肽类天然微生物防腐剂产生菌及应用和防腐剂的制备方法

摘要

肽类天然微生物防腐剂产生菌及应用和防腐剂的制备方法，它涉及一种防腐剂产生菌及该防腐剂产生菌代谢产物的应用和以该防腐剂产生菌代谢产物为原料制备天然微生物防腐剂的方法。本发明的肽类产生菌命名为副干酪乳杆菌HD1.7(Lactobacillus paracaseiHD1.7)，保藏编号为CCTCCM 205015。副干酪乳杆菌HD1.7代谢产物是一种肽类防腐剂，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黄色微球菌、枯草芽孢杆菌等均有抑制作用，对沙门氏菌、巨大芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、志贺氏菌、李斯特菌、变形杆菌等致病菌均有抑制作用；经120℃、60min处理其抑菌活性基本不受影响，说明它具有很强的热稳定性；对多种蛋白酶不敏感，在中性、酸性条件下均有抑菌作用。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种肽类防腐剂产生菌的分离鉴定及该防腐剂产生菌代谢产物的应用和以该防腐剂产生菌的代谢产物为原料制备天然微生物防腐剂的方法。

背景技术：

防腐剂分为化学防腐剂和天然微生物防腐剂两种。目前国内外在食品工业中大量使用的防腐剂仍是人工化学方法合成的，在生产过程中使用的原料、辅料和添加剂本身或其中含有的杂质都可能对人类健康造成伤害；化学防腐剂很多不是自然界自然存在的物质，其对人体健康是否存在潜在的慢性毒性或三致作用还不完全清楚。目前我国批准使用的天然微生物防腐剂只有纳他霉素和Nisin等少数几种，品种很单一，而且微生物天然防腐剂具有异味和杂色等方面的缺陷。

无论是化学防腐剂还是天然防腐剂都存在抑菌谱窄的问题，如目前在市场上占有重要地位的Nisin只对革兰氏阳性菌有抑制作用而对革兰氏阴性菌物无抑制作用。多数防腐剂的抑菌都要求有适用的环境，或是酸性或是中性，如Nisin只在酸性条件下有抑菌作用。许多乳酸菌可代谢产生肽类物质，目前研究清楚的Nisin是乳酸链球菌代谢产生，许多学者分离到了多种产生防腐剂的乳酸菌，但关于产物的性质、分子量大小、产生菌的种类等目前多处于研究之中。

国外研究中，Richter报导该菌用于生产乳酸，乳酸产率达94％；Mercenier，Shaw等报导Lactobacillus paracasei具有很强的免疫刺激能力；Philippe报导Lactobacillus paracasei可用于治疗过敏性鼻炎等疾病，此外还有许多关于该菌具有很好的治疗肠道功能障碍的报导；Mexico的H.MINOR-PEREZ报导了Lactobacillus paracasei可产生细菌素。CN1556851A中公开了一种“新的类干酪乳杆菌菌株”，该菌株用于发酵干酪。CN1406274A中公开了一种“新颖的抗幽门螺杆菌和大肠杆菌157：H7的类干酪乳杆菌类干酪亚种菌株的抗细菌记”，它是从猪的粪便中获得的类干酪乳杆菌菌株，具有抗幽门螺杆菌和大肠杆菌0517的特性。

发明内容：

本发明的目的是提供一种肽类天然微生物防腐剂产生菌及应用和防腐剂的制备方法，该产生菌的代谢产物可以用做防腐剂，肽类防腐剂是采用微生物纯种发酵代谢产生的，产物为肽类，安全性很高。

本发明的肽类防腐剂产生菌已在中国典型培养物保藏中心(地址：中国，武汉，珞珈山，邮政编码：430072)保藏，命名为副干酪乳杆菌HD1.7(Lactobacillus paracasei HD1.7)，保藏编号为CCTCC NO：M205015，保藏日期为2005年2月5日。

本发明的产生菌是采用常规平板划线分离法，使用乳酸菌球和乳酸菌杆两类分离培养基从齐齐哈尔丰源食品有限公司L-乳酸菌腌制酸菜发酵液中分离获得。根据菌体形态和大小确定Lactobacillus paracasei HD1.7为细菌，根据乳酸细菌的定义确定该菌为乳酸菌，根据《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》乳杆菌属的生理生化特征确定该菌为乳杆菌属。根据与该菌生理生化性质相近的乳杆菌的16SrDNA序列设计引物，通过PCR扩增、连接T载体、转化、PCR鉴定、提取质粒、测序、比对，依据其与副干酪乳杆菌中多株DNA序列的高度同源性，鉴定为Lactobacillus paracasei(副干酪乳杆菌)；再依据该菌株的分离来源与新产物特征特性等命名为Lactobacillus paracasei HD1.7株，其生物学特性如下：

