一种植物乳杆菌植物亚种及其抗单增李斯特菌细菌素的制备方法

摘要

本发明涉及一种植物乳杆菌植物亚种及其产抗单增李斯特菌细菌素的制备方法，适用于肉与肉制品、乳与乳制品、果蔬、即食食品防腐保鲜中。本发明从福建农贸市场的腊肉中筛选得到植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)Zhang-LL(CGMCCNo.6936)。利用Zhang-LL菌株发酵得到产细菌素的发酵液，采用pH值依赖的吸附-解吸附法、阳离子交换层析法、反相高效液相色谱法提取与纯化Zhang-LL菌株细菌素，效价提高了32倍，纯度提高了36.65倍。该细菌素可抑制单增李斯特菌等多种食源性致病菌，抑菌活性高，对热及酸碱稳定，且被人体蛋白酶降解，是一种天然安全的生物防腐剂。该方法操作简单、稳定、高效，来源方便，成本较低，适于工业化生产。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物领域中一株植物乳杆菌植物亚种及其产抗单增李斯特菌细菌素的制备方法，该细菌素作为天然防腐剂适用于肉与肉制品、乳与乳制品、果蔬、即食食品中，提高食品的安全性。

背景技术

食品在加工、贮藏、运输等过程中，易受到有害微生物的污染而导致腐败变质或食物中毒的发生，采用添加防腐剂来抑制微生物的生长，是防止食品腐败变质的重要手段。研究表明，一些化学防腐剂有致癌性、致畸性和引起食物中毒现象发生，对人体健康影响较大，它的应用越来越受到众多国家的限制。而生物防腐剂是近年来发现的一类新型的天然防腐剂，具有无毒、安全、性能稳定、适用性广等优点，常用的有乳酸链球菌素、纳他霉素、聚赖氨酸、溶菌酶、鱼精蛋白等。

乳酸菌素是某些乳酸菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类具有抑菌生物活性的肽或前体，对革兰氏阳性菌具有较好的选择性抑制生长能力，而且对热及酸碱稳定性较好，可被人体蛋白酶降解等特点，因此乳酸菌素是天然安全的生物防腐剂。乳链菌肽Nisin作为唯一被批准用作食品防腐剂的乳酸菌素，已经在五十多个国家和地区得到广泛应用，然而其在碱性环境下稳定性差和热稳定性差等特点，大大限制了其在食品工业中的应用。因此，研究开发耐酸耐碱的新型的乳酸菌素将是对现有Nisin工业应用局限性的一个极大的弥补。本项目从传统发酵食品中筛选出一株植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL，其所产乳酸菌素对热和酸碱稳定，抑菌谱广，且能被胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K分解，作为食品防腐保鲜剂具有较高安全性和稳定性，具备良好应用前景。因此，建立一种简单、高效的制备生产乳酸菌素的方法尤为重要。目前，纯化细菌素的方法主要有pH吸附法，硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶层析、疏水交换层析、高效液相色谱等。

产生细菌素的菌株众多，但并不是所有的细菌素或其生产菌种都可应用于食品中，只有那些公认安全(Generally Recognized as Safe，GRAS)的菌种产生的细菌素才有应用于食品生产中的可能。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)属于乳杆菌科中的乳杆菌属，革兰氏阳性，厌氧或兼性厌，能分泌合成多种有机酸、酶、生理活性物质等，是人体胃肠道的益生菌群，能够维持肠道内菌群平衡。常存在于发酵蔬菜和果汁中，也广泛应用于发酵肉制品。据中华人民共和国卫生部办公厅于2010年4月22日印发的《可用于食品的菌种名单》(见附件1)，植物乳杆菌是其中明文规定的菌种之一，其为植物乳杆菌植物亚种细菌素作为食品防腐剂提供了可靠依据。

有关植物乳杆菌所产细菌素的专利报道，如中国农业大学申请的“一种植 物乳杆菌及其细菌素发酵和制备方法与用途”，专利申请号为：CN201010528352.6；南京农业大学申请的“一种植物乳杆菌、其细菌素以及培养与分离纯化方法”，申请号为：CN201310470098.2；黑龙江八一农垦大学申请的“一种具有抗菌活性菌素的植物乳杆菌及其应用”，申请号为：CN201410172324.3；东北农业大学申请的“植物乳杆菌及其所产的可抑制革兰氏阴性菌的细菌素”，申请号为：CN200910072654.4；郑州大学申请的“一株植物乳杆菌及其应用”，申请号为：CN201010281481.X。虽然目前国内有关于植物乳杆菌细菌素制备方法的文献和专利，但有关于植物乳杆菌植物亚种细菌素制备方法尚无文献和报道。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种产广谱高效抑菌活性细菌素的植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL。

