提高植物谷氨酸含量的方法以及具有较高谷氨酸含量的植物

摘要

本发明提供了一种方法，该方法通过去除或者降低GGT活性而提高植物和/或种子的谷氨酸含量，本发明还提供了GGT活性缺失或者降低的植物和/或种子，特别是具有同在相同条件培养的相应野生型植物相比谷氨酸含量较高的植物和/或种子。

说明书

                         发明背景

本发明涉及一种提高植物和/或种子的谷氨酸含量的方法、具有较高谷氨酸含量的植物和/或种子、具有较高谷氨酸含量的植物和/或种子在食品生产中的应用以及含有具有较高谷氨酸含量的植物和/或种子的食品。

一般来说，谷氨酸通常存在于蛋白质之中并且被认为是番茄、大豆、赤豆、蚕豆、菜豆、豌豆等所含的鲜味成分，并且还存在于通过对大豆等的发酵而制成的食品之中。在高等植物中，谷氨酸是在氨基酸生物合成的早期合成的，并且谷氨酸是诸如丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸和精氨酸这样的主要氨基酸的氨基基团供体。在叶片中合成的谷氨酰胺和天冬酰胺通过筛管被运入种子，并且被用于在合成谷氨酸之后合成上述的主要氨基酸。基于经严格调控的各功能的作用，转移谷氨酰胺的氨基基团的酶被认为在已区室化(compartmentalized)的组织中具有功能，所述区室化的组织的例子有种皮、胚囊液和子叶。因此，在植物中提高游离的谷氨酸含量并非易事，这是因为谷氨酸是包括蛋白质的合成在内的不同的体内反应的氨基基团供体，并且通过生物合成途径进行代谢，这些途径受到多种多样的复杂调控。特别是，提高游离形式的某种特定的氨基酸的含量是困难的，这是因为氨基酸重要以蛋白质的形式存储。实际上，关于这些事实迄今仅有几篇报道。这些报道包括，例如，烟草和玉米的根中的游离谷氨酸含量通过引入谷氨酸脱氢酶基因而有所提高，以及当编码具有高赖氨酸含量的蛋白质的基因在叶片中过度表达的情况下在大豆种子中积累了游离的赖氨酸。

已知丙氨酸转氨酶为一种与谷氨酸代谢有关的酶。该酶催化将L-丙氨酸的氨基转入α-酮戊二酸的反应以及其逆反应。该酶构成了上述谷氨酸代谢的一部分。同样已知该酶具有催化将氨基从丙氨酸转移至乙醛酸以及从谷氨酸转移至乙醛酸的反应以进行甘氨酸合成的活性(Biochem.J.195：235-239，1981)。另一方面，提出了一种可能，即存在于过氧化物酶体中的丙氨酸转氨酶具有谷氨酸乙醛酸转氨酶活性，也就是使用谷氨酸和乙醛酸作为底物合成α-酮戊二酸和甘氨酸的活性[Noguchi T.和HAYASHI S.，Biochem.J.195-235-239(1981)；Orzechowski等，Acta Biochem.Pol.：447-457(1999)以及Orzechowski等，Acta Physiol.Plant 21：331-334(1999)]。但是，丙氨酸转氨酶和谷氨酸乙醛酸转氨酶活性在提高或者降低植物的谷氨酸含量中的作用仍未被阐明，并且没有关于通过对编码具有丙氨酸转氨酶或者谷氨酸乙醛酸转氨酶活性的蛋白质的基因进行遗传操作而事实上提高植物或者种子中的谷氨酸含量的可能性的报道。

                        发明概述

本发明的目的是提供提高植物和/或种子的谷氨酸含量的方法、具有较高谷氨酸含量的植物和/或种子、具有较高谷氨酸含量的植物和/或种子在食品生产中的应用，以及含有具有较高谷氨酸含量的植物和/或种子的食品。

发明人已经发现，植物和/或种子中的谷氨酸含量可通过抑制谷氨酸乙醛酸转氨酶(GGT)活性而提高。本发明基于该发现而完成。

也就是说，本发明提供了一种通过使GGT活性缺失或者降低而提高植物和/或种子的谷氨酸含量的方法，提供了GGT活性缺失或者降低的植物和/或种子，并且特别提供了谷氨酸含量高于在相同条件下培养的相应的野生型植物的植物和/或种子。

特别地，本发明涉及一种通过使GGT活性缺失或者降低而提高植物和/或种子的谷氨酸含量的方法，其中GGT活性缺失或者降低是通过抑制编码具有GGT活性的蛋白质的基因的功能而实现的，本发明还涉及GGT活性缺失或者降低的植物，特别涉及GGT活性缺失或者降低并且所具有的谷氨酸含量高于在相同条件下培养的相应野生型植物的植物和种子。

                         附图简述

图1显示的是来自拟南芥的丙氨酸转氨酶(AlaAT：同GGT)的氨基酸序列比较。星号所示为所有的氨基酸均相同的位置。

图2显示的是插入标记的位置。(A)AlaAT1基因组结构和插入标记的位置的示意图。方框所示为外显子，线条所示为内含子。(B)野生型(WT)的核苷酸序列和氨基酸序列示于顶部，底部所示为插入了一个T-DNA的核苷酸序列以及8046品系的氨基酸序列。方框所示为由T-DNA的插入所替代的区域。