A、Lactobacillus paracasei HD1.7为革兰氏阳性菌，杆状，菌落小，呈圆形；在15～45℃条件下培养均生长；异型发酵，可利用多种糖和醇，如甘露糖、乳糖、葡萄糖、果糖、松三糖、纤维二糖、麦芽糖、木糖、水杨苷、七叶苷、半乳糖、蜜二糖等；接触酶试验为阴性，不产生H2S，培养基为pH4.5的条件下生长，不液化明胶，不产吲哚，联苯胺反应阴性，硝酸盐还原试验阴性；

B、Lactobacillus paracasei HD1.7培养进入对数生长期后，开始产生相对分子量为3000～30000的肽类；稳定期产量达到高峰，随后产量有小幅度增加；Lactobacillus paracasei HD1.7产生的肽类物质在菌体内外均可检测到；

C、从培养开始到稳定期之间产生大量乳酸，以后乳酸产量有少量增加；该菌可作为乳酸产生菌，用于乳酸的生产和应用工业；

D、该菌具有调整胃肠道功能、治疗过敏性鼻炎等多种治疗功效。

该菌产生的肽类防腐剂是一种新型的天然微生物防腐剂，此防腐剂天然、安全、抑菌范围更广、适用范围更宽；该菌产生的防腐剂为分子量3000～30000的肽类物质；经发酵条件研究，确定了Lactobacillus paracasei HD1.7的培养条件；经培养基成分优化研究，确定种子培养基和发酵培养基成分。该菌的代谢产物可以生产肽类天然微生物防腐剂。

Lactobacillus paracasei HD1.7产生的肽类防腐剂的制备方法包括下述步骤：a、肽类防腐剂的发酵：将Lactobacillus paracasei HD1.7的保藏斜面划线接种到发酵培养基上，35～40℃倒置培养36～48h后接种到种子发酵液中，在35～40℃下静止培养24～36h，再按1～3％的接种量接于扩大培养发酵液中，在35～40℃下静止培养24～36h，再以1～3％的接种量接于二级扩大培养发酵液中，在35～40℃下静止培养24～36h，继续按1～3％的接种量接种到发酵液中，在35～40℃静止培养30～50h；b、肽类防腐剂的分离：将Lactobacillus paracasei HD1.7菌株发酵液在4500r/min的条件下离心10min，在上清液中加入正丙醇和NaCl至过饱和，进行反复萃取、盐析；然后加入-20℃的丙酮沉淀肽类防腐剂，将沉淀物再溶于HCl中，过夜后加KH₂PO₄沉淀肽类防腐剂，将沉淀物再溶于HCl中；加入丁醇和醋酸，并用氨水调体系的pH值至3.5，上层中加入冷丙酮，将沉淀物离心获得肽类防腐剂干粉。由于制得的样品中含有盐，采用相对分子量截留范围为3500～7000的透析袋透析；再用CM Sephadex C-25凝胶层析，接收并合并活性成分，使用真空冷冻干燥机进行冷冻干燥，制得肽类防腐剂干粉。经Lactobacillus paracasei HD1.7发酵制得的肽类防腐剂经进一步分离纯化后，能够很好地解决微生物天然防腐剂具有异味和杂色等方面的问题。

本发明分离到了一株新的产天然防腐剂的菌株，经生理生化及16SrDNA测序、比对，鉴定为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei HD1.7)。副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei HD1.7)的代谢产物是一种安全、抑菌范围更广、适用范围更宽的肽类天然防腐剂。Lactobacillus paracasei HD1.7产生的肽类防腐剂抑菌谱较宽，既对革兰氏阳性菌有抑菌作用又对革兰氏阴性菌有抑制作用，对多种致病菌也有抑菌作用。Lactobacillus paracaseiHD1.7发酵获得的肽类防腐剂在酸性及中性偏酸性环境中均有抑菌作用。

