml之后，使其在25℃反应120分钟。此时L-丙氨酰胺-L-谷氨酰胺的生成量是62mM。

实施例22源自Sphingobacterium sp.的酶纯化

下述离心分离后的步骤在冰上或4℃进行。按实施例21中相同方式培养Sphingobacterium sp.菌株FERM BP-8124(保藏单位：独立行政法人产业综合技术研究所，国际专利微生物保藏中心，保藏单位地址：日本茨城县筑波市东1-1-1，中央第6，国际保藏提交日期：2002年7月22日)，并通过离心分离(10,000rpm，15分钟)收集微生物细胞。以20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.6)洗涤2g微生物细胞之后，将其悬浮在8ml相同的缓冲液中并进行195W、45分钟的超声波破碎处理。然后离心(10,000rpm，30分钟)超声波破碎液来除去破碎的细胞碎片以得到超声波破碎上清液。将超声波破碎上清液经20mMTris-HCl缓冲液(pH7.6)过夜透析，随即通过超速离心(50,000rpm，30分钟)除去非可溶性部分而得到以上清液形式的可溶性部分。所得到的可溶性部分上样于以Tris-HCl缓冲液(pH7.6)预平衡的Q-琼脂糖凝胶HP柱(Amersham制造)，从非吸附部分中收集活性部分。将活性部分经20mM乙酸盐缓冲液(pH5.0)过夜透析，随即通过离心分离(10,000rpm，30分钟)除去非可溶性部分而得到以上清液形式的透析部分。然后将透析部分上样于以20mM乙酸盐缓冲液(pH5.0)预平衡的SP-琼脂糖凝胶HP柱(Amersham制造)，来获得含有以0至1M NaCl线性浓度梯度的相同缓冲液洗脱出来的酶的活性部分。

实施例23使用酶组分生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺

将实施例22中纯化的10μl等分量的SP-琼脂糖HP组分约27U/ml)加到含111mM L-丙氨酸甲酯氢氯化物、222mM L-谷氨酰胺和11mM EDTA的90μl的111mM硼酸盐缓冲液(pH9.0)中，并在25℃反应120分钟。结果，在添加酶的一批中生成了73mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。相反，在没有添加酶的一批中，很难观察到任何L-Ala-L-Glu的生成，并且在反应120分钟后产量仅仅约是0.07mM。

实施例24酶底物特异性(11)

对来源于Sphingobacterium sp.菌株FERM BP-8124(保藏单位：独立行政法人产业综合技术研究所，国际专利微生物保藏中心，保藏单位地址：日本茨城县筑波市东1-1-1，中央第6，国际保藏提交日期：2002年7月22日)的酶检验底物特异性。将100μl含有表15-1至15-4中所示的100mM终浓度的多种羧基组分和150mM终浓度的多种胺组分的100mM硼酸盐缓冲液(pH9.0)、在实施例22(反应液中添加0.33单位)纯化的SP-琼脂糖HP组分酶和10mM EDTA在25℃反应1.5小时。表15表示反应中各种肽生产量。“+”标记指那些被确认生成却由于缺乏标准而不能得到量化的肽，同时“tr”指痕量。此外，使用L-Tyr-OMe时则反应系统中加入Tween-80至终浓度0.1％。另外，氢氯化物被用于所有的羧基组分。

                          表15-1

  羧基组分  胺组分            生成的肽(mM)  L-Ala-OMe  Gly  L-Ala-Gly    11.1  L-Ala  L-Ala-L-Ala    13.1  L-Val  L-Ala-L-Val    10.9  L-Leu  L-Ala-L-Leu    33.0  L-Ile  L-Ala-L-Ile    24.7  L-Met  L-Ala-L-Met    86.9  L-Pro  L-Ala-L-Pro    1.5  L-Phe  L-Ala-L-Phe    69.5  L-Trp  L-Ala-L-Trp    46.0  L-Thr  L-Ala-L-Thr    47.3  L-Asn  L-Ala-L-Asn    52.3  L-Tyr  L-Ala-L-Tyr    11.1  L-CySH  L-Ala-L-CySH    +  L-Lys  L-Ala-L-Lys    71.2  L-Arg  L-Ala-L-Arg    72.2  L-His  L-Ala-L-His    73.6  L-Asp  L-Ala-L-Asp    2.3  L-Glu  L-Ala-L-Glu    39.1  L-Ser  L-Ala-L-Ser    43.8  D-Ser  L-Ala-D-Ser    3.3  D-Ala-OMe  L-Ser  D-Ala-L-Ser    24.1  D-Ser  D-Ala-D-Ser    5.5