图3(A)显示用于选择纯合子的引物的位置。(B)显示了纯合子和杂合子的分离率。

图4通过RT-PCR显示了AlaAT1基因在mRNA水平上的表达。WT：野生型，8046：纯合的AlaAT1插入标记的品系。

图5显示插入标记的品系aat-1中的酶活性。Ala+αKG，Glu+Pyr以及Glu+乙醛酸所示分别为催化Ala+αKG→Glu+Pyr、Glu+Pyr→Ala+αKG以及Glu+乙醛酸→Gly+αKG的反应的活性。该活性以偶联以NADH的氧化反应时每分钟每1μg蛋白在340nm下的吸光度(ΔA)变化表示。

图6所示为高等植物中的光呼吸途径的示意图。箭头显示了谷氨酸乙醛酸转氨酶催化的反应。

图7显示在含1％的蔗糖的PNS培养基上培养了两周的幼苗的氨基酸含量。A：相对于鲜重的氨基酸含量，B：同总氨基酸的比例。对照：野生型植物，aat1-1：8046品系，插入了AlaAT1标记的植物。

图8显示在aat1-1种子之中的氨基酸含量(nmol/mg FW)

图9显示在aat1-1种子中的相对氨基酸含量(％)。

                    优选实施方案描述

本发明的目的在于提高植物和/或种子中的谷氨酸含量。该目的可通过消除或者降低GGT活性而实现。

在本发明的一个实施方案中，一种编码GGT的基因的功能被抑制。本文所使用的术语“一种编码谷氨酸乙醛酸转氨酶(或GGT)的基因的功能”指的是基因表达谷氨酸乙醛酸转氨酶的功能，该被表达的谷氨酸乙醛酸转氨酶具有野生型谷氨酸乙醛酸转氨酶的活性。相应地，“编码谷氨酸乙醛酸转氨酶(或GGT)的基因的功能被抑制”的含义涉及，例如，该基因本身被破坏的情况、该基因的表达在转录或者翻译水平被抑制的情况，以及该基因被修饰以至于所表达的蛋白质不具有野生型GGT的活性的情况。

通过抑制编码GGT的基因的功能而使GGT活性缺失或降低可通过，例如，破坏GGT基因或者以用于抑制表达的遗传构建体转化该植物而获得。

根据上文所述可通过使GGT活性缺失或者降低而达到本发明的目的。该酶活性在转录水平、翻译水平和蛋白质水平均可被抑制。例如，活性降低的植物可通过使该植物适应不同的生长条件并且测定GGT活性而加以筛选，GGT活性的测定使用下文将要描述的方法进行。还可以通过对该植物基因组中的编码GGT的基因进行修饰或者破坏而除去或者降低该活性。还可以通过反义或者共抑制方法除去或者降低GGT活性。特别是在本发明中，从性状稳定性出发，破坏GGT基因是优选的。这样的基因破坏可通过转座子的插入、T-DNA的插入或者诱变而获得，所述诱变通过用诸如EMS这样的诱变剂处理而进行。通过转座子或者T-DNA的插入或者以诱变剂进行处理而进行基因破坏的常用技术为本领域技术人员所熟知。在可获得基因受破坏的植物的制备库的情况下，可通过对该库进行筛选以查找含有受破坏的GGT基因的植物，从而容易地获得所需的被转化植物。

根据同在相同条件下生长的野生型植物进行的比较，无论在总蛋白、鲜重或者叶片中，本发明的植物在发育的某些阶段具有至多约80％的GGT活性，优选的情况下至多约50％，更为优选的情况下至多30％的GGT活性。

本发明中，GGT活性的去除或者降低在优选的情况下发生在过氧化物酶体中，特别是在光合组织的过氧化物酶体中。该光合组织可为任何在普通培养条件下进行光合的组织，例如叶片、茎或者长角果(silique)。

因此，根据同在相同条件下生长的野生型植物进行的比较，通过本发明的方法而具有提高的谷氨酸含量的植物具有至多约80％的GGT活性，优选的情况下至多50％，更为优选的情况下至多30％的GGT活性，该GTT活性为总蛋白中的GGT活性、新鲜的组织或者细胞器的GGT活性或者叶片的组织或者细胞器中的GGT活性，该总蛋白在优选的情况下提取自光合组织，更为优选的情况下提取自光合组织的过氧化物酶体。

本文所使用的术语“谷氨酸乙醛酸转氨酶”指的是一种蛋白质，该蛋白质具有谷氨酸乙醛酸转氨酶活性，该活性亦可简称为“GGT”。术语“编码谷氨酸乙醛酸转氨酶的基因”在本文中涉及编码具有谷氨酸乙醛酸转氨酶活性的蛋白质的所有核酸片段。

在本发明中被用作为目标的GGT基因还可以获自植物。例如，GGT基因的DNA碱基序列信息可通过使用“丙氨酸转氨酶”作为关键词从数据库中搜索而获得。根据该序列信息，全长cDNA可通过RT-PCR、5’-RACE以及3’-RACE而获得。还有可能根据已知的序列信息通过以适当的探针进行的杂交而筛选cDNA文库。用于筛选的探针可根据GGT的氨基酸或者DNA序列进行制备。

在本发明中，优选的情况下该目的GGT定位于过氧化物酶体中，特别是上文所描述的光合组织中的过氧化物酶体。GGT在过氧化物酶体中的定位可从定位于过氧化物酶体中的蛋白质的特征性N-末端序列或者C-末端序列推断出。在保持定位于过氧化物酶体、在该细胞中表达GGT并且测定该GGT的情况下，还有可能通过将GGT基因同诸如GFP或者GUS这样的报告基因进行融合而证实该定位。在另一种方法中，该定位可通过以特异性抗体检测被标记的GGT的表达而证实。