本发明所提供的乳酸菌是：植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)Zhang-LL，已于2012年12月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为：CGMCC No.6936。

植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)Zhang-LL，分离筛选自福建农贸市场的腊肉制品。

在MRS培养基上，37℃培养2天，植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)Zhang-LL的菌落为乳白色圆形，表面光滑，中间凸起，不透明，边缘整齐，直径约1mm；个体形态呈短杆状，大小0.5×1.33～2.0μm，通常单生，成对或呈短链状排列，不生芽孢，为革兰氏阳性耐氧或微好氧菌。

为了确定植物乳杆菌植物亚种的抑菌特性，对其发酵上清液的抑菌性能进行了测定。测试菌株：单核细胞增生李斯特菌ATCC54003(简称单增李斯特菌)、金黄色葡萄球菌ATCC29243和CMCC26001、肠出血性大肠杆菌O157：H7ATCC43888、大肠埃希氏菌CMCC44110、宋内志贺氏菌ATCC25931、痢疾志贺氏菌CMCC51105、都柏林沙门氏菌CMCC50761、伤寒沙门氏菌CMCC50071、阪崎肠杆菌ATCC29544、枯草芽孢杆菌ACCC10243、铜绿假单胞菌CICC21636、粪肠球菌CICC23658、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖杆菌、瑞士乳杆菌。试验结果表明植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL发酵上清液对粪肠球菌CICC23658、单增李斯特菌ATCC54003、枯草芽孢杆菌ACCC10243、大肠埃希氏菌CMCC44110的生长有较强的抑制作用，其中对单增李斯特菌的抑菌活性达到最高。

上述方法得到的具有抑菌活性的植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL属于本发明保护范围。

本发明的第二个目的是提供一种植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL所产细菌素的提取方法。

(1)植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL按1％接种量于MRS培养基中37℃发酵20h，得到乳酸菌发酵液；

(2)乳酸菌发酵液于80℃恒温水浴处理20min，冷却至室温后用1mol/L NaOH调节pH 6.0，室温振荡60min；

(3)15 000r/min，4℃离心15～20min，收集沉淀菌体，用pH 6.0的5mmol/L的磷酸盐缓冲液洗涤菌体沉淀2次；

(4)将沉淀悬浮在为原体积5％～10％的pH 2.0的100mmol/L NaCl溶液中，4℃搅拌12h；

(5)15 000r/min，4℃离心15～20min，收集上清液，将上清液放入预处理的透析袋于4℃去离子水中透析24h除盐，透析液即为细菌素粗提取液；

(6)细菌素粗提取液于-35℃冷冻24h，利用真空冷冻干燥机于冻干温度-55℃、真空度0.08mBar的条件下，冻干48h至完全干燥状态，得到粗提取样品为白色粉末。

上述的植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL产细菌素的提取方法也属本发明保护范围。

本发明的第三个目的是提供一种简单有效的植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL产细菌素的纯化方法。

(1)将细菌素粗提取样品复溶于无菌蒸馏水，经0.22μm无菌滤膜过滤后，采用SP Sepharose Fast Flow阳离子交换层析法纯化细菌素，层析柱规格为10mm×100mm；上样缓冲液：20mmol/L pH 3.4柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；洗脱液：0.8mol/L NaCl的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；洗脱条件：20％洗脱液等度洗脱20min，20％～100％洗脱液线性梯度洗脱100min；流速：1mL/min，上样量：1mL，自动收集器5mL/管，收集吸光值在280nm处有吸收峰且有抑菌活性的洗脱液。

(2)将有抑菌活性的收集液放入预处理的透析袋中，4℃去离子水中透析24h除盐得到透析液，将透析液进行真空离心浓缩得到细菌素浓缩液。

(3)将浓缩液经0.22um无菌过滤器过滤，采用半制备型反相液相色谱法线性梯度洗脱纯化细菌素，反相制备柱型号为Agilent ZORBAX 300SB-C18，柱规格为9.4mm×250mm，流动相：A液：超纯水+0.1％三氟乙酸(V/V)，B液：乙腈+0.1％三氟乙酸(V/V)；洗脱条件：0.5％B，10min→30％B，10min→30％-90％B，40min；流速4mL/min，上样量1mL，按照1mL/min自动收集洗脱液，验证收集液的抑菌活性，可得细菌素的保留时间为39min。