其具有如下特点：

(1)该代谢产物为肽类物质：代谢产物经蛋白酶处理后，抑菌活性消失，说明产物为蛋白质或肽类物质；代谢产物经有机溶剂萃取粗提后进行电泳，经与Marker比对确定产物中至少有三种肽类物质，分子量在3000～30000之间；

(2)肽类物质的抑菌谱及抑菌能力：小分子肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黄色微球菌、枯草芽孢杆菌等均有抑制作用，即对革兰氏阳性菌和阴性菌都有抑制作用；对沙门氏菌、巨大芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、志贺氏菌、李斯特菌、变形杆菌等致病菌均有抑制作用；

(3)肽类防腐剂的性质：

A、对温度的敏感性：Lactobacillus paracasei HD1.7产生的肽类防腐剂在120℃条件下处理60min，其抑菌活性基本不受影响，说明具有很强的热稳定性；

B、对酶的敏感性：对胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、K-蛋白酶不敏感；

C、在不同pH条件下抑菌效果：在pH为2、3、4、5、6、7条件下均有抑菌活性，pH＝2时抑菌活性最强。

本发明具有如下特点：

1、分离到了一株新的产生天然防腐剂的菌株---Lactobacillus paracaseiHD1.7(副干酪乳杆菌HD1.7)，该菌株不仅能产生广谱、高效肽类防腐剂，还能产生大量乳酸，因此既可用于生产防腐剂又可用于生产乳酸；该菌本身具有保健、治疗功效，可用于调节胃肠道功能、应用于婴幼儿配方奶粉，还可用于治疗过敏性鼻炎等免疫系统疾病；

2、Lactobacillus paracasei HD1.7代谢产生了一种新型、天然的肽类微生物防腐剂，该防腐剂抑菌范围更广，既对革兰氏阳性菌有抑制作用、又对革兰氏阴性菌有抑制作用，对多种致病菌也有抑制作用；适用范围更宽，在酸性及中性偏酸性条件下均有抑菌作用，适用于果蔬、乳、肉、蛋等各种食品的环境；抑菌效果更强，明显强于在国内外市场占有重要地位的同类产品Nisin；丰富了天然微生物防腐剂市场，能够大大促进只允许添加天然防腐剂的绿色食品、保健食品的发展，也进一步保护了人类的健康；

3、本发明研究清楚了Lactobacillus paracasei HD1.7的发酵条件，确定了接种量、培养温度、培养时间、培养方式；经培养基成分研究，确定了不同N源、不同C源、不同金属离子、不同浓度磷源对肽类防腐剂产量及菌体生物量的影响，并优化得到了可以获得高菌体生物量的种子培养基和可以获得肽类防腐剂高产量及低成本发酵培养基，为该项目的投产奠定了基础。

附图说明：

图1为本发明的Lactobacillus paracasei HD1.7的菌落形态图。

具体实施方式：

具体实施方式一：本实施方式是这样分离鉴定副干酪乳杆菌HD1.7的：

①采用常规平板划线分离的方法从L-乳酸菌腌制酸菜发酵液中分离菌株。

②能产生抑菌物质菌株的筛选：各单菌落经平板扩大培养后，接入发酵液37℃培养48h，发酵液3500r/min离心12min，吸取100μl上清液，分别点入枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌等12种指示菌的双层检测平板中，培养12～24h，观察抑菌效果，保留抑菌谱广、抑菌能力强的菌株。

③获得的一株能代谢产生肽类防腐剂的菌株，经生理生化及16SrDNA测序、比对，鉴定为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei HD1.7)。

具体实施方式如下：(1)采用常规的培养特性、生理生化特性鉴定肽类防腐剂产生菌为乳杆菌属；(2)采用16SrDNA寡核苷酸的碱基序列分析的方法分析程序为：根据乳杆菌属中许多种的16SrDNA基因两端的保守序列设计PCR引物，采用溶菌酶-SDS-醋酸钾法提取DNA，通过PCR扩增，电泳，回收PCR产物，将PCR的产物克隆到质粒载体上，经在菌体内扩增后以带有16SrDNA基因的载体作为模板，以M13F或M13R为引物测序，进行16SrDNA序列分析，鉴定肽类防腐剂产生菌为Lactobacillus paracaseiHD1.7(副干酪乳杆菌HD1.7)。