在可获得基因受破坏的植物库或类似的情况下，本发明的植物可通过对该库中的GGT基因受破坏的植物进行筛选而获得。通过引物和探针的适当组合，还有可能确认GGT基因在这些植物中是如何被破坏的。这些筛选方法和分析方法在本领域中为人所熟知，可以参考，例如，“植物基因组研究方案”(秀润出版社)。即使没有这样的库，通过使用基因工程方法，例如转座子以及T-DNA，可以获得这样的基因受破坏的植物，特别是具有受破坏的GGT基因的植物或者由于其它的原因而在GGT活性上有所缺陷或者抑制的植物。

可用于产生本发明的实施方案中的基因受破坏植物的核酸构建体可通过本领域所熟知的方法而进行制备。在诸如Sambrook等人的Molecular cloning-Laboratory manual第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press这样的文献中可以找到分子生物学的方法，包括，设计核酸构建体、分离这些构建体以及测定其序列的方法。为制备可用于本发明的核酸构建体，在某些情况下可能需要通过PCR进行的基因扩增。关于PCR方法，可以参照，例如，F.M.Ausubel等，(eds)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.(1994)。

植物中的基因破坏可通过本领域中常用的方法进行。例如，基因组GGT基因在优选的情况下可以使用转座子或者T-DNA而作为目标被破坏。适于该方法的基因构建体的设计很容易被本领域的技术人员所理解。以转座子或者T-DNA进行基因破坏的一般技术见Plantmolecular biology manual 2^nd，S.B.Gelvin和R.A.Schilper的描述。

用于在上述的实施方案中引入该核酸构建体的方法并无特别的限定。本领域的技术人员所知的任何用于将基因引入植物细胞或者植物体中的方法均可根据宿主而被选用。例如，可以使用农杆菌所介导的基因引入方法、电穿孔方法或者颗粒枪。当使用农杆菌时，待引入的序列在优选的情况下插入于T-DNA边界序列的左侧和右侧。由此而基于T-DNA而进行的转化载体的适当设计和构建在本领域中是为人所熟知的。进一步，以含有这样的核酸构建体的农杆菌对特定植物进行的感染所需的条件在本领域中也是为人所熟知的。对于这样的工艺和条件，可以参照秀润出版社(1996)出版的“模型植物实验方案：水稻和拟南芥”的细胞技术分册。

尽管进行基因操作的植物的种类并无特别限制，但优选容易培养以及转化并且其再生系统已被建立的植物种类。除具有上述的特征化性状的植物外，本发明中还有一些植物种类较为优选，对于这些植物种类已经建立了大规模的培养工艺并且作为食品具有高利用价值。这些植物，除作为模式植物的拟南芥之外，还包括水稻作物、菠菜、甘蓝、莴苣、沙拉蔬菜、芹菜、黄瓜、番茄、蚕豆、大豆、赤豆、菜豆和豌豆。

随后，将这些转化子从由此而获得的经遗传工程处理的植物细胞等等中筛选出来。筛选可基于存在于用于该转化的核酸构建体的标记基因的表达而进行。例如，当该标记基因为抗药基因时，可通过在含有适当浓度的抗生素或者除草剂的培养基上培养或者生长植物细胞而进行该选择。当该标记基因为β-葡萄糖苷酸酶基因或者荧光素酶基因时，可通过对该活性进行筛选而选择转化子。植物体可从由此而鉴定的转化子中再生，该转化子的例子如，原生质体、愈伤组织和外植体。对各个植物可以使用本领域的技术人员所知的方法进行再生。由此而获得的植物可通过普通方法进行培养，或者，换句话说，在与用于未转化植物相同的条件下培养或者在适于各个转化子的条件下培养。为对含有本发明的核酸构建体的被转化植物进行鉴定，除上述的标记基因选择方法外还可以使用多种不同的分子生物学方法。特别地，本发明的具有降低的GGT活性的植物在优选的情况下保持免受强光以保护其免于生长抑制。

为检测该目的基因的受破坏或者重组DNA插入物的存在与否及其结构，可以使用Southern杂交、PCR、Northern印迹或者RT-PCR。

随后可测定由此而获得的转化植物的GGT蛋白量、GGT活性以及GGT的mRNA量。例如，可通过Western印迹法等来测定该蛋白质的量，通过Northern印迹法、定量RT-PCR方法等等可测定mRNA的量。GGT活性可通过普通方法(Plant Physiol.99：1520-1525)进行测定。例如，可通过以液氮将植物的光合组织，例如叶片，进行冷冻干燥、研磨该冷冻组织、将所获得的粉末悬浮于适当的提取缓冲液中，例如含有100mM Tris-HCl(pH7.3)或者10mM DTT的缓冲液，对所获得的悬浮物进行超滤并且将所获得的样品用于上述的测定方法，以此来测定光合组织中的GGT活性(Plant Physiol.99：1520-1525)。通过普通方法对过氧化物酶体进行分离(Plant Physiol.43：705-713，J.Biol.Chem.243：5179-5184，Plant Physiol.49：249-251等等)并且通过上述的方法测定GGT活性可测定定位于过氧化物酶体的GGT活性。这些方法在本领域为人所熟知。