(4)将洗脱液冷冻干燥，其干燥物即为植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL产细菌素纯品，干燥后的细菌素纯品呈白色粉末状态。

上述的植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL产细菌素纯化方法也属本发明保护范围。

植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)Zhang-LL分 离筛选自福建农贸市场的腊肉制品，其来源可靠安全，产生的细菌素对热和酸碱稳定；具有广谱抑菌效果，尤其对单增李斯特氏菌的生长具有显著抑制作用；可被人体蛋白酶降解，具有应用安全性。本发明利用植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL发酵，采用pH依赖的吸附解吸，阳离子交换层析和反相液相色谱三步法制备细菌素，效价提高了32倍，纯度提高了36.65倍，其方法操作简单、稳定、高效，来源方便，成本较低，适于工业化生产。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为体积分数。

实施例1、具有抑菌活性的乳酸菌菌株Zhang-LL的筛选与鉴定 

1、具有抑菌活性的乳酸菌菌株Zhang-LL的筛选

取研磨过的腊肉制品1g放入9mL无菌生理盐水中，充分振荡20min，制成悬液，10倍梯度稀释成10^-4～10^-7的稀释液，将各稀释度样品悬液涂布在含0.4％溴甲酚紫的MRS选择性培养基上，37℃培养24h后，挑取黄色菌落进行革兰氏染色，转接种于MRS液体培养基中，37℃增菌培养2～3代，离心取发酵上清液，采用牛津杯法，通过观察抑菌圈大小判断菌株是否有抑菌活性。

抑菌活性的测定采用牛津杯法：先将指示菌菌株稀释至10⁷CFU/mL，与加热融化的固体培养基混匀后，倾注约15mL于平皿中，待其凝固后，轻轻放上已灭菌的牛津杯，取100μL乳酸菌菌株发酵上清液加入牛津杯中。于4℃冰箱扩散4h后，置于37℃温箱中培养12h，观察抑菌圈的出现，用游标卡尺测定抑菌圈直径，读数精确至0.01mm，结果见表1。

表1 乳酸菌菌株Zhang-LL抑菌性能的试验结果

注：牛津杯直径为6.00mm。

由表1可见，乳酸菌菌株Zhang-LL的发酵上清液对粪肠球菌、单增李斯特菌、枯草芽孢杆菌、阪崎肠杆菌、大肠埃希氏菌的生长有抑制作用，其中对单增李斯特菌的抑菌活性最强，因此以单增李斯特菌作为后期抑菌试验的指示菌。

2、具有抑菌活性的乳酸菌菌株Zhang-LL的鉴定

乳酸菌菌株Zhang-LL的鉴定委托中国工业微生物菌种保藏管理中心，通过形态学观察、16s rDNA和pheS基因序列分析，乳酸菌菌株Zhang-LL被鉴定为植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)。

3、植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL所产抑菌活性物质的确定

乳酸菌能抑制食品中的腐败菌和致病菌，其抑菌物质主要是其代谢产物，如酸、过氧化氢、细菌素、双乙酰等。因此，在细菌素产生菌的筛选中需要排除这些干扰因素，并初步确定其抑菌物质是蛋白类物质。将初筛获得的具有抑菌活性的植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL的发酵上清液调pH至中性，以排除发酵上清液中的酸对于抗单增李斯特菌活性的干扰；发酵上清液用过氧化氢酶处理，以验证发酵上清液中的抑菌物质是否是过氧化氢；发酵上清液用蛋白酶K处理，以验证发酵上清液中的抑菌物质是否可被蛋白酶降解。采用牛津杯法做抑菌试验，同时以未做任何处理的发酵上清液作为空白对照，试验结果见表2。

表2 植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL所产抑菌活性物质的性能

注：牛津杯直径为6.00mm。

由表2试验结果表明，植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL发酵上清液在排除酸和过氧化氢的干扰后，其抑菌活性依然存在；而经过胃蛋白酶、蛋白酶K和胰蛋白酶处理后，其抑菌活性完全丧失，说明其抑菌物质为蛋白类物质。结合细菌素的定义，确定植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL发酵上清液中的抑菌活性物质为细菌素，且该细菌素可被人体蛋白酶降解，表明其具有应用安全性。

4、植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL产细菌素的部分理化特征

(1)酸碱稳定性将植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL发酵上清液用1mol/L NaOH和1mol/L HCl调节pH为2.00、4.00、6.00、8.00、10.00、12.00，37℃水浴2h，再统一调回pH至中性(pH 7.00)，测定其抑菌活性，试验结果见表3。