表15-2

羧基组分胺组分    生成的肽(mM) L-Thr-OMe L-Gln  L-Thr-L-Gln    36.1 Gly-OMe  Gly-L-Gln    61.1 L-Ser-OMe  L-Ser-L-Gln    12.9 L-Val-OMe  L-Val-L-Gln    8.2 L-Met-OMe  L-Met-L-Gln    32.6 L-Ile-OMe  L-Ile-L-Gln    6.4 L-Arg-OMe  L-Arg-L-Gln    17.2 L-Tyr-OMe  L-Tyr-L-Gln    0.6 L-Pro-OMe  L-Pro-L-Gln    1.8 L-Phe-OMe  L-Phe-L-Gln    0.8 L-Gln-OMe  L-Gln-L-Gln    0.1 Asp-α-OMe  α-L-Asp-L-Gln    0.05

                      表15-3

羧基组分 胺组分       生成的肽(mM)L-Thr-OMe Gly L-Thr-Gly 0.4 L-Ala L-Thr-L-Ala 5.8 L-Val L-Thr-L-Val 1.3 L-Leu L-Thr-L-Leu 15.3 L-Met L-Thr-L-Met 28.9Gly-OMe L-Arg Gly-L-Arg 17.9 L-Phe Gly-L-Phe 20.0 L-His Gly-L-His 36.2 L-Lys Gly-L-Lys 48.2 L-Ser Gly-L-Ser 53.8L-Ser-OMe L-Ser L-Ser-L-Ser 9.9 L-Met L-Ser-L-Met 7.6 L-Phe L-Ser-L-Phe 4.3L-Val-OMe L-Ser L-Val-L-Ser 31.9 L-Met L-Val-L-Met 6.8 L-Phe L-Val-L-Phe 1.0L-Met-OMe L-Ser L-Met-L-Ser 25.3 L-Met L-Met-L-Met 28.4 L-Phe L-Met-L-Phe 8.9L-Ile-OMe L-Ser L-Ile-L-Ser 17.3 L-Met L-Ile-L-Met 5.1 L-Phe L-Ile-L-Phe 1.5L-Arg-OMe L-Ser L-Arg-L-Ser 2.2 L-Met L-Arg-L-Met tr L-Phe L-Arg-L-Phe tr

                         表15-4

    羧基组分  胺组分          生成的肽(mM)    L-Ala-OMe  Gly胺  L-Ala-Gly胺  15.1  L-Ala胺  L-Ala-L-Ala胺  9.2  L-Phe胺  L-Ala-L-Phe胺  27.1    L-Ala-OMe  甲胺  L-Ala-甲胺  0.6    L-Thr-OMe  L-Thr-甲胺  0.3    Gly-OMe  Gly-甲胺  1.0    L-Ala胺  L-Gln  L-Ala-L-Gln  0.3  L-Met  L-Ala-L-Met  tr  L-His  L-Ala-L-His  tr

实施例25酶底物特异性(12)

对来源于Sphingobacterium sp.菌株FERM BP-8124(保藏单位：独立行政法人产业综合技术研究所，国际专利微生物保藏中心，保藏单位地址：日本茨城县筑波市东1-1-1，中央第6，国际保藏提交日期：2002年7月22日)的酶检验涉及寡肽产物的底物特异性。将100μl等分量的含有表16中所示的100mM终浓度的多种羧基组分和150mM终浓度的多种胺组分的100mM硼酸盐缓冲液(pH9.0)、在实施例22(反应液中添加0.33单位)纯化的SP-琼脂糖HP酶组分和10mM EDTA在25℃反应1.5小时。表16表示反应中各种肽的合成量。此外，氢氯化物被用于所有的羧基组分。