可对所产生的植物进行谷氨酸含量的估定。谷氨酸含量的测定可通过，例如，研磨该植物体或其部分、从中获取提取物并且以普通的氨基酸分析仪检测该提取物而进行。例如，可以通过向样品(植物体或其一部分)中加入500μl的80％乙醇、以细胞搅拌机(blender)MM300(QIAGEN)进行研磨并且在80℃下处理所获得的产物10分钟，从而提取出氨基酸。对该产物进行离心并且进行真空旋转。将所剩的样品溶解于0.02N HCl之中以获得分析样品。将该样品通过0.22μm的滤器以除去杂质。在氨基酸分析中，氨基酸含量可以使用氨基酸分析仪LS-8800(HITACHI)进行测定。可根据谷氨酸在总氨基酸含量中的增加速率、相对于鲜重的谷氨酸含量或者进行测定相对于特定组织的谷氨酸含量，并且同在相同条件下生长的野生型植物进行比较而测定植物体的谷氨酸含量，该特定组织在优选的情况下为光合组织，例如叶片，植物体的谷氨酸可根据情况进行统计学处理。当在上述至少一个指标中谷氨酸含量的提高在统计上具有显著性时(例如，当该提高在5％(p＜0.05)的显著水平上在统计上具有显著性时)，可以认为谷氨酸含量同在相同条件下生长的野生型植物进行比较而显著地提高了。

通过本发明的方法，植物体的谷氨酸含量(谷氨酸相对于总氨基酸含量的相对含量)提高至相当于在相同条件下生长的野生型植物的该含量的至少约1.2倍，通常情况下约1.2到2.5倍；相对于鲜重的谷氨酸含量提高至约至少1.2倍，通常情况下约1.5到3倍。

在对具有提高的谷氨酸含量的转化植物进行鉴定之后，可以检测其特征在遗传上是否可稳定保持。为此目的，可在普通光照条件下培养该植物，从该植物中收取种子并且对其后代的性状和分离进行分析。当该植物在普通光照条件下的生长抑制很强烈时，可在弱光条件或者高CO₂浓度和普通光照条件下生长该植物，该弱光条件的例子如，约30μmol m^-2 s^-1，该CO₂浓度条件的例子如，0.7％的CO₂，随后可分析其性状。所引入的核酸构建体在后代中存在与否，其在后代中的位置及其表达可以以与原代转化子相同的方式进行分析。

关于产生自整合入基因组的核酸构建体的序列或者受破坏的基因，由此而具有提高的谷氨酸含量的转化子可为杂合子或者纯合子。如果必要，杂合子或者纯合子均可通过诸如杂交这样的方法获得。来自整合入基因组的核酸构建体的序列根据孟德尔定律在子代中进行分离。因此，为达到本发明的目的，从性状稳定的观点出发使用纯合子植物是较为优选的。尽管本发明的植物可在普通培养条件下生长，但将它们生长在尽可能强的光照下较为理想，只要不发生生长抑制就行。

在本发明的种子的产生过程中，对纯合植物进行培养并且收集其种子是特别优选的。该纯合植物可通过重复传代的培养直至所需的表现型不出现分离而进行选择，或者，换句话说，可通过对选择一个在所有子代中均表现出所需的表型的种系而进行该纯合植物的选择。这些纯合子可通过PCR或者Southern分析进行选择。当本发明的目的通过插入转座子或者T-DNA而达到时，这样的分子生物学工艺是可用的。

本发明的种子可通过在普通的条件下培养一种植物并且收集其种子而获得，该植物中的GGT活性缺乏或者降低，或者在特定情况下，该植物被确认具有提高的谷氨酸含量，该植物通过上文述及的方法获得。例如，一个对于破坏的GGT基因是纯合的植物在普通的条件下进行培养并且收集其种子。在优选的情况下，本发明的植物在约为30到70μmol^-2s^-1的光照条件下进行培养并且对其种子进行收集以获得本发明的种子。通过使用上述方法测定该植物中的谷氨酸含量，本发明的种子可被确认所具有谷氨酸含量高于对应的在相同条件下进行培养的野生型植物的种子。

本发明的植物和种子可在与其对应的野生型植物相同的方式下被用作为食品以及食品材料。因此，本发明的植物和种子可直接被用作为食品或者在经普通方法的烹调或者加工下作为食品。特别优选的食品是那些需要通过谷氨酸而具有改善的口味的食品，例如例如酱油、豆面酱(经发酵的大豆调味品)、调味番茄酱、水豆豉(发酵的大豆)、汤和快餐。

以下的实施例将进一步展示用于获得本发明的植物的方法以及所获得的植物和种子的特征，该方法通过对拟南芥基因破坏植物文库进行筛选而获得本发明的植物。对于本领域的技术人员，本发明的植物、其种子以及本发明的方法很明显并不限定于该特定的植物拟南芥。

                      实施例

实施例1拟南芥的GGT缺陷品系的获得

(1)植物培养

含有1％(w/v)的蔗糖、0.05％(w/v)的MES[2-(N-吗啉代)乙磺酸]以及0.8％(w/v)琼脂的PNS(Mol.Gen.Genet.204：430-430)或者MS(Physiol Plant 15：473-479)无机盐被用作为平板的基底培养基。在于矿物纤维之上进行的培养中，仅仅PNS无机盐被用作为营养源。(2)用于筛选GGT缺陷型品系的引物的制备

