天然食品防腐剂ε-聚赖氨酸的微生物合成及其纯化

摘要

ε-聚赖氨酸是目前天然防腐剂中具有优良防腐性能和巨大商业潜力的微生物类食品防腐剂。ε-聚赖氨酸抑菌谱广，在酸性和微酸性环境中对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌、霉菌均有一定的抑菌效果，尤其对其他天然防腐剂不易抑制的革兰氏阴性的大肠杆菌、沙门氏菌抑菌效果非常好。迄今为止ε-聚赖氨酸的微生物发酵在日本己实现工业化，年产千吨ε-聚赖氨酸的现代化工业装置已建成投产。但ε-聚赖氨酸微生物发酵生产技术在国内还处于实验室阶段，ε-聚赖氨酸生物防腐剂的开发和生产还属空白。因此，开展ε-聚赖氨酸生产技术的研究具有重要意义。 本文以白色链霉菌(Streptomyces albulus)为ε-聚赖氨酸的生产菌株，以提高ε-聚赖氨酸产量，优化ε-聚赖氨酸发酵工艺为主要研究目标，研究内容包括：ε-聚赖氨酸生产菌株的选育；ε-聚赖氨酸发酵条件优化研究；分批发酵中搅拌转速、pH和通风比对ε-聚赖氨酸发酵的影响；从发酵液中分离ε-聚赖氨酸的树脂筛选。 通过各单因素试验并结合正交试验分析，结果确定白色链霉菌最佳产ε-聚赖氨酸条件为葡萄糖5％，硫酸铵1.5％，酵母膏0.7％，初始pH6.8，接种量10％，发酵温度30℃，发酵时间72h，在该条件下所得的发酵液中ε-聚赖氨酸含量达0.60g/L。 通过微波、硫酸二乙酯和紫外诱变，获得一株高产ε-聚赖氨酸白色链霉菌菌株UV-6，产量达0.848g/L，与出发菌株相比，ε-聚赖氨酸产量提高了41.3％，而且发酵性能稳定。 在5L自控式发酵罐上进行了ε-聚赖氨酸(ε-PL)发酵条件的优化研究，主要考察了分批发酵和补料分批发酵过程中不同通气量和不同起始葡萄糖浓度对合成ε-聚赖氨酸影响。实验结果表明，采用多次少量补料分批发酵ε-聚赖氨酸产量明显提高温度30℃，pH4，通气量范围前48h为1.5L/min，发酵后期为3L/min，发酵罐搅拌转速300r/min，分批补料发酵产ε-聚赖氨酸6.24g/L。在实验中发现，ε-聚赖氨酸的生物合成除种子质量外，还受很多其它因素的影响，如接种量、培养基、设备的情况、碳氮源的比例及补料加入时间等，大部分影响又通过菌丝的形态的变化进而影响到ε-聚赖氨酸的合成。由此我们即能通过观察菌丝形态及时发现生产过程中的异常情况，及时采取措施，又能进一步控制菌体的生长，提高ε-聚赖氨酸发酵能力。 通过对ε-聚赖氨酸的静态吸附和动态洗脱实验，对6种离子交换树脂进行了筛选。结果表明：在所选树脂中，HD-2型树脂吸附与洗脱效果最佳，上柱发酵液pH为8，并且流速为4miJmin，洗脱液为0.075mol/L的盐酸。经活性炭脱色、旋转蒸发仪浓缩后得ε-聚赖氨酸粗品，纯度可达81.2％，回收率98.3％。本文所筛选的阳离子交换树脂HD-2价格低廉，对ε-聚赖氨酸的吸附量大、吸附速度快、解吸容易、富集分离。由SDS．PAGE凝胶电泳可知，经离子交换树脂分离纯化的物质为单一物，分子量大约为4680Da。经纸层析验证实验，确定所提物质为赖氨酸的聚合物。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

第一章ε-聚赖氨酸国内外研究进展

1.ε-聚赖氨酸的发现

2.ε-聚赖氨酸的用途

2.1 ε-聚赖氨酸在食品中的应用

2.2.ε-聚赖氨酸在医学方面的应用

2.3.ε-聚赖氨酸在生物科学方面的应用

3.ε-聚赖氨酸的性质

3.1 ε-聚赖氨酸的理化性质

3.2 ε-聚赖氨酸的生物学性质

4.ε-聚赖氨酸的合成

4.1与聚γ-谷氨酸合成的相似性

4.2 ε-PL可能的生物合成路径

5.国内外研究情况

5.1国外

5.2国内

6展望

第二章ε-聚赖氨酸发酵条件优化研究

1.材料与方法

1.1材料

1.2方法

1.3菌体培养

1.4摇瓶培养

2.结果与分析

2.1-聚赖氨酸的定量检测

2.2不同碳源对产ε-聚赖氨酸的影响

2.3不同氮源对产ε-聚赖氨酸的影响

2.4正交实验结果及分析

2.5发酵条件对ε-聚赖氨酸发酵的影响

3.结论

第三章诱变选育ε-聚赖氨酸产生菌突变株

1.材料和方法

1.1材料

1.2方法

2.结果与分析

2.1菌种诱变

2.2菌落形态变异与产量之间的关系

2.3突变菌株的遗传稳定性考察

3.结论

第四章白色链霉菌发酵罐发酵条件研究

1.实验材料与方法

1.1材料

1.2方法：

2.结果与分析

2.1通气量对白色链霉菌发酵产ε-聚赖氨酸的影响

2.2起始葡萄糖浓度对ε-聚赖氨酸产量的影响

2.3恒pH4葡萄糖-氨水分批发酵培养

2.4恒pH葡萄糖-氨水补料分批培养

3.结论

第五章ε-聚赖氨酸的分离纯化

1.材料与方法

1.1材料

1.2方法

2.结果与分析

2.1不同pH条件除杂蛋白的比较

2.4离子交换树脂对ε-聚赖氨酸的静态吸附-解吸试验

2.5 HD-2型树脂的静态吸附曲线

2.6发酵液初始pH值对HD-2吸附性能的影响

2.7不同上样流速对HD-2吸附ε-聚赖氨酸性能的影响

2.8不同浓度盐酸解吸效果测定

2.9洗脱曲线的测定

3.验证实验

3.1 SDS-PAGE电泳鉴定

3.2 ε-聚赖氨酸组成定性分析

4.结论：

参考文献

致谢