                                        表16

  羧基组分 胺组分                    生成的肽(mM)  L-Ala-OMe L-Ala L-Ala-L-Ala 25.6 L-Ala-L-Ala L-Ala-L-Ala-L-Ala 41.1 L-Ala-L-Ala-L-Ala L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala 30.1 L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala 22.8 Gly-Gly L-Ala-Gly-Gly 33.7 Gly-Ala L-Ala-Gly-L-Ala 35.1 L-His-L Ala L-Ala-L-His-L-Ala 58.0 L-Phe-Gly L-Ala-L-Phe-Gly 34.0 L-Leu-L-Ala L-Ala-L-Leu-L-Ala 40.7 L-Phe-L-Ala L-Ala-L-Phe-L-Ala 24.8  L-Thr-OMe Gly-Gly L-Thr-Gly-Gly 8.4  Gly-OMe L-Ala-L-Tyr Gly-L-Ala-L-Tyr 0.6

实施例26酶底物特异性(13)

以如实施例5中用到的相同酶组分来进一步评定底物特异性。

                            表17

 羧基组分 (mM) 胺组分 (mM) 生成的肽 (mM) 反应时间 (hr) H-Ala-OMe       50mM H-Ala-OMe       40mM H-Ala-OMe       40mM H-Ala-OMe       100mM H-Ala-OMe       20mM H-p-F-Phe-OH    50mM H-Cl-F-Phe-OH   40mM H-p-NO₂-Phe-OH 40mM H-t-Leu-OH      150mM H-2-Nal-OH      20mM H-Ala-p-F-Phe-OH     21.9mM H-Ala-Cl-F-Phe-OH    20.8mM H-Ala-p-NO₂-Phe-OH  27.5mM H-Ala-t-Leu-OH       0.4mM H-Ala-2-Nal-OH       + 3 3 3 3 3 H-p-F-Phe-OMe    100mM H-Cl-F-Phe-OMe   25mM H-p-NO₂-Phe-OMe  40mM H-t-Leu-OMe      100mM H-2-Nal-OMe      40mM H-Aib-OMe        100mM H-N-Me-Ala-OMe   100mM H-Gln-OH        150mM H-Gln-OH        50mM H-Gln-OH        40mM H-Gln-OH        150mM H-Gln-OH        40mM H-Gln-OH        150mM H-Gln-OH        150mM H-p-F-Phe-H-Gln-OH    tr H-Cl-F-Phe-H-Gln-OH   tr H-p-NO₂-Phe-H-Gln-OH 1.1mM H-t-Leu-H-Gln-OH      tr H-2-Nal-H-Gln-OH      tr H-Aib-H-Gln-OH        18.8mM H-N-Me-Ala-H-Gln-OH   0.5mM 3 3 3 3 3 3 3 H-Aib-OMe       100mM H-CHA-OMe       40mM H-N-Me-Ala-OMe  100mM H-Phe-OH        150mM H-Phe-OH        40mM H-Phe-OH        150mM H-Aib-Phe-OH         17.2mM H-CHA-Phe-OH         + H-N-Me-Ala-Phe-OH    tr 3 3 3 H-Ala-OMe       100mM H-Ser(tBu)-OMe  100mM H-Ala-OMe       100mM H-Asp(OtBu)-OMe 100mM H-Ala-OMe       100mM H-Lys(Boc)-OMe  100mM H-Ser(tBu)-OH   150mM H-Gln-OH        150mM H-Asp(OtBu)-OH  150mM H-Gln-OH        150mM H-Lys(Boc)-OH   150mM H-Gln-OH        150mM H-Ala-Ser(tBu)-OH    48.8mM H-Ser(tBu)-Gln-OH    tr H-Ala-Asp(OtBu)-OH   62.6mM H-Asp(OtBu)-Gln-OH   0.9mM H-Ala-Lys(Boc)-OH    51.0mM H-Lys(Boc)-Gln-OH    + 2 2 2 2 2 2