根据拟南芥的丙氨酸转氨酶(AlaAT)基因的信息而获得了AlaAT基因。AlaAT基因亦称为GGT基因。

从发表于国际互联网上的数据对AlaAT序列的拷贝数进行估计并且制备引物。根据使用“丙氨酸转氨酶”以及“拟南芥”作为关键词而搜索得到的数据发现，至少4个拷贝的基因被认为是存在于该基因组中的丙氨酸转氨酶。各个基因的Genbank登录号为AC005292(F26F24.16)、AC011663(F5A18.24)、AC016529(T10D10.20)以及AC026479(T13M22.3)。这些基因分别被命名为AlaAT1、2、3和4。所推断出的氨基酸序列的比较示于图1。根据EST的信息，AlaAT1的表达量在四个拷贝中最高，因此，该基因破坏的效果被预期为最明显。用于筛选基因破坏品系的PCR引物根据AlaAT1的序列(表1)进行制备。这些引物根据Kazusa DNA实验室所提供的系统而进行设计。

表1用于筛选基因破坏品系的PCR引物

名称    序列^*AAT1U CTCTAGAACCGAACGTGACTCTCCAG  (SEQ ID NO：2)AAT1L CCATGATCTCCGGCATCTCATCTTC(SEQ ID NO：3)AAT1L2 ATCACAAATCAGGCACAAGGTTAGAC(SEQ ID NO：4)AATRTU GGAGGGAAGAAGTGAGCTAGGGATTG(SEQ ID NO：5)AATRTL CGCTCATCCTGGTATAT GTTCTGCTG(SEQ ID NO：6)00 L ATAACGCTGCGGACATCTAC(SEQ ID NO：7)02 L TTAGACAAGTATCTTTCGGATGTG(SEQ ID NO：8)03 L AACGCTGCGGACATCTACATTTTTG(SEQ ID NO：9)04 L GTGGGTTAATTAAGAATTCAGTACATTAAA(SEQ ID NO：10)05 L AAGAAAATGCCGATACTTCATTGGC(SEQ ID NO：11)06 L AAGAAAATGCCGATACTTCATTGGC(SEQ ID NO：12)00 R TAGATCCGAAACTATCAGTG(SEQ ID NO：13)02 R ACGTGACTCCCTTTAATTCTCCGCTC(SEQ ID NO：14)03 R CCTAACTTTTGGTGTGATGATGCTG(SEQ ID NO：15)04 R TTCCCTAAATAATTCTCCGCTCATGATC(SEQ ID NO：16)05 R TTCCCTTAATTCTCCGCTCATGATC(SEQ ID NO：17)06 R TTCCCTTAATTCTCCGCTCATGATC(SEQ ID NO：18)EFU GTTTCACATCAACATTGTGGTCATTGG(SEQ ID NO：19)EFL GAGTACTTGGGGGTAGTGGCATCC(SEQ ID NO：20)

^*这些序列根据传统符号以5’→3’的方向显示。

(3)AlaAT破坏品系的分离

AlaAT在基因破坏的拟南芥库中的筛选根据Kazusa DNA实验室所提供的系统而进行。筛选通过在“植物细胞工程系列14”“植物基因组研究方案”(秀润出版社)2-4-c中描述的方法进行。

在初始筛选中，(AAT1U/AAT1L)被用作为基因侧翼的引物，并且(00L/02L/03L/04L/05L/06L/00R/02R/03R/04R/05R/06R)被分别用作为相应合并液(pool)的标记引物。所使用的标记引物和对应的组的关系见表2。

表2.标记引物和合并液之间的联系

  DNA合并液  合并液的数量  标记引物  P0009～  P0020  12  00R  00L  P0023～  P0040  18  P0202～  P0204  3  02R  02L  P0301～  P0302  2  03R  03L  P0401～  P0403  3  04R  04L  P0501～  P0508  8  05R  05L  P0601～  P0608  8  06R  06L  总计  54

所使用的聚合酶为EX-taq(TAKARA)。20μl的反应溶液中含有大约38.4ng(约100pg×384)的模板DNA、10pmol的标记引物、10pmol的基因引物、2μl的10×缓冲液、5nmol的dNTP和0.5μ的Ex-taq。PCR循环包括94℃进行45秒、52℃进行45秒以及72℃进行3分钟。在进行35个循环的重复之后，通过电泳以1％的琼脂糖凝胶对10μl的PCR产物进行分离。在EtBr染色后观察到了扩增的DNA片段。通过浸入变性溶液(1.5M NaCl、0.5M NaOH)20分钟而使该凝胶变性。随后将该凝胶浸入中和溶液[0.5M Tris-HCl(pH8.0)、1.5M NaCl]20分钟。在使用20×SSC(3M NaCl、0.3M柠檬酸钠)对membrane-Hybond N+(Amersham Pharmacia Biotech)进行印迹之后，DNA通过UV交联而被固定于该膜上。使用AlkPhos-Direct DNA检测试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech)根据该试剂盒所附的方案进行杂交和检测。杂交温度为65℃。PCR使用AAT1U/AAT1L作为探针并且使用基因组DNA作为模板。经扩增的片段使用GFX PCR DNA和Gel Band purification试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech)进行纯化。

在初始筛选之中，提取自384个独立的插入标记的品系的基因组DNA混合物被用作为一个组。54个合并液(384×54＝20736的品系)被用于该PCR。扩增产物被用于Southern分析以证实是否所期望的产物被扩增。在初始筛选中具有阳性结果的合并液P0035被用于次级筛选。用于次级筛选的PCR所用的引物组合为AAT1U/00L以及AAT1L/00L，该组合在初始筛选中给出了阳性结果。通过次级筛选，很明显AlaAT1标记被插入于一个品系，品系8046。