具体实施方式二：本实施方式的肽类天然微生物防腐剂制备方法包括下述步骤：a、肽类防腐剂的发酵：将Lactobacillus paracasei HD1.7的保藏斜面，划线接种到发酵培养基上，35～40℃倒置培养36～48h后接种到种子发酵液中，在35～40℃下静止培养24～36h，再按1～3％的接种量接于扩大培养发酵液中，在35～40℃下静止培养24～36h，再以1～3％的接种量接于二级扩大培养发酵液中，在35～40℃下静止培养24～36h，继续按1～3％的接种量接种到发酵液中，在35～40℃静止培养30～50h；b、肽类防腐剂的分离提纯：将Lactobacillus paracasei HD1.7菌株发酵液在4500r/min的条件下离心10min，在上清液中加入正丙醇和NaCl至过饱和，进行反复萃取、盐析；然后加入-20℃的丙酮沉淀肽类防腐剂，将沉淀物再溶于HCl中，过夜后加KH₂PO₄沉淀肽类防腐剂，将沉淀物再溶于HCl中；加入丁醇和醋酸，并用氨水调体系的pH值至3.5，上层中加入冷丙酮，将沉淀物离心获得肽类防腐剂干粉。

发酵工艺参数为：

(一)培养基：

1、种子发酵液、扩大培养发酵液和二级扩大培养发酵液均由下述成分组成：碳源：1～3g/L、氮源：1～5g/L、金属离子：0.0001～0.001mol/L、吐温：0.1～1.0ml、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾：0.01～0.02g/L。

a、碳源可为葡萄糖、蔗糖、乳糖中的一种或几种，最佳碳源是葡萄糖，浓度为1～3g/L；

b、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、胰胨、聚胨等有机氮源中的一种或几种，尿素、豆浆、(NH₄)₂SO₄、NH₄Cl、NH₄NO₃、(NH₄)₂CO₃、NaNO₃等无机氮源菌中的一种或几种均可作为氮源，最佳氮源是酵母膏和/或牛肉膏，浓度为酵母膏1～5g/L、牛肉膏1～5g/L；

c、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Fe²⁺等中的一种或几种金属离子均有促进该菌生长和促进肽类物质产生的作用，最佳金属离子是Ca²⁺和/或Mn²⁺，浓度为Ca²⁺：0.001～0.01mol/L、Mn²⁺：0.0001～0.001mol/L；

2、发酵培养基由下述成分组成：豆芽：50g～500g/L、番茄：100～300g/L、白菜：100～700g/L、蔗糖：10～30g/L、或葡萄糖：5～20g/L、复合维生素：10～50ug/L、蛋白胨：1～5g/L、或牛肉膏：1～5g/L、或酵母膏：1～5g/L、NaCl：5～30g/L。

(二)培养条件：

a、在有氧、无氧、兼性厌氧、充氮、充CO₂条件下Lactobacillus paracaseiHD1.7均可生长、产生肽类物质；

b、在培养温度15～45℃条件下Lactobacillus paracasei HD1.7均可生长、产生肽类物质；

c、在发酵液pH值4.0～7.5条件下Lactobacillus paracasei HD1.7均可生长、产生肽类物质；

d、在接种量1～10％条件下Lactobacillus paracasei HD1.7均可产生肽类物质；

e、Lactobacillus paracasei HD1.7产肽类防腐剂高峰期为培养20～30小时，生产时为使不完全同步生长的菌都充分产生肽类防腐剂，将发酵时间定为30～50小时；

f、静止培养和震荡培养Lactobacillus paracasei HD1.7均可生长、产生肽类物质。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是，它还包括c步骤，c步骤为肽类防腐剂的纯化：由于制得的样品中含有盐，采用相对分子量截留范围为3500～7000的透析袋透析；再用CM Sephadex C-25凝胶层析，接收并合并活性成分，使用真空冷冻干燥机进行冷冻干燥，制得肽类防腐剂干粉。经Lactobacillus paracasei HD1.7发酵制得的肽类防腐剂经进一步分离纯化后，能够很好地解决微生物天然防腐剂具有异味和杂色等方面的问题。

                             序列表

<110>黑龙江大学

<120>肽类天然微生物防腐剂产生菌及其代谢产物的发酵方法与应用

<160>1

<170>Patent-In 3.1

<210>1

<211>1109

<212>DNA

<213>副干酪乳杆菌HD1.7(Lactobacillus paracasei HD1.7)的16SrDNA序列

<400>1

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