表3 细菌素的酸碱稳定性

注：牛津杯直径为6.00mm。

由表3试验结果表明，植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL发酵上清液在pH 2～8范围内，抑菌圈直径均在19mm以上，且抑菌活性保持稳定，大多数食品的pH在5～6.5在之间，因此该细菌素作为防腐剂应用到食品中，无需担心酸碱稳定性问题。

(2)热稳定性将植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL发酵上清液pH值调至7.0，分别经60℃处理10min、30min、90min，100℃处理10min、30min、90min，121℃处理15min，以未加热处理的发酵上清液为空白对照，测定其抗单增李斯特菌活性，试验结果见表4。

表4 细菌素的热稳定性

注：牛津杯直径为6.00mm。

由表4试验结果表明，同空白对照组相比，100℃处理30min后植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL发酵上清液的抑菌活性依然保持较稳定，因此该细菌素应用到食品中，食品热杀菌技术不会对其抗单增李斯特菌活性造成影响。

实施例2、植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL细菌素的提取 

1、细菌素的发酵工艺条件

用于培养植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL产细菌素的培养基成分(w/v)：胰蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母浸粉0.5％，柠檬酸三铵0.2％，葡萄糖2％，吐温-800.1％，乙酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸镁0.05％，硫酸锰0.025％，pH 6.5～7.0，121℃灭菌20min。

产细菌素的发酵工艺条件：发酵温度37℃，发酵时间20h，培养基的初始pH 6.5，接种量1％。

2、发酵液中细菌素的提取

(1)细菌素对产生菌细胞的吸附作用通过试验测定细菌素对产生菌细胞的吸附特性，上述发酵条件下得到的乳酸菌发酵液平均分为8份，其中1份为对照，4℃，15 000r/min离心15～20min，取发酵上清液；其余七份分别调pH至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，室温缓慢振荡2h，4℃，15 000r/min离心15～20min，离心后的沉淀即为吸附细菌素的产生菌细胞，离心后的上清即为未被细胞吸附的细菌素溶液。将所有上清液调节pH 7.0排除有机酸作用，测定对照乳酸菌发酵上清液和不同pH条件吸附后上清液的植物乳杆菌素活力，并计算吸附率，结果见表5。

吸附率的计算公式为：

吸附率＝(对照上清的效价值-吸附后上清的效价值)/对照上清的效价AU值

表5 细菌素对产生菌的吸附作用

注：牛津杯直径为6.00mm。

由表5试验结果可知，在pH 2.0时，细菌素对产生菌的吸附率为0，即不吸附在产生菌细胞表面，在pH 6.0时细菌素对产生菌细胞的吸附率最高为87.5％，因此可以确定植物乳杆菌素Zhang-LL采用pH依赖的吸附法时吸附和解吸的最适pH分别为6.0和2.0。

(2)细菌素的提取将在上述发酵条件下得到的乳酸菌发酵液于80℃恒温水浴处理20min，冷却至室温后用1mol/L NaOH调节pH 6.0，室温振荡30min，以15 000r/min，4℃离心15～20min，收集沉淀菌体，用5mmol/L pH6.0的磷酸盐缓冲液洗涤菌体沉淀数次(条件同上)，将沉淀悬浮在为原体积5％～10％的100 mmol/L NaCl(pH 2.0)溶液中，4℃搅拌12h，以15 000r/min，4℃离心15～20min，收集上清液，将收集的上清液放入预处理的透析袋于4℃去离子水中透析24h除盐，透析液于-35℃冷冻，以备干燥；利用真空冷冻干燥机于冻干温度-55℃、真空度0.08mBar的条件下，冻干48h至完全干燥状态，得到粗提取样品为白色粉末。上述采用pH依赖的吸附-解吸附作用，解决了常规硫酸铵沉淀法提取蛋白质引入的培养基颜色干扰问题。

(3)细菌素效价分析细菌素效价值的确定：将待测样连续二倍稀释，采用牛津杯法测定样液中细菌素的抑菌活力。活力用每毫升的活力单位(AU)表示。AU的定义是能看到明显的抑菌圈的最高稀释度(n)的倒数。

由二倍系列稀释法确定了植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL细菌素的培养20h离心上清液的效价为40AU/mL，通过pH依赖的吸附-解吸法提取的细菌素提取液的效价为640AU/mL。