(4)标记插入物定位的确定

提取自所确定的标记插入品系的DNA被用作为模板。使用两个引物组合(AAT1U/00L，AAT1L/00L)进行PCR。对被扩增的片段进行克隆以获得pGEM T-easy载体(Promega)。为进行测序而使用了ABI PRISMTM 337 DNA测序仪(PERKIN ELMER)。

据发现该标记被插入于第六外显子中并具有16bp的去除，并且176-GGTLV-180由于该标记的插入而被替换为176-AIOL(末端)-180。所测定的标记插入物的位置以及邻近序列见图2。

实施例2 GGT缺陷品系特征的分析

(1)纯合子的选择

已经证实具有标记插入的品系的T2种子被置于含有10mg/l潮霉素的MS培养基上。三周之后，将所获得的幼苗移植入矿物纤维之中，并且从约5mm×5mm的玫瑰花结(rosette)叶样品中提取DNA。该提取根据Li法(Plant J.8：457-463)而进行。为进行纯合子的鉴定，以侧列于该标记的引物(AAT1U/AAT1L2)进行PCR。进行了30个循环的PCR，其中变性在94℃下进行30秒，退火在57℃下进行30秒并且在72℃下进行60秒的延伸。作为对照，野生型基因组DNA被用作为模板。通过电泳在1％的琼脂糖凝胶上分离一份PCR产物。在总共35个品系中有11个品系发现了纯合子(图3)。

(2)GGT表达的检测。

通过使用其后代而对所获得的纯合品系进行PR-PCR，从而对基因破坏的存在加以证实。该纯合子的种子被补充以含有10mg/l的潮霉素的MS培养基，并且已经证实所有的个体均为抗性。在发芽两周之后使用ISOGEN(Nippon gene)从幼苗中提取总RNA。在以DNAase进行处理并随后使用superscript II(GIBCO)以寡聚dT引物进行反转录之后，使用侧列于该标记的引物(AAT1 RTU/AT1RTL)以所合成的单链cDNA作为模板进行了PCR。PCR进行了28个循环，其中变性在94℃下进行30秒，退火在57℃下进行30秒并且在72℃下进行60秒的延伸。作为对照，使用了EF-1α(EFU/EFL)。通过电泳在1％的琼脂糖凝胶上分离一份PCR产物。在插入了标记的品系(图4)中未发现AlaAT1的全长mRNA。根据这些结果，该插入了标记的品系被命名为“aat-1”并且被用于随后的分析。

(3)光照强度对于插入了标记的品系aat-1的影响：

插入了标记的品系aat-1的种子被种植于土壤之中，并且在普通光照强度条件(约70μmol m^-2 s^-1)下进行培养，光期为16个小时，暗期为8个小时。

收取在上述条件下所获得的20个幼苗的地下部分，测定其重量，重复三次。计算其平均值。在弱光条件下(约30μmol m^-2 s^-1)未发现有明显的生长差异，尽管在普通光照强度条件下生长被严重地抑制了(表3)。这些结果提示，aat-1被光抑制所破坏，这是由不完全的光呼吸所导致的。

            表3光强度的影响

                    相对重量

  光强度(μmol m^-2 s^-1)    对照    aat1-1    30    100    1    1    0.89    0.34

(4)插入了标记的品系aat-1的酶活性

为测定酶活性，将该蛋白幼苗中提取出来，该幼苗在PNS培养基上发芽之后在70μmol m^-2 s^-1的光照条件下生长了2周。在液氮中冷冻该植物(鲜重：约200mg)并且随后使用研钵和捣杵将其组织破碎。向其中加入1ml的提取溶液[100mM Tris-HCl(pH7.3)，10mMDTT]，并将所获得的混合物在15,000rpm下离心10分钟以除去不溶的物质。将该过程重复三次。使用滤器UFV5BGCOO(Millipore)进行超滤而进行脱盐处理。通过在1,000rpm下进行约45分钟的离心而将0.5ml的提取物浓缩直至十倍浓度。在使用提取物将该浓缩物稀释十倍之后，相同的过程被重复三次。使用蛋白质分析试剂盒(Bio-Rad)测定该蛋白质浓度。加入含有10％的甘油的提取物以获得终浓度为2mg每ml的提取物，从而获得了粗提取物，该粗提取物被用于随后的酶活性测定。

反应Ala(丙氨酸)+αKG(α酮戊二酸)→Glu(谷氨酸)+Pyr(丙酮酸)的活性根据340nm下的OD变化而进行测定，该OD变化通过同该反应所偶联的NADH被LDH(ECl.1.1.27)的氧化反应而产生。为进行反应，10mg的粗提取物被用于600μl的反应溶液[100mM Tris-HCl(pH7.3)，100mM Ala，0.11mM吡哆醛5-磷酸，0.11mM NADH，15mM αKG，80mM NH₄Cl，1200U/l LDH(SIGMALL2375)]。

Glu+Pyr→Ala+αKG以及Glu+乙醛酸→甘氨酸(Gly)+αKG的反应性根据340nm下的OD变化而进行测定，该OD变化通过同该反应所偶联的NADH被NAD⁺-GDH(EC1.4.1.3)的氧化反应而产生。为进行反应，10mg的粗提取物被用于600μl的反应溶液[100mMTris-HCl(pH7.3)，100mM Glu，0.11mM吡哆醛5-磷酸，0.11mMNADH，15mM αKG，1200U/l GDH(G2501)]。当乙醛酸被用作为氨基受体时，除Pyr被代之以乙醛酸之外，使用相同的反应溶液。