将含有表17中所示终浓度的各个羧基组分和胺组分的100mM硼酸盐缓冲液(pH9.0)组成的100μl反应液、酶(反应液中添加0.1单位)和10mM EDTA在25℃按表17所示的反应时间进行反应。表17表示反应中各种肽生产量。(“+”标记指那些被确认生成却由于缺乏标准而不能得到量化的肽，同时“tr”指痕量)。

缩略语

H-Ala-OMe：L-丙氨酸甲酯氢氯化物

H-p-F-Phe-OMe：p-氟代-L-苯丙氨酸甲酯氢氯化物

H-Cl-F-Phe-OMe：p-氯代-L-苯丙氨酸甲酯氢氯化物

H-p-NO₂-Phe-OMe：p-硝代-L-苯丙氨酸甲酯氢氯化物

H-t-Leu-OMe：叔-L-亮氨酸甲酯氢氯化物

H-2-Nal-OMe：3-(2-萘基)-L-苯丙氨酸甲酯氢氯化物

H-Aib-OMe：α-氨基异丁酸甲酯氢氯化物

H-N-Me-Ala-OMe：N-甲基-L-苯丙氨酸甲酯氢氯化物

H-CHA-OMe：β-环己基-L-苯丙氨酸甲酯氢氯化物

H-Ser(tBu)-OMe：O-特-丁基-L-丝氨酸甲酯氢氯化物

H-Asp(OtBu)-OMe：L-天冬氨酸β-特-丁酯α-甲酯氢氯化物

H-Lys(Boc)-OMe：N-ε-特-丁氧基羰-L-赖氨酸甲酯氢氯化物

H-p-F-Phe-OH：p-氟代-L-苯丙氨酸

H-Cl-F-Phe-OH：p-氯代-L-苯丙氨酸

H-p-NO₂-Phe-OH：p-硝代-L-苯丙氨酸

H-t-Leu-OH：叔-L-亮氨酸

H-2-Nal-OH：3-(2-萘基)-L-丙氨酸

H-Gln-OH：L-谷氨酰胺

H-Phe-OH：L-苯丙氨酸

H-Ser(tBu)-OH：O-叔-丁基-L-丝氨酸

H-Asp(OtBu)-OH：L-天冬氨酸β-特-丁酯

H-Lys(Boc)-OH：N-ε-叔-丁氧基羰-L-赖氨酸

实施例27酶底物特异性(14)

以如实施例26中的相同酶组分来评定涉及寡肽产物的底物特异性。将含有表18中所示终浓度的各个羧基组分和胺组分的100mM硼酸盐缓冲液(pH9.0)组成的100ul等分量的反应液、酶(表18描述加到反应液中的单位数量)和10mM EDTA在25℃反应3小时。表18表示反应中各种寡肽的合成量。(“+”标记指那些被确认生成却由于缺乏标准而不能得到量化的肽，同时“tr”指痕量。)应该指出氢氯化物被用于所有的羧基组分。

                       表18

  羧基组分    胺组分  酶量  (单位)                 生成的肽(mM)  Gly-OMe    L-Phe-L-Met  1.0    Gly-Phe-Met    13.3  L-Ala-OMe    L-Phe-L-Met  0.2    L-Ala-L-Phe-L-Met    +  L-Tyr-OMe    Gly-Gly-L-Phe-L-Met  1.0    L-Tyr-Gly-Gly-L-Phe-L-Met    2.7  L-Ala-OMe    Gly-Gly-L-Phe-L-Met  0.2    L-Ala-Gly-Gly-L-Phe-L-Met    +  Gly-OMe    Gly-L-Phe  0.1    Gly-L-Phe    17.3  L-Ala-OMe    Gly-L-Phe  0.1    L-Ala-Gly-L-Phe    +  D-Ala-OMe    Gly-L-Phe  0.1    D-Ala-Gly-L-Phe    Tr

工业实用性

本发明提供避免诸如引入和消除保护基的复杂合成方法，应用简单、廉价和高产地生产肽的新酶。使用本发明的酶使肽的高效工业化生产成为可能。