实施例3、植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL细菌素纯化方法

1、植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL细菌素的纯化方法

(1)阳离子交换层析法初步纯化细菌素将细菌素粗提取样品复溶于无菌蒸馏水，经0.22μm无菌滤膜过滤后，采用SP Sepharose Fast Flow阳离子交换层析法纯化细菌素，层析柱规格为10mm×100mm；上样缓冲液：20mmol/L pH3.4柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；洗脱液：0.8mol/L NaCl的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；洗脱条件：20％洗脱液等度洗脱20min，20％～100％洗脱液线性梯度洗脱100min；流速：1mL/min，上样量：1mL，自动收集器5mL/管，收集吸光值在280nm处有吸收峰且有抑菌活性的洗脱液；将有抑菌活性的收集液放入预处理的透析袋中，4℃去离子水中透析24h除盐得到透析液，将透析液进行真空离心浓缩得到细菌素浓缩液。

(2)反相液相色谱法进一步纯化细菌素将浓缩液经0.22um无菌过滤器过滤，采用半制备型反相液相色谱法线性梯度洗脱纯化细菌素，反相制备柱型号为Agilent ZORBAX 300SB-C18，柱规格为9.4mm×250mm，流动相：A液：超纯水+0.1％三氟乙酸(V/V)，B液：乙腈+0.1％三氟乙酸(V/V)；洗脱条件：5％B，10min→5％-30％B，10min→30％-90％B，40min；流速1mL/min，上样量1mL，按照1mL/min自动收集洗脱液，验证收集液的抑菌活性，可得细菌素的保留时间为39min；将洗脱液冷冻干燥，其干燥物即为植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL产细菌素纯品，干燥后的细菌素纯品呈白色粉末状态。

2、细菌素纯化效果评价

总蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝G-250染色法：

考马斯亮蓝G-250：100mg溶于50mL 95％乙醇中，加入100mL 85％磷酸，用蒸馏水稀释至1 000mL，滤纸过滤，最终试剂中含0.01％(w/v)考马斯亮蓝G-250，4.7％(w/v)乙醇；

结晶牛血清蛋白：预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15％NaCl配制成1mg/mL，0.1mg/mL蛋白溶液；

分7组按照表5中的添加量取样，将样品混匀后放置2min，测定波长595nm下的吸光值，每组3个平行。以A_595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线；测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A_595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)，标准曲线参数表见表6。

表6 考马斯亮蓝法测蛋白含量标准曲线参数表

采用考马斯亮蓝法测得的牛血清白蛋白(BSA)蛋白质标准曲线所得的公式为：y＝0.095x+0.013，R²值达到0.995，说明本标准曲线的线性程度较高，可作为蛋白质浓度测定的标准曲线。

通过测定不同分离纯化阶段细菌素含量、效价值，对其纯化效果进行评价，结果见表7。

表7 细菌素纯化效果的评价

由表7表明，纯化后细菌素的比活力提高至5289.25U/mg，纯化倍数为36.65倍，效价提高32倍，由此显示采用简单快速的纯化步骤即可有效地达到纯化目的。

综上所述，分离筛选自福建农贸市场的腊肉制品的植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)Zhang-LL，其来源可靠安全，产生的细菌素对热和酸碱稳定；具有广谱抑菌效果，尤其对单增李斯特氏菌的生长具 有显著抑制作用；可被人体蛋白酶降解，具有应用安全性。本发明利用植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL发酵，采用pH依赖的吸附解吸，阳离子交换层析和反相液相色谱三步法制备细菌素，效价提高了32倍，纯度提高了36.65倍，其方法操作简单、稳定、高效，来源方便，成本较低，适于工业化生产。

本专利所属项目1：科技部“十二五”国家高技术研究发展计划(863)项目子课题“食品生物危害精准检测与控制技术研究”子课题“畜产品病原菌安全控制技术”

项目编号：2012AA101606-05

项目起止时间：2012.01-2015.12

项目负责人：张红星

本专利所属项目2：北京市属高等学校高层次人才引进与培养计划项目“天然乳酸菌素对畜产品中重要致病菌的抑菌机制及作用研究”。

项目编号：CIT&TCD20140315

项目起止时间：2014.01-2016.12

项目负责人：张红星

本专利所属项目3：科技部国家科技重大专项“抗病转基因羊新品种培育”子课题“抗病转基因羊扩繁体系的建立/抗病转基因羊抗病、生产性能及安全评价”

项目编号：2013ZX08008-005

项目起止时间：2013.01-2013.12

项目负责人：刘慧。