各反应的活性见图5。已发现在所有这三个被认为是AlaAT所催化的反应之中，aat-1之中的反应性有所降低。还发现，催化将氨基基团从谷氨酸转至乙醛酸的反应的活性，即，GGT活性，在aat1-1中明显降低。

因此，从强光照条件下的生长抑制和酶活性测定的结果综合来看，可以发现在生理条件下AlaAT1深入参予了通过羟乙酸途径从乙醛酸合成甘氨酸的反应，该途径是实际上的光呼吸途径(参照图6之中的箭头)。

(5)插入了标记的aat-1的氨基酸分析

为测定氨基酸含量而从幼苗之中对氨基酸进行了提取，这些幼苗通过在PNS培养基上发芽之后在70μmol m^-2 s^-1的光照条件下生长2周而获得。在液氮中冷冻该植株(鲜重：约40mg)并随后在-80℃下保存。为解冻该样品，加入了500μl 80％的乙醇。随后使用细胞破碎机MM300(QIAGEN)破碎该组织，并随即在80℃下处理10分钟以提取氨基酸。在15,000rpm下进行10分钟的离心之后弃去上清。在80℃下向所获得沉淀中加入500μl 80％的乙醇，并且对该混合物进行彻底地搅拌，随后在80℃下进一步处理10分钟。在15,000rpm下进行10分钟的离心之后，收取上清作为氨基酸提取物。在负压下旋转1ml的氨基酸提取物以彻底除去乙醇和水。将300μl的0.02N HCl加至存留的样品中。经过涡旋混和和随后进行的离心后收取上清。通过0.22μm的滤器而除去杂质以获得用于分析的样品。使用一台氨基酸分析仪LS-8800(HITACHI)。主要氨基酸的含量(nmol/mg MW)和其与氨基酸总量相比的相对含量见图7。分析的结果显示，谷氨酸的累积量在aat1-1中有所提高(图7)。

<序列表free text>

SEQ ID NO：2到NO：20  PCR引物

 实施例3对插入了标记的品系aat-1的种子中的氨基酸含量的测定

(1)aat1-1植物的培养

插入了标记的品系aat-1和对照植物Co1-0的种子被种植于PNS固体培养基中并且在该光照条件下(70μmol m^-2 s^-1)进行三周的培养，其光期为16小时，暗期为8小时，并随后移植入矿物纤维之中。植物体Co1-1所植入的矿物纤维以及植株aat1-1所植入的矿物纤维被置于相同的盘中。每周给入一次PNS以充肥料。收集种子，并且在干燥器中进行完全干燥之后对氨基酸进行分析。随后进行了氨基酸的分析。

(2)在aat1-1的种子中的氨基酸分析

将约合10mg的干种子以及500μl 80％乙醇转入一个2ml的试管中，并且使用细胞破碎机MM300(QIAGEN)破碎这些种子，并随即在80℃下处理10分钟以提取氨基酸。在15,000rpm下进行10分钟的离心之后除去上清。在80℃下向所获得沉淀中加入500μl 80％的乙醇，并且对该混合物进行彻底地搅拌，随后在80℃下进一步处理10分钟。在15,000rpm下进行10分钟的离心之后，收取上清作为氨基酸提取物。

负压下旋转一毫升的氨基酸提取物以彻底除去乙醇和水。向由此而被干燥成固体的该样品中加入五百微升的无菌水以及500μl的乙醚，并对其进行彻底地搅拌。在15,000rpm下离心5分钟之后，除去上清(醚相)。在负压下对水相进行离心以彻底除水。将300μl的0.02NHCl加至被干燥的样品中。经过涡旋混和和随后进行的离心后收取上清。通过0.22μm的滤器而除去杂质以获得用于分析的样品。使用一台氨基酸分析仪LS-8800(HITACHI)。主要氨基酸的含量(nmol/mgMW)和其与氨基酸总量相比的相对含量分别见图8和图9。

分析的结果表明这些种子中的谷氨酸含量有所提高。

根据本发明，植物和/或其种子的谷氨酸含量可被提高，并且由此可以获得具有较高的谷氨酸含量的植物和/或其种子。因此，根据本发明，有可能提高食用植物体或者其完整果实的谷氨酸含量，例如菠菜、甘蓝、莴苣和番茄，并且可能提高植物的食用种子的谷氨酸含量，例如大豆、赤豆、蚕豆、菜豆和豌豆。其结果，这些植物和/或种子的口感可被改善。进一步，从这些植物体或者种子制备的食品的口感可被改善。

               序列表

<110>味之素公司

<110>Kazusa DNA Research Institute

<120>提高植物谷氨酸含量的方法以及具有较高谷氨酸含量的植物

<130>Y1J0188

<140>

<141>

<150>JP 2001-208238

<151>2001-07-09

<160>20

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>481

<212>PRT

<213>拟南芥

<400>1

Met Ala Leu Lys Ala Leu Asp Tyr Asp Thr Leu Asn Glu Asn Val Lys

  1               5                  10                  15

Lys Cys Gln Tyr Ala Val Arg Gly Glu Leu Tyr Leu Arg Ala Ser Glu

             20                  25                  30

Leu Gln Lys Glu Gly Lys Lys Val Ile Phe Thr Asn Val Gly Asn Pro

         35                  40                  45

His Ala Leu Gly Gln Lys Pro Leu Thr Phe Pro Arg Gln Val Val Ala

     50                  55                  60

Leu Cys Gln Ala Pro Phe Leu Leu Asp Asp Pro Asn Val Gly Met Leu

65                   70                  75                  80

Phe Pro Ala Asp Ala Ile Ala Arg Ala Lys His Tyr Leu Ser Leu Thr

                 85                  90                  95

Ser Gly Gly Leu Gly Ala Tyr Ser Asp Ser Arg Gly Leu Pro Gly Val

            100                 105                 110

Arg Lys Glu Val Ala Glu Phe Ile Gln Arg Arg Asp Gly Tyr Pro Ser

        115                 120                 125

Asp Pro Glu Leu Ile Phe Leu Thr Asp Gly Ala Ser Lys Gly Val Met

    130                 135                 140

Gln Ile Leu Asn Cys Val Ile Arg Gly Asn Gly Asp Gly Ile Leu Val

145                 150                 155                 160

Pro Val Pro Gln Tyr Pro Leu Tyr Ser Ala Thr Ile Ser Leu Leu Gly

                165                 170                 175

Gly Thr Leu Val Pro Tyr Tyr Leu Asp Glu Ser Glu Asn Trp Gly Leu

            180                 185                 190

Asp Val Ala Asn Leu Arg Gln Ser Val Ala Gln Ala Arg Ser Gln Gly

        195                 200                 205

Ile Thr Val Arg Ala Met Val Ile Ile Asn Pro Gly Asn Pro Thr Gly

    210                 215                 220

Gln Cys Leu Ser Glu Ala Asn Ile Arg Glu Ile Leu Lys Phe Cys Tyr

225                 230                 235                 240

Asn Glu Lys Leu Val Leu Leu Gly Asp Glu Val Tyr Gln Gln Asn Ile

                245                 250                 255

Tyr Gln Asp Glu Arg Pro Phe Ile Ser Ser Lys Lys Val Leu Met Glu

            260                 265                 270

Met Gly Ser Pro Phe Ser Lys Glu Val Gln Leu Val Ser Phe His Thr

        275                 280                 285

Val Ser Lys Gly Tyr Trp Gly Glu Cys Gly Gln Arg Gly Gly Tyr Phe

    290                 295                 300

Glu Met Thr Asn Leu Pro Pro Arg Val Val Glu Glu Ile Tyr Lys Val

305                 310                 315                 320

Ala Ser Ile Ala Leu Ser Pro Asn Val Ser Ala Gln Ile Phe Met Gly

                325                 330                 335

Leu Met Val Asn Pro Pro Lys Pro Gly Asp Ile Ser Tyr Asp Gln Phe

            340                 345                 350

Ala Arg Glu Ser Lys Gly Ile Leu Glu Ser Leu Arg Arg Arg Ala Arg

        355                 360                 365

Leu Met Thr Asp Gly Phe Asn Ser Cys Lys Asn Val Val Cys Asn Phe

    370                 375                 380

Thr Glu Gly Ala Met Tyr Ser Phe Pro Gln Ile Arg Leu Pro Thr Gly

385                 390                 395                 400

Ala Leu Gln Ala Ala Lys Gln Ala Gly Lys Val Pro Asp Val Phe Tyr

                405                 410                 415

Cys Leu Lys Leu Leu Glu Ala Thr Gly Ile Ser Thr Val Pro Gly Ser

            420                 425                 430

Gly Phe Gly Gln Lys Glu Gly Val Phe His Leu Arg Thr Thr Ile Leu

        435                 440                 445

Pro Ala Glu Asp Glu Met Pro Glu Ile Met Asp Ser Phe Lys Lys Phe

    450                 455                 460

Asn Asp Glu Phe Met Thr Gln Tyr Asp Asn Asn Phe Gly Tyr Ser Lys

465                 470                 475                 480

Met

<210>2

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：PCR引物

<400>2

ctctagaacc gaacgtgact ctccag                                  26

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：PCR引物

<400>3

ccatgatctc cggcatctca tcttc                                    25

<210>4

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：PCR引物

<400>4

atcacaaatc aggcacaagg ttagac                                   26

<210>5

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：PCR引物

<400>5

ggagggaaga agtgagctag ggattg                                   26

<210>6

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：PCR引物

<400>6

cgctcatcct ggtatatgtt ctgctg                                   26

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：PCR引物

<400>7

ataacgctgc ggacatctac                                          20

<210>8

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：PCR引物

<400>8

ttagacaagt atctttcgga tgtg                                     24

<210>9

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：PCR引物

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aacgctgcgg acatctacat ttttg                                    25

<210>10

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

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<400>10

gtgggttaat taagaattca gtacattaaa                               30

<210>11

<211>25

<212>DNA

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<220>

<223>人工序列描述：PCR引物

<400>11

aagaaaatgc cgatacttca ttggc                                    25

<210>12

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<223>人工序列描述：PCR引物

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aagaaaatgc cgatacttca ttggc                                     25

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<223>人工序列描述：PCR引物

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tagatccgaa actatcagtg                                          20

<210>14

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：PCR引物

<400>14

acgtgactcc ctttaattct ccgctc                                   26

<210>15

<211>25

<212>DNA

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<223>人工序列描述：PCR引物

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cctaactttt ggtgtgatga tgctg                                    25

<210>16

<211>25

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<400>16

ttcccttaat tctccgctca tgatc                                    25

<210>17

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

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ttcccttaat tctccgctca tgatc                                  25

<210>18

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ttcccttaat tctccgctca tgatc                                  25

<210>19

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：PCR引物

<400>19

gtttcacatc aacattgtgg tcattgg                                27

<210>20

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：PCR引物

<400>20

gagtacttgg gggtagtggc atcc